欒婷婷 李燕飛 賈延劼

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘及神經(jīng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確。MS發(fā)病受遺傳和環(huán)境因素共同影響，臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)和灰質(zhì)大量脫髓鞘為主要病理特征[1]。MS在青年人中的發(fā)病率、致殘率高。截至2016年，全球MS患者超200萬(wàn)，年死亡人數(shù)約1.9萬(wàn)[2]。炎性小體是存在于人體免疫細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的一組多聚蛋白復(fù)合體，可識(shí)別損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而參與固有免疫。炎性小體活化有助于清除病原體和受損細(xì)胞，但其異常激活時(shí)可導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。炎性小體主要包括NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2，其中NLRP3最為受關(guān)注。NLRP3炎性小體最早發(fā)現(xiàn)與家族性寒冷性蕁麻疹以及Muckle-Wells綜合征(蕁麻疹-耳聾-淀粉樣變綜合征)相關(guān)[4]。近年來(lái)研究表明，NLRP3可參與MS的發(fā)病，影響疾病進(jìn)展及預(yù)后，有望成為MS的生物標(biāo)志物，其相關(guān)抑制劑有望成為MS治療的有效藥物。

1 NLRP3炎性小體的構(gòu)成與活化

NLRP3炎性小體由受體蛋白(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和效應(yīng)蛋白(caspase-1)組成，NLRP3含有PYD、NACHT、LRR三個(gè)結(jié)構(gòu)域[5]。NLRP3炎性小體可對(duì)多種刺激做出應(yīng)答，如核酸、ATP、各種病原體、結(jié)晶物質(zhì)(石棉、明礬和二氧化硅)等[6-7]。這些激活劑成分各異，很難直接與NLRP3炎性小體相互作用，因此大多學(xué)者更傾向于這些激活劑引發(fā)了可激活NLRP3炎性小體的共同生理變化，如K+外流、Ca2+通路、溶酶體破壞、線粒體損傷等，但具體機(jī)制仍未得到證實(shí)[8]。

靜息狀態(tài)下細(xì)胞質(zhì)中NLRP3和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)水平較低，不足以形成NLRP3炎性小體，所以NLRP3炎性小體的活化分為兩步：?jiǎn)?dòng)和激活[9]。啟動(dòng)：當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞的Toll樣受體識(shí)別PAMPs和DAMPs，核因子κB(NF-κB)激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)，產(chǎn)生大量NLRP3、IL-1β前體及IL-18前體[10]。激活：在激活劑的作用下，細(xì)胞質(zhì)中大量NLRP3、ASC與caspase-1聚集成蛋白復(fù)合物并相互作用，使caspase-1前體(pro-caspase-1)自我切割成有活性的caspase-1，隨后活化的caspase-1將IL-1β前體和IL-18前體裂解為成熟的IL-1β和IL-18，通過(guò)激活Gasdermin D(GSDMD)，釋放炎性因子，最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[9-11]。

2 NLRP3炎性小體在MS中的作用

2.1 與MS遺傳易感性的關(guān)系約15%的MS病例具有遺傳傾向，但目前僅發(fā)現(xiàn)個(gè)別基因突變(如NR1H3[12])可能與MS的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。2009年，Compeyrot-Lacassagne等[13]發(fā)現(xiàn)1例Muckle-Wells綜合征患者腦MRI檢查結(jié)果存在類似MS的影像學(xué)病變，基因分析顯示該患者體內(nèi)NLRP3的NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生CIAS1基因突變。在此之前Lequerré等[14]亦發(fā)現(xiàn)類似的病例。提示MS的發(fā)病可能與NLRP3炎性小體基因突變有關(guān)。Vidmar等[15]采用二代測(cè)序(NGS)技術(shù)對(duì)319名受試者進(jìn)行完整的外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MS患者的炎性小體相關(guān)基因位點(diǎn)(NLRP3、NLRP1和caspase-1)的罕見突變負(fù)荷增加。這也進(jìn)一步提示了NLRP3炎性小體基因突變?cè)贛S病因中起到一定作用，為MS的病因?qū)W研究提供了新的證據(jù)。

2.2 在MS發(fā)病機(jī)制中的作用MS是一類自身免疫性疾病，Th1和Th17細(xì)胞在其發(fā)病過(guò)程中必不可少[16]。Gris等[17]通過(guò)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型證實(shí)，Th1和Th17細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育需要適當(dāng)?shù)腘LRP3表達(dá)，NLRP3-/-小鼠表現(xiàn)出MOG特異性的Th1及Th17細(xì)胞應(yīng)答降低。研究表明，在EAE模型中，NLRP3炎性小體的激活產(chǎn)物IL-1β和IL-18可上調(diào)CD4+T細(xì)胞相關(guān)趨化因子受體(骨橋蛋白、CCR2、CCL8及CXCR6等)的表達(dá)，促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[18]。其中IL-1β可以與MyD88銜接蛋白相互作用，誘導(dǎo)T細(xì)胞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的表達(dá)，而GM-CSF可通過(guò)促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓系細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活而加重神經(jīng)炎癥[19]。IL-18可促進(jìn)CD4+T細(xì)胞IL-17的分泌，抑制IL-10的產(chǎn)生[20]，在MS患者的血清及腦脊液中可檢測(cè)到高水平的IL-18[21]。此外，NLRP3還可激活GSDMD導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，在EAE小鼠脊髓中可觀察到炎性小體的激活以及發(fā)生焦亡的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞呈GSDMD和caspase-1雙陽(yáng)性[11]。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)緩解型MS(relapsing-remitting MS，RRMS)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中炎性小體相關(guān)基因表達(dá)(如NLRP3、caspase-1及IL-1β基因)高于健康對(duì)照組，而IL-18基因未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[22]?？傊?，上述研究表明IL-1β和IL-18作為NLRP3炎性小體的效應(yīng)分子參與了MS的發(fā)病機(jī)制。但亦有研究結(jié)果與之矛盾，如Peelen等[22]在MS患者血漿中并未檢測(cè)到IL-1β，隨后通過(guò)體外培養(yǎng)PBMC并誘導(dǎo)炎性小體激活，并未發(fā)現(xiàn)IL-1β的分泌在MS患者和健康對(duì)照者存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于NLRP3炎性小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在局限性激活導(dǎo)致。

2.3 在MS疾病進(jìn)展及臨床檢測(cè)中的作用Gris等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠發(fā)病期內(nèi)脊髓NLRP3表達(dá)增加，NLRP3-/-小鼠髓鞘破壞、炎性浸潤(rùn)及膠質(zhì)增生減少，整體上表現(xiàn)為病程延遲和疾病嚴(yán)重程度下降，提示NLRP3炎性小體在MS疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Malhotra等在原發(fā)進(jìn)展型MS(PPMS)患者腦組織髓系細(xì)胞上檢測(cè)到NLRP3和IL-1β表達(dá)，且與PBMC中NLRP3及IL-1β的mRNA表達(dá)上調(diào)相一致，提示IL-1β的上調(diào)與NLRP3炎性小體的高度活化相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)MS存在NLRP3炎性小體的激活；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)活動(dòng)/非活動(dòng)混合脫髓鞘損傷中NLRP3和IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于脫髓鞘后損傷以及對(duì)照組腦組織，表明NLRP3和IL-1β的表達(dá)與PPMS活動(dòng)性病變有關(guān)，可用于判斷MS是否處于活動(dòng)期，但具體檢測(cè)方式及有效性有待進(jìn)一步研究[23]。Keane等[24]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，MS患者血清caspase-1、ASC和IL-18的蛋白水平升高，ASC及caspase-1診斷MS的ROC曲線下面積分別為0.94和0.85，中度MS患者血清ASC蛋白水平高于輕度患者，ASC臨界點(diǎn)為537.5 pg/mL時(shí)其診斷的靈敏度為75%，特異度為62%，表明ASC和caspase-1是具有診斷MS潛力的血清生物標(biāo)志物，其檢測(cè)操作方便，可用于指導(dǎo)MS的診斷及治療，其中ASC還可用于評(píng)價(jià)MS的嚴(yán)重程度。

2.4 作為MS治療的靶點(diǎn)疾病修飾治療(disease-modifying treatment，DMT)在MS治療中具有重要作用，能夠有效延緩疾病進(jìn)展[25]。干擾素(IFN-β)是臨床常用的一線DMT藥物，但用于治療RRMS時(shí)僅使患者年復(fù)發(fā)率降低32%～34%[1]。研究表明MS患者對(duì)IFN-β的應(yīng)答與否與NLRP3炎性小體有關(guān)[26]。Inoue等發(fā)現(xiàn)，IFN-β僅對(duì)NLRP3依賴性的EAE有效，對(duì)ASC-/-和NLRP3-/-的EAE小鼠治療效果不佳；此外，作者通過(guò)EAE模型亦證實(shí)，在體內(nèi)IFN-β與單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中的Ⅰ型干擾素受體(IFNAR)結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS1)抑制Rac1的活化和線粒體活性氧的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NLRP3的激活[27]。隨后，Noroozi等[28]臨床試驗(yàn)研究證實(shí)了這一觀點(diǎn)。Noroozi等研究納入30例MS患者，患者均對(duì)IFN-β1a治療有反應(yīng)，且患者NLRP3基因表達(dá)及血漿IL-1β水平較治療前明顯下降。上述研究提示，NLRP3炎性小體是治療MS的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，開發(fā)其靶向抑制劑對(duì)治療MS具有重要意義。目前研究較多的是MCC950，一種二芳基磺酰脲類化合物，在納摩爾濃度下可特異、有效地阻斷NLRP3的激活，抑制NLRP3誘導(dǎo)的ASC聚集，減少IL-1β的產(chǎn)生[29]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)MCC950具有體內(nèi)活性并可有效改善EAE的嚴(yán)重程度[29]，是很有前景的MS治療藥物。其他一、二線DMT藥物如特立氟胺、芬戈莫德、富馬酸二甲酯等與NLRP3之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。

2.5 預(yù)測(cè)MS的預(yù)后MS致殘率高，多數(shù)MS患者預(yù)后較差，NLRP3炎性小體的激活是其中很重要的一個(gè)因素。Soares等[30]通過(guò)對(duì)MS患者PBMC中的5個(gè)炎性小體(NLRP1、NLRP3、NLRC4、IL-1β、IL-18)基因的8個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs35829419 C>A和IL-1β rs16944 C>T多態(tài)性在重度MS患者中的頻率高于輕度患者，在疾病快速進(jìn)展的MS患者中其頻率高于緩慢進(jìn)展患者，其中NLRP3 rs35829419 C>A與MS嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，表明NLRP3炎性小體激活增加是MS程度加重及預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。Malhotra等研究亦發(fā)現(xiàn)，PBMC中IL-1β高表達(dá)的PPMS患者疾病進(jìn)展更快，在7年內(nèi)擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表評(píng)分達(dá)6.0分，而IL-1β低水平的患者需要18年[23]。上述研究不僅表明NLRP3炎性小體的激活可使MS患者預(yù)后更差，而且提示了NLRP3炎性小體作為MS生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的重要性和必要性。

2.6 基于NLRP3炎性小體表達(dá)的MS分型基于NLRP3炎性小體可作為MS的生物標(biāo)志物的結(jié)論，可將MS分為NLRP3炎性小體依賴型和非依賴型兩類。其中NLRP3非依賴性的MS患者對(duì)臨床常用的治療方案反應(yīng)可能較差。Inoue等[31]采用高劑量的熱滅活分枝桿菌(Mtb)誘導(dǎo)出NLRP3非依賴性的EAE模型，并稱之為B型EAE，這種小鼠體內(nèi)NLRP3激活水平較低，血清IL-1β水平明顯降低，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞密度、脫髓鞘狀態(tài)及CD4+T細(xì)胞基因表達(dá)等方面均不同于A型EAE；此外，該研究在B型EAE模型中還檢測(cè)到高水平的內(nèi)源性IFN-β，可抑制NLRP3的活性，并得出急性病毒感染可使A型EAE轉(zhuǎn)化為B型的結(jié)論。因此，針對(duì)B型EAE，需尋找新的治療靶點(diǎn)。Inoue等[31]研究還發(fā)現(xiàn)，在B型EAE中趨化因子受體CXCR2和淋巴毒素-β受體(LTβR)的表達(dá)增加，阻斷該受體可有效改善EAE的嚴(yán)重程度，進(jìn)而推測(cè)在IFN-β耐藥的RRMS患者中，這兩種受體的表達(dá)也升高。上述研究結(jié)果不僅再次證實(shí)了MS具有異質(zhì)性，而且也表明了依據(jù)NLRP3表達(dá)水平對(duì)MS患者進(jìn)行分型在治療方案的選擇中有重要指導(dǎo)意義，針對(duì)NLRP3炎性小體非依賴型MS進(jìn)行深入研究將為臨床MS的治療提供了新的思路和方向。

綜上所述，NLRP3炎性小體參與了MS的發(fā)生發(fā)展，是MS非常有前景的生物標(biāo)志物，可用于指導(dǎo)MS的臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)。目前，關(guān)于NLRP3炎性小體與MS的研究仍存在很大限制，其中腦組織活體標(biāo)本的獲取困難是主要原因，因此建立MS標(biāo)本庫(kù)以及開發(fā)更多MS動(dòng)物模型很有必要；此外，雖然IL-1β及IL-18作為NLRP3炎性小體的效應(yīng)分子參與MS的發(fā)病已成為共識(shí)，但由于具體機(jī)制尚不明確，其作為MS標(biāo)志物的可行性有待進(jìn)一步研究。MS是一種異質(zhì)性疾病，因此將NLRP3炎性小體作為治療靶點(diǎn)以及開發(fā)新的生物標(biāo)志物將是未來(lái)的研究重點(diǎn)。