耿 磊，張國強，倪 明，任 鵬，劉 浩，孫菁陽，鄭清源，程 龍，黃靖香

（中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853）

現(xiàn)代戰(zhàn)爭中槍彈傷占64.4%，爆炸傷占34.4%［1］，爆炸傷容易造成開放傷，常致軟組織缺損、失血及創(chuàng)口感染。失血和感染是導(dǎo)致開放傷嚴(yán)重結(jié)局的重要因素。因此止血、抗感染是戰(zhàn)場急救和后送要重點關(guān)切和解決的問題。一般來講，在戰(zhàn)場上處理開放傷的重要環(huán)節(jié)應(yīng)包括傷口清洗、迅速止血、傷口敷料包扎、合理固定肢體及后送。本研究致力于改進傷口敷料的性能，這一環(huán)節(jié)要求繼續(xù)鞏固止血，并達到止痛，抗菌的效果。

研究較多的止血藥物包括氨甲環(huán)酸、凝血酶原、殼聚糖等［2，3］，局部止痛的藥物也較多，如利多卡因、羅哌卡因等。用于傷口表面抗感染的常用藥物包括氧氟沙星、左氧氟殺星、納米銀等［4］。對于傷口包扎這一戰(zhàn)創(chuàng)傷處理環(huán)節(jié)，本研究遴選出療效確切的藥物并通過可以緩釋藥物的載體，將這些藥物有機的結(jié)合在一起。已知可生物降解的高分子聚合物可以作為藥物緩釋載體的有殼聚糖、聚乙烯醇、聚已酸內(nèi)酯、聚乳酸羥基乳酸等［5～8］。殼聚糖/聚乙烯醇載藥復(fù)合敷料的制備和性能已有較多研究，其載體的生物相容性較好，藥物的體外釋放和體內(nèi)療效均得到較多基礎(chǔ)實驗的驗證［9］。但目前多數(shù)研究是載有一種藥物，本實驗研究了殼聚糖/聚乙烯醇載多種藥物的制備以及對開放戰(zhàn)創(chuàng)傷兔模型的療效，采用了目前應(yīng)用較多、較為成熟的靜電紡絲技術(shù)［9］，對戰(zhàn)創(chuàng)傷急救敷料的研制是一次改進。

1 材料與方法

1.1 載藥敷料的制備

將殼聚糖（10萬分子量）溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的醋酸溶液中制備成殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的溶液,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%聚乙烯醇蒸餾水溶液，mCS/mPVA為4/6。再加入氨甲環(huán)酸、羅哌卡因以及納米銀，此三種藥物按照質(zhì)量等比配比，總質(zhì)量為混合溶液質(zhì)量的2%～5%，在25 kV靜電壓，0.77 mm的噴絲孔，噴絲口距接收板為10 cm的條件下通過靜電紡絲制備纖維膜，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%的戊二醛溶液中進行交聯(lián)1 h后在通風(fēng)箱內(nèi)干燥24 h。

1.2 實驗動物分組

成年健康日本大耳白兔16只，雌雄不限，體質(zhì)量（3.05±0.41）kg，由解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。進行隨機分組，每只大耳白兔有一編號，隨機分組編號由電腦生成，由實驗人員分別裝入封閉信封，需要實施治療時打開。

1.3 模型制備與創(chuàng)面處理

選擇大耳白兔16只，將其右下肢廣泛備皮，在右大腿外側(cè)造成人工創(chuàng)面，創(chuàng)面形狀為圓形，直徑為2 cm，圓形內(nèi)部切除0.5 cm深的組織，切除的組織包括皮膚、皮下及肌肉組織。創(chuàng)面給予泥沙污染靜置3 h后進行清創(chuàng)術(shù)。新型敷料組給予新型敷料并包扎，每2 d更換一次新型敷料，傳統(tǒng)敷料組給予無菌紗布包扎，每2 d換藥一次，用碘伏消毒傷口。

1.4 評估方法

1.4.1 載藥敷料體外藥物釋放測定方法

通過分光光度法測定載藥殼聚糖/聚乙烯醇纖維膜在生理鹽水中體外釋放氨甲環(huán)酸、羅哌卡因及納米銀的濃度［10］。分別取一定量氨甲環(huán)酸、羅哌卡因及納米銀，分別將其完全溶解在蒸餾水中，配置成0.1 mg/L的溶液，取蒸餾水作為空白溶液，使用紫外分光光度計進行掃描，分別測出三種藥物的最大吸收峰波長，通過藥物不同濃度與對應(yīng)吸光度的數(shù)值計算出藥物濃度與吸光度的線性方程。通過此方程檢測載藥殼聚糖/聚乙烯醇纖維膜在生理鹽水中體外釋放氨甲環(huán)酸、羅哌卡因及納米銀的濃度與時間的關(guān)系，通過藥物濃度求出特定時間點的累積釋放率，計算公式為：藥物累積釋放率=藥物濃度×溶液體積/藥物總質(zhì)量。

1.4.2 出血量評估

術(shù)前及術(shù)后第1 d抽取兔耳靜脈血1 ml，查紅細胞比容，血紅蛋白，通過體重估計兔血容量［11］，計算總失血量?？偸а坑嬎愎剑嚎偸а浚╟alculated total blood loss,CBL）=（術(shù)前紅細胞比容-術(shù)后紅細胞比容）×兔血容量/術(shù)前紅細胞比容[12]。兔血容量（blood volume,BV）的計算公式為：BV=55.6×體重 （ml）[11]。

1.4.3 兔疼痛評分

通過兔的行為學(xué)對兔疼痛程度進行量化評估，觀察的主要行為學(xué)包括：（1）患肢正常著地；（2）患肢輕著地，伴趾前屈；（3）僅足內(nèi)側(cè)緣著地；（4）僅足跟著地，后足倒置；（5）整個患肢抬起；（6）舔食患肢。30 min內(nèi)觀察3次，每次300 s，然后按照公式計算疼痛指數(shù)T=（t1+2t2+3t3+4t4+5t5）/300 s，其中t1，t2，t3，t4，t5分別代表 5 min 內(nèi)上對應(yīng)行為的持續(xù)時間［13］。3次評分取平均數(shù)。術(shù)后第1 d、1周對疼痛進行評分。

1.4.4 感染指標(biāo)測量

術(shù)后1、3 d抽兔耳靜脈血檢測C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）。術(shù)后1、3 d取傷口組織做組織病理切片，計算5個多形核粒細胞（polymorphonuclear granulocytes,PMN）最多的高倍鏡視野中的平均值。傷口愈合速度測量：計算創(chuàng)口完全愈合需要的時間，比較兩組平均值是否有差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，資料呈正態(tài)分布時，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)兩時間點比較采用配對T檢驗；資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載藥敷料體外藥物釋放結(jié)果

測得氨甲環(huán)酸、羅哌卡因、納米銀的吸收峰波長為466 nm、262 nm、408 nm，通過濃度計算出藥物累積釋放度，并繪制曲線圖，見圖1。通過曲線圖可以看出累積釋放量達到50%時需要大約12 h，而20 h時達到釋放平衡。

圖1 氨甲環(huán)酸、羅哌卡因、納米銀在體外的藥物緩釋曲線

2.2 出血量評估

通過術(shù)前術(shù)后1 d抽取靜脈血檢測紅細胞比容，計算出了每只兔的總失血量，新型敷料組的平均失血量顯著少于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），資料見表1。

2.3 兔疼痛評分

術(shù)后第1 d疼痛指數(shù)新型敷料組顯著低于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后第7 d，兩組疼痛指數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。資料見表1。

2.4 感染指標(biāo)測量

術(shù)后第1 d新型敷料組CRP低于傳統(tǒng)敷料組，但兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第3 d新型敷料組CRP明顯低于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），顯示新型CRP敷料的抗感染能力強，能更早將兔CRP降至趨于正常。術(shù)后第1 d兩組PMN差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而術(shù)后第3 d新型敷料組顯著低于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），資料見表 1。

2.5 傷口愈合速度測量

傷口愈合時間新型敷料組少于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。資料見表1。

表1 兩組動物觀察及檢測結(jié)果（±s）與比較

傳統(tǒng)敷料組（n=8）2 5.4 3±2.0 2 P值＜0.0 0 1新型敷料組（n=8）1 5.2 0±1.4 3 0.4 7±0.2 1 0.0 5±0.0 3＜0.0 0 1 1.9 6±0.5 7 0.0 6±0.0 3＜0.0 0 1＜0.0 0 1 0.5 4 7 1 4.6 3±3.1 6 8.8 8±3.5 2 0.0 0 4 1 6.7 5±3.1 1 1 3.2 5±2.9 6 0.0 3 7 0.1 9 6 0.0 1 8指標(biāo)總失血量（m l）疼痛指數(shù)1 d 7 d P值C R P（m g/L）1 d 3 d P值P M N（個/高倍視野）1 d 3 d P值傷口愈合時間（d）2 1.6 3±5.3 2 2.8 8±1.2 5＜0.0 0 1 1 2.2 5±0.7 1 2 0.6 3±5.4 8 1 2.8 8±2.1 0 0.0 0 2 1 4.1 3±1.6 4 0.7 1 7＜0.0 0 1 0.0 1 4

3 討論

殼聚糖作為天然的高分子材料，生物相容性較好，其本身具有止血、抗菌的功效。單用殼聚糖進行電紡絲難以紡出纖維結(jié)構(gòu)，電鏡下觀察為水滴樣結(jié)構(gòu)，因此單用殼聚糖進行電紡絲其力學(xué)強度很差。有學(xué)者將聚乙烯醇加入殼聚糖按一定的比例混合進行電紡絲，發(fā)現(xiàn)可以紡出具有纖維結(jié)構(gòu)的纖維膜［14～16］，而且有學(xué)者已經(jīng)成功將殼聚糖、聚乙烯醇和藥物共紡成纖維膜，該膜的力學(xué)強度較好，而且可以對藥物進行緩釋［17］，因此殼聚糖、聚乙烯醇作為藥物緩釋的載體具有優(yōu)質(zhì)的潛能。

良好的局部給藥的止血藥物要同時具有止血效果可靠、無全身不良反應(yīng)的特點。骨科臨床上經(jīng)常用的藥物為氨甲環(huán)酸，有一項薈萃分析顯示氨甲環(huán)酸局部給藥和靜脈給藥均有明顯的止血療效，且局部給藥可能要優(yōu)于靜脈給藥［18］。

常用的局部止痛藥包括利多卡因、羅哌卡因等。一項研究對比了局部應(yīng)用羅哌卡因和利多卡因?qū)Ρ巢堪X癰術(shù)后疼痛的止痛效果，結(jié)果顯示羅哌卡因的止痛效果要優(yōu)于利多卡因［19］。羅哌卡因局部應(yīng)用主要利用其麻醉效果，單純止痛，不會產(chǎn)生其他的副作用，因此是比較可靠的局部傷口的外用止痛藥物。

戰(zhàn)創(chuàng)傷創(chuàng)口感染的主要常見致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌［20］，因此很難用單一的抗生素同時對抗這三種細菌，如果選擇某種或幾種特定的抗生素，也會遇到細菌耐藥的情況的發(fā)生。納米銀具有較強的抗菌效果，而且至今沒有發(fā)現(xiàn)針對銀的細菌耐藥性，因此銀相關(guān)的局部給藥復(fù)合材料具有廣闊的應(yīng)用前景。多項研究采用銀相關(guān)藥物復(fù)合材料對體外抗菌能力以及對局部創(chuàng)口的抗感染性能進行了研究，結(jié)果顯示其抗菌性能優(yōu)越。而且局部少量應(yīng)用銀制劑，對全身不會造成毒副作用［21，22］。

目前同類型的傷口敷料一般采用高分子聚合物作為載體，一般載入一種藥物。本研究結(jié)果顯示，新型敷料組的平均失血量顯著少于傳統(tǒng)敷料組，術(shù)后第1天疼痛指數(shù)顯著低于傳統(tǒng)敷料組、傷口愈合時間少于照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后第3 d新型敷料組CRP、PMN明顯低于傳統(tǒng)敷料組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明，新型敷料可以顯著減少兔開放傷失血量，對創(chuàng)口有明顯的止痛作用，抗感染能力更強，能更早地將兔CRP降至趨于正常，更早地將兔創(chuàng)口組織的炎細胞降至趨于正常，能夠促進傷口的愈合速度。新型敷料采用殼聚糖/聚乙烯醇作為載體，利用靜電紡絲技術(shù)，將氨甲環(huán)酸、羅哌卡因及納米銀共混編織成纖維結(jié)構(gòu)，具有可靠而穩(wěn)定的藥物緩釋性能，集止血、止痛劑抗菌性能于一身，具有便捷性和高效性，符合現(xiàn)在戰(zhàn)爭戰(zhàn)創(chuàng)傷急救的要求。這種復(fù)合藥物模式還可以進一步改進，可加入其他藥物，融合進其他的功能，如表皮生長因子等促進傷口愈合的藥物。

結(jié)論：載氨甲環(huán)酸、羅哌卡因及納米銀的殼聚糖/聚乙烯醇靜電紡絲纖維緩釋敷料可穩(wěn)定緩釋藥物，并對兔戰(zhàn)創(chuàng)傷模型具有止血、止痛、抗感染及促進傷口愈合的作用。