王 倩， 呂 芹， 卞 華

(1.南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 南陽 473004； 2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院 河南 南陽 473004； 3.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 河南 南陽 473061)

系統(tǒng)性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一種病因不明的復(fù)雜結(jié)締組織疾病，具有多器官受累和異質(zhì)性臨床表現(xiàn)。該病的發(fā)生發(fā)展主要表現(xiàn)為3個(gè)典型的病理過程：自身免疫異常，血管損傷和纖維化。這3個(gè)病理過程并不是相互獨(dú)立的，目前認(rèn)為疾病發(fā)展早期是以微血管損傷和炎癥等病理改變?yōu)槭紕?dòng)因素，其中微血管損傷誘導(dǎo)的炎癥和自身免疫反應(yīng)直接或間接刺激成纖維細(xì)胞的活化，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[1]。截至目前，臨床上對(duì)于SSc的西醫(yī)治療方案主要是運(yùn)用環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺，以及抗TGF-β等抗體來調(diào)節(jié)免疫異常、改善微循環(huán)和抑制纖維化[2]。但是，長(zhǎng)期服用這些藥物所帶來的副作用以及巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，使得患者牢騷滿腹。與此同時(shí)，中醫(yī)藥在SSc的治療中顯示出令人驚喜的潛力。本課題組經(jīng)過十多年的臨床實(shí)踐和基礎(chǔ)研究，提出根據(jù)“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論治療SSc的新思路，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制溫陽化濁通絡(luò)方。本文就溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的研究進(jìn)展作出闡述。

1 溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的理論基礎(chǔ)

中醫(yī)典籍無SSc的相關(guān)記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，SSc類似于中醫(yī)之“皮痹”?！吨T病源候論》表述曰：“風(fēng)濕痹痛之狀，或皮膚頑厚，或肌肉酸痛……。此證由于素體氣血虛弱，衛(wèi)外不固，腠里不密，外感六淫之邪……，而成痹阻，致發(fā)熱關(guān)節(jié)酸痛，皮膚受損，則腫厚蒼白而為皮痹?！薄秼D人大全良方》認(rèn)為：“脾肺氣虛，肌膚不仁，手足麻木?！薄豆沤駡D書集成醫(yī)部全錄卷二十》曰：“肺主秋，亦主皮，肺氣衰則三氣入皮，故名之曰皮痹”?！杜R證指南醫(yī)案》曰：“痹者，……皆由氣血虧損，腠理疏豁，風(fēng)寒濕三氣得以乘虛外襲，留滯于內(nèi)以致濕痰、濁血流注凝澀而得之”。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，肺與皮毛相表里，兩者相互影響，疾病也會(huì)相互傳變。另外，脾為后天之主，運(yùn)化津液，充于皮膚。腎為先天之主，“西方生燥，燥生金，金生辛，辛生肺，肺生皮毛，皮毛生腎”，“皮毛潤(rùn)澤則又能生養(yǎng)于腎”。由此可知，皮痹之疾雖在皮毛，但其病因與肺脾腎密切相關(guān)。其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛是肺脾腎之陽氣虛；標(biāo)實(shí)是濁邪痰瘀，阻滯脈絡(luò)。因此，根據(jù)“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論，我們以溫補(bǔ)肺脾腎之陽、化濁通絡(luò)為原則，創(chuàng)制溫陽化濁通絡(luò)方(藥物組成：黃芪、黨參、淫羊藿、桂枝、積雪草、白芥子等)。其中，黃芪補(bǔ)氣固表，黨參補(bǔ)脾肺之氣，淫羊藿補(bǔ)腎陽，祛風(fēng)濕，三者共為君藥；積雪草活血化瘀，白芥子溫通經(jīng)絡(luò)，去除濁邪，共為臣藥；桂枝等辛溫通絡(luò)是屬佐使之用。

2 溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的臨床研究

基于“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論的溫陽化濁通絡(luò)方已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療SSc，并顯示出令人滿意的治療效果。臨床研究結(jié)果顯示，溫陽化濁通絡(luò)方能夠顯著改善SSc患者的皮膚積分、疾病活動(dòng)指數(shù)、關(guān)節(jié)功能積分、握力、齒距、指距，降低雷諾現(xiàn)象的發(fā)生次數(shù)，明顯改善FVC、DLco等肺功能指標(biāo)[3,4]。經(jīng)溫陽化濁通絡(luò)方治療后，SSc患者血IgG、ESR均明顯下降[5]。另外，溫陽化濁通絡(luò)方還提高了SSc患者對(duì)強(qiáng)的松、青霉胺的耐受性，減輕其西醫(yī)治療的副作用[3]。這些研究結(jié)果表明，溫陽化濁通絡(luò)方能夠顯著改善SSc患者的生理機(jī)能、精神健康，提高患者生存質(zhì)量。

3 溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

我們通過系列臨床研究已經(jīng)證實(shí)了溫陽化濁通絡(luò)方對(duì)于SSc具有良好的治療效果。中藥復(fù)方在疾病治療中能夠同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)，這也是中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)之處。但是，由于其成分復(fù)雜，也造成了中醫(yī)藥治療疾病的作用機(jī)制很難徹底明晰。因此，開展中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，分離中藥的有效部位或有效成分，既有助于理解中藥發(fā)揮作用的機(jī)制，又能夠在此基礎(chǔ)上對(duì)中藥進(jìn)行優(yōu)化，保留有效成分的同時(shí)剔除有害物質(zhì)。在本課題組既往研究中，我們制備了溫陽化濁通絡(luò)方的水溶性部位、正丁醇部位、乙醚部位、乙醇部位、乙酸乙酯部位的不同溶劑提取物，通過小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)模型分別探討其對(duì)SSc的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，溫陽化濁通絡(luò)方的水溶性部位和正丁醇部位能夠顯著抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，同時(shí)顯著改善DTH小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)[6]。因此，溫陽化濁通絡(luò)方對(duì)于SSc的免疫調(diào)節(jié)作用可能是其水溶性部位和正丁醇部位。

4 溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的作用機(jī)制

前期，本課題組通過離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型相結(jié)合，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等技術(shù)揭示了溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc主要是通過以下4種作用機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。

4.1 調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞失衡和B細(xì)胞活化

長(zhǎng)期以來，SSc已經(jīng)被證實(shí)在發(fā)病過程中存在先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的異常，包括受累組織的慢性單核細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子表達(dá)水平的失調(diào)以及自身抗體的產(chǎn)生。組織學(xué)研究表明，在 SSc 的早期階段，血管周圍炎癥浸潤(rùn)伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞損傷，炎癥滲出的主要細(xì)胞為巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。在眾多的T細(xì)胞類型中，輔助性 T細(xì)胞 17 (T help cell 17，Th17) 和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞( regulatory T cells，Treg)與SSc發(fā)病的相關(guān)性最為密切[7]。Th17 細(xì)胞與 Treg 細(xì)胞的功能表現(xiàn)為相互拮抗，在正常人體內(nèi)兩者保持動(dòng)態(tài)平衡，維持著正常的免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究已經(jīng)證實(shí)，Th17/Treg細(xì)胞失衡是SSc發(fā)病的關(guān)鍵因素[8]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型(DTH)中，溫陽化濁通絡(luò)方能夠明顯減輕 DTH 小鼠耳腫脹、降低小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，抑制 T、B 淋巴細(xì)胞增殖[6]。另外，還發(fā)現(xiàn) SSc 患者外周血中 Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 比值，以及血清IL17 的含量均高于健康人群，而 Treg細(xì)胞比例，以及血清 IL10 的含量低于健康人群。通過給予溫陽化濁通絡(luò)方治療，能夠顯著降低SSc 患者的 Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg比值，以及血清 IL17 的含量，同時(shí)上調(diào) Treg 細(xì)胞比例，以及血清IL10 的含量[9,10]。在體外實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步研究表明，溫陽化濁通絡(luò)方抑制 Th17 細(xì)胞增殖的作用機(jī)制和miR-155/IL-6/IL-6R通路以及JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)[10,11]。這些研究結(jié)果表明溫陽化濁通絡(luò)方能夠通過調(diào)節(jié) SSc 患者 Th17/Treg 細(xì)胞失衡而發(fā)揮治療作用。

此外，在SSc患者和動(dòng)物模型中，均發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)存在異常，其激活標(biāo)記物，如CD80、CD95、HLA-DR、B 細(xì)胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)，在某些 B 細(xì)胞亞群(主要是記憶 B 細(xì)胞)和患者血液中表達(dá)上調(diào)[12]。在功能上，B淋巴細(xì)胞同T淋巴細(xì)胞一樣，兩者共同維持著機(jī)體正常的免疫耐受。因此，SSc患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的異?；罨c其自身免疫異常的形成密切相關(guān)。另外，B淋巴細(xì)胞還是 TGF-β 的來源并表達(dá) TGF-β 的受體，而TGF-β是導(dǎo)致SSc纖維化形成的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一[13]。本課題組的既往研究結(jié)果顯示溫陽化濁通絡(luò)方能夠抑制血清BAFF水平，進(jìn)而降低SSc患者皮膚積分和疾病活動(dòng)指數(shù)[5]，表明溫陽化濁通絡(luò)方能夠通過調(diào)控B細(xì)胞活性，發(fā)揮治療SSc的作用。

4.2 抑制成纖維細(xì)胞的激活和增殖

纖維化可在 SSc 的早期和晚期發(fā)生，幾乎可以發(fā)生在 SSc 的所有器官中，但在皮膚、肺、心臟和胃腸道中最為突出。纖維化過程依賴于成纖維細(xì)胞的過度活化、重編程和正常穩(wěn)態(tài)特性的喪失，導(dǎo)致它們?cè)谕庵芙M織中轉(zhuǎn)化為增殖和代謝活躍的肌成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的異常激活并轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞是纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-1蛋白和人皮膚成纖維細(xì)胞共同孵育，能明顯增加成纖維細(xì)胞 α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)，刺激Ⅱ型膠原釋放，表明Wnt-1能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[15]。本課題組的既往研究顯示，溫陽化濁通絡(luò)方能夠顯著抑制Wnt-1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)水平，并且抑制其遷移能力[16]，表明溫陽化濁通絡(luò)方能夠抑制成纖維細(xì)胞的激活，進(jìn)而發(fā)揮抑制SSc纖維化的作用。

纖維化除了與成纖維細(xì)胞的過度活化相關(guān)之外，SSc患者皮膚、肺、心臟和其他器官的組織學(xué)研究顯示成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明成纖維細(xì)胞的增殖與SSc纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[17]。因此，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和激活是治療SSc的策略之一。本課題組既往研究結(jié)果顯示溫陽化濁通絡(luò)方能夠阻止有絲分裂的成纖維細(xì)胞從G0期進(jìn)入S和G2/M期[18]，表明溫陽化濁通絡(luò)方能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制成纖維細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，溫陽化濁通絡(luò)方抑制成纖維細(xì)胞cyclin D1和survivin的表達(dá)水平，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)[19]。

4.3 調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)主要由不同的膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型)、糖胺聚糖(例如透明質(zhì)酸)、多糖和糖蛋白(例如纖連蛋白、多功能聚糖、雙糖蛋白聚糖、核心蛋白聚糖)組成。研究表明，SSc纖維化的發(fā)生發(fā)展與ECM的代謝密切相關(guān)，其機(jī)制主要為ECM生成和降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破，造成降解不足而合成相對(duì)過多，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[20]。成纖維細(xì)胞目前被公認(rèn)為是ECM的主要來源細(xì)胞，正常情況下的成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，而SSc患者成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯增多，同時(shí)功能也存在過度活化現(xiàn)象。因此，數(shù)量過多和功能亢進(jìn)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了過量的ECM，最終導(dǎo)致了SSc纖維化的發(fā)生，故而抑制ECM的生成也是SSc治療的策略之一。上述已經(jīng)提到溫陽化濁通絡(luò)方能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖和激活，因此，我們可以推斷溫陽化濁通絡(luò)方能夠通過抑制ECM的生成發(fā)揮抗SSc纖維化的作用。這個(gè)推斷也已經(jīng)被我們的研究所證實(shí)，SSc動(dòng)物模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示溫陽化濁通絡(luò)方能夠抑制成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白的生成，改善SSc皮膚纖維化[21-23]。另外，我們的研究結(jié)果還揭示了溫陽化濁通絡(luò)方對(duì)膠原蛋白、纖連蛋白等ECM生成的調(diào)控是通過抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)，TGF-β1/smad信號(hào)通路以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的[22,24-26]。

溫陽化濁通絡(luò)方除了抑制ECM的生成之外，還能夠調(diào)控ECM的降解。正常情況下，ECM的生成和降解存在動(dòng)態(tài)平衡，這是器官正常發(fā)育和修復(fù)的關(guān)鍵。ECM的降解主要是由金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)蛋白家族負(fù)責(zé)，其家族成員包括20多種。MMP 是鋅依賴性內(nèi)肽酶，能夠降解 ECM 的幾乎所有成分，尤其是ECM中的基質(zhì)結(jié)構(gòu)和膠原蛋白。除了MMP之外，體內(nèi)還存在大量金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)，可通過與基質(zhì)MMP-2結(jié)合，有效降低基質(zhì)MMP-2的活性，從而抑制 MMP-2 對(duì) ECM 的降解。MMPs 及其天然抑制劑 TIMPs 始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織中 ECM 的正常表達(dá)和沉積。然而，在SSc患者組織中，MMPs和TIMPs蛋白表達(dá)水平，以及MMPs/TIMPs比例存在異常，最終導(dǎo)致了ECM降解的失調(diào)，引起SSc纖維化的發(fā)生[27]。我們的既往研究顯示，溫陽化濁通絡(luò)方能夠顯著上調(diào)MMP-9水平和MMP-9/TIMP-1比值，同時(shí)降低TIMP-1的表達(dá)[25]。因此，溫陽化濁通絡(luò)方調(diào)控ECM的降解是其抗SSc纖維化的另一機(jī)制。TGF-β 能夠通過降低 MMP 和增加TIMP的表達(dá)來促進(jìn)膠原沉積并抑制膠原降解[27]，因此溫陽化濁通絡(luò)方調(diào)控ECM的降解可能是通過抑制TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

4.4 抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善微循環(huán)

臨床癥狀和組織學(xué)數(shù)據(jù)表明，血管損傷和內(nèi)皮損傷是SSc最早的致病事件[28]。活化的內(nèi)皮細(xì)胞能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，粘附分子，如血管細(xì)胞粘附蛋白1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、血漿細(xì)胞間粘附分子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和 E-選擇素(E-selectin)，以及趨化因子，如 MCP-1、MIP-1α 和 MIP-1β的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的募集。內(nèi)皮細(xì)胞還產(chǎn)生內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)和CTGF，刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和ECM的產(chǎn)生。血管壁的逐漸增厚導(dǎo)致毛細(xì)血管腔變窄和微血管系統(tǒng)的功能失調(diào)，從而造成組織缺氧和氧化應(yīng)激。此外，在 SSc 患者中還發(fā)現(xiàn)存在血管修復(fù)和血管生成功能缺陷，造成疾病的慢性進(jìn)展。因此，保護(hù)血管，改善微循環(huán)是治療SSc的重要策略之一。在我們既往研究中，溫陽化濁通絡(luò)方能夠顯著改善SSc患者血管的管襻狀態(tài)、血管流態(tài)和襻周狀態(tài)積分。另外，經(jīng)溫陽化濁通絡(luò)方治療后，SSc患者血液中的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量顯著減少[29]。這些結(jié)果表明溫陽化濁通絡(luò)方具有改善SSc患者甲襞微循環(huán)，保護(hù)血管的作用。

5 結(jié)論

綜上所述，基于“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論的溫陽化濁通絡(luò)方通過多水平、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療SSc的作用，具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本文詳細(xì)總結(jié)了溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc的研究進(jìn)展，將有助于SSc的新藥開發(fā)，并為其他自身免疫疾病和纖維化相關(guān)疾病的治療提供參考。