張 梅， 李 悅， 張燕杰， 洪曉暉， 雷成萬(wàn)

(閩江學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院 福建 福州 350108)

食用色素作為重要的食品添加劑，賦予食品各種各樣的色澤。但合成色素因多具有致癌性、致突變性等毒副作用，其應(yīng)用受到很大的限制[1，2]，而天然色素因具有營(yíng)養(yǎng)、安全、藥理作用等優(yōu)點(diǎn)，漸漸地為人們所青睞[3-5]。杜鵑花色苷是從杜鵑花中提取的一種天然色素，研究表明其花色苷具有較好的穩(wěn)定性和抗氧化性，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，藥理作用強(qiáng)，是一種良好的食品著色劑[6，7]。而錦繡杜鵑(RhododendronpulchrumSweet)為杜鵑花屬植物，花中含有豐富的花色苷成分，是一種潛在的花色苷提取原料，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本文以錦繡杜鵑花為花色苷的提取原料，結(jié)合超聲輔助提取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化錦繡杜鵑花色苷的提取工藝， 旨在為花色苷的高效提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錦繡杜鵑花于閩江學(xué)院校園內(nèi)采集，45 ℃恒溫干燥后粉碎，過 80 目篩，存干燥器內(nèi)備用。無水乙醇、鹽酸等試劑均為分析純。

723N 可見風(fēng)光光度計(jì)，SB-5200DT 型超聲波清洗器，TDL80-2B 臺(tái)式離心機(jī)，AL104 電子分析天平，GZX-9146MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱，PHS-3C 型 pH 計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 錦繡杜鵑花色苷的提取及含量測(cè)定

稱取 1 g 錦繡杜鵑花粉末，置于 250 mL的錐形瓶中，按設(shè)計(jì)的工藝條件加入一定量的乙醇，在設(shè)定的溫度下進(jìn)行超聲提取，抽濾，得到的濾液為花色苷提取液，備用。采用摩爾消光系數(shù)法[8，9]，將提取液稀釋一定倍數(shù)后，在 535 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值 A，計(jì)算錦繡杜鵑花色苷得率。

花色苷得率/mg·(100g)-1= [(A×V)/(98.2×M)]×100

式中，A為吸光度值；V為提取液稀釋的體積(mL)；M為樣品重量(g)；98.2為1%濃度的花色苷 1 moL 消光系數(shù)。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)(乙醇的體積與水體積的百分比)對(duì)花色苷得率的影響

設(shè)定提取時(shí)間 35 min，超聲溫度 55 ℃，液料比 90∶1( mL·g-1)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為 45%、55%、65%、75%、85%時(shí)對(duì)錦繡杜鵑花色苷得率的影響。

(2)提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為 65 %，超聲溫度 55 ℃，液料比 90∶1，考察提取時(shí)間為 15、25、35、45、55 min時(shí)對(duì)錦繡杜鵑花色苷得率的影響。

(3)液料比對(duì)花色苷得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為 65 %，超聲溫度 55 ℃，提取時(shí)間 45 min，考察液料為 50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1時(shí)對(duì)錦繡杜鵑花色苷得率的影響。

(4)超聲溫度對(duì)花色苷得率的影響

設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為 65 %，提取時(shí)間 45 min，液料比110∶1，考察超聲溫度為 35、45、55、65、75 ℃時(shí)對(duì)錦繡杜鵑花色苷得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，以超聲溫度A、乙醇體積分?jǐn)?shù)B、液料比C為自變量，花色苷得率為響應(yīng)值，根據(jù) Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 3 因素 3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以確定錦繡杜鵑花色苷最佳提取工藝[10-12]。采用 Design-Expert 10 軟件分析本次響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因素與水平見表 1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷得率的影響

由圖1可知，錦繡杜鵑花色苷得率受乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不大于 55 % 時(shí)，花色苷得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大處于增加狀態(tài)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%時(shí)，花色苷得率達(dá)到最大值 22.17 mg·(100g)-1，乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，花色苷得率反而下降。這可能是因?yàn)?5%的乙醇與錦繡杜鵑花中的花色苷物質(zhì)極性相似，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)上升，可能會(huì)導(dǎo)致錦繡杜鵑花中其他極性雜質(zhì)物質(zhì)加速溶出，從而使花色苷溶出降低。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響

由圖2可以看出，錦繡杜鵑花色苷得率隨提取時(shí)間加長(zhǎng)，得率有所增加，當(dāng)提取時(shí)間不大于 45 min時(shí)，花色苷得率呈現(xiàn)緩慢遞增趨勢(shì)，而在大于 45 min之后花色苷得率基本保持不變，所以45 min之后繼續(xù)增加提取時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)得率提高作用不明顯。這可能是因?yàn)槌暜a(chǎn)生空穴等作用，會(huì)破壞細(xì)胞壁，從而加速花色苷溶出，時(shí)間過短，作用不明顯，花色苷沒有充分溶出，所以得率不高，但時(shí)間過長(zhǎng)，得率不增加，反而會(huì)因?yàn)榛ㄉ辗纸舛陆怠?/p>

圖2 提取時(shí)間對(duì)花色苷得率的影響

2.1.3 液料比對(duì)花色苷得率的影響

從圖 3 可知，液料比不大于110∶1，杜鵑花花色苷得率呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)，當(dāng)液料比達(dá)到110∶1 時(shí)，花色苷得率達(dá)到最大值 22.24 %。在液料比大于110∶1 后，花色苷得率則呈遞減趨勢(shì)。如果液料比太小，溶劑在細(xì)胞內(nèi)外的濃度差不夠，影響細(xì)胞內(nèi)花色苷往外擴(kuò)散的速率，從而影響溶液中花色苷的得率，液料比太高，則會(huì)降低花色苷溶液中的濃度，增加后繼濃縮難度。

圖3 液料比對(duì)花色苷得率的影響

2.1.4 超聲溫度對(duì)花色苷得率的影響

從圖 4 可知，當(dāng)超聲溫度不大于55 ℃ 時(shí)，花色苷得率隨超聲溫度升高而不斷增加，在達(dá)到 55 ℃ 時(shí)花色苷得率最高，為 22.35 %，在溫度大于55 ℃ 時(shí)，得率呈下降趨勢(shì)。說明一定程度的溫度升高有利于花色苷的溶出，但花色苷不穩(wěn)定，溫度太高則可能使花色苷結(jié)構(gòu)被破壞，得率反而降低。

圖4 超聲溫度對(duì)花色苷得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過 Design-Expert 10 軟件對(duì)表 2 中的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析后，得到二元多項(xiàng)回歸方程模型：Y=22.10+0.27A+0.21B-0.46C-0.62AB+0.47AC-0.012BC-1.54A2-1.12B2-1.00C2。方差分析結(jié)果見表 3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表 3 可知，各個(gè)因素對(duì)錦繡杜鵑花色苷得率的影響程度依次為：液料比(C)> 超聲溫度(A)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)。其中對(duì)花色苷得率的影響情況為：一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)AB對(duì)花色

表3 回歸方程方差分析

苷得率的影響均極顯著，一次項(xiàng)A和交互項(xiàng)AC對(duì)花色苷得率的影響均為顯著，其余項(xiàng)不顯著?；貧w方程系數(shù)R2=0.9786， 模型p<0.0001 為極顯著，失擬項(xiàng)p值0.6019>0.05 為不顯著，說明模型與實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)擬合程度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用于錦繡杜鵑花色苷提取工藝的預(yù)測(cè)和分析。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

用 Design-Expert 軟件對(duì)二次回歸方程擬合，做出各實(shí)驗(yàn)因素兩兩交互作用的三維立體響應(yīng)曲面圖，考察在其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)因素固定，中心值不變的情況下，其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的交互作用對(duì)花色苷得率的影響，結(jié)果見圖 5至圖7。

圖5 乙醇積分?jǐn)?shù)和超聲溫度對(duì)花色苷得率的交互影響

圖6 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷得率的交互影響

圖7 液料比和超聲溫度對(duì)花色苷得率的交互影響

由圖 5至圖7可知，響應(yīng)曲面圖中的坡度越陡峭，表示相應(yīng)的響應(yīng)值對(duì)相關(guān)條件越為敏感[11，12]。每?jī)蓚€(gè)實(shí)驗(yàn)因素的交互作用均存在一個(gè)最高點(diǎn)，說明通過回歸模型分析可以確定最佳提取條件，擬合模型具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。經(jīng)軟件分析，最佳錦繡杜鵑花色苷的提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù) 65.81%，超聲溫度 55.54 ℃，液料比 106.21∶1，花色苷得率的理論值是 22.16 mL·(100g)-1?？紤]到實(shí)踐的操作，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行修正，取乙醇體積分?jǐn)?shù) 65%，超聲溫度 55 ℃，液料比 105∶1。在此條件下，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果花色苷得率為 22.07 mL·(100g)-1，與預(yù)測(cè)值相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化錦繡杜鵑花色苷提取工藝條件可行。

3 結(jié)論

(1)通過 Box-Behnken 組合設(shè)計(jì)，并采用響應(yīng)面對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立了錦繡杜鵑花色苷提取的二次回歸方程模型，探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度及液料比對(duì)花色苷得率的影響。經(jīng)軟件分析，回歸方程系數(shù)R2=0.9786，模型p<0.0001 為極顯著，說明回歸模型，實(shí)驗(yàn)誤差小，合理可靠，可用于錦繡杜鵑花色苷提取工藝的預(yù)測(cè)和分析。

(2)經(jīng)響應(yīng)面法數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合實(shí)踐情況，對(duì)模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行修正，得到錦繡杜鵑花色苷提取的最優(yōu)條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù) 65%，超聲溫度 55 ℃，液料比 105∶1。在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證，得到錦繡杜鵑花色苷得率為 22.07 mL·(100g)-1。