崔凌云，仇鑫，2，周宏宇，李子孝，2，3，4，王擁軍，2，3，4

缺血性卒中是我國致死和致殘的主要原因[1]。缺血性卒中患者中約有1/3合并糖尿病[2]，其中2型糖尿病占糖尿病總數(shù)的90%以上。2型糖尿病是一種多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素及傳統(tǒng)的危險因素僅可以解釋約25%的2型糖尿病風(fēng)險[3]，環(huán)境因素與遺傳因素之間相互作用的機(jī)制——表觀遺傳學(xué)已被證實可以影響2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險[4]。

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分[5]。在真核細(xì)胞中，DNA甲基化指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，供體的甲基基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。在發(fā)育過程中，基因組的DNA甲基化狀態(tài)是一個動態(tài)變化過程，在許多生物過程中起著重要作用[6]，同時也參與了許多復(fù)雜疾病的發(fā)病過程。糖尿病通過加速動脈粥樣硬化進(jìn)展促進(jìn)了缺血性卒中等心腦血管疾病的發(fā)生及發(fā)展，而DNA甲基化在這一過程中起到了重要的調(diào)控作用[7]。對DNA甲基化的深入研究有助于增加對2型糖尿病的認(rèn)識。本文從DNA甲基化與2型糖尿病的病理生理機(jī)制、危險因素、環(huán)境因素及并發(fā)癥等方面的關(guān)系展開介紹，對目前研究發(fā)現(xiàn)的可能標(biāo)志物和靶點進(jìn)行總結(jié)，為缺血性卒中的預(yù)防提供新思路。

1 DNA甲基化與2型糖尿病的病理生理機(jī)制

多項2型糖尿病相關(guān)的人類表觀遺傳病例對照研究發(fā)現(xiàn)，人體的血液、胰島、肝臟、脂肪和肌肉等多種組織和器官中存在與胰島素分泌受損和胰島素抵抗相關(guān)的顯著差異甲基化表達(dá)的基因[8]，這些基因的甲基化改變提示了其與2型糖尿病的相關(guān)性。另外，一項大型、前瞻性、巢式病例對照研究還發(fā)現(xiàn)，ABCG1和SREBF1等基因甲基化水平的升高以及PHOSPHO1、SOCS3和TXNIP等基因甲基化水平的降低可以預(yù)測2型糖尿病的發(fā)生[9]。

2型糖尿病的病理生理機(jī)制主要為胰島素抵抗及葡萄糖刺激的胰島素分泌不足[10]。但胰島素抵抗本身并不足以導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生，胰島素抵抗期間胰島β細(xì)胞功能的逐漸喪失即胰島素分泌受損同樣發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者胰島中有853個基因及1649個CpG位點的DNA甲基化水平發(fā)生變化，其中，CDKN1A、PDE7B和SEPT9等基因的DNA甲基化水平降低，上述3個基因的過表達(dá)均可導(dǎo)致克隆β細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌減少[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者胰島中INS、PDX1、PPARGC1A及GLP1R等基因的啟動子甲基化水平升高[12-13]。INS基因編碼胰島素；PDX1基因編碼Pdx1，Pdx1是一種同源框轉(zhuǎn)錄因子，在胰腺發(fā)育及β細(xì)胞功能維持中起重要調(diào)控作用；PPARGC1A基因編碼線粒體調(diào)節(jié)劑；GLP1R基因編碼GLP1受體，GLP1受體在激活時會刺激胰島素分泌并增強(qiáng)β細(xì)胞的保護(hù)功能，在β細(xì)胞功能或細(xì)胞代謝中具有重要作用。這些關(guān)鍵基因的表達(dá)降低，均與胰島素分泌受損及胰島功能障礙相關(guān)[14]。HDAC7基因編碼組蛋白去乙酰酶HDAC7，基因測序提示在2型糖尿病患者的胰島中HDAC7基因呈低甲基化改變，這可能導(dǎo)致2型糖尿病患者胰島中的β細(xì)胞功能紊亂，胰島素分泌受損，同樣，大鼠胰島克隆β細(xì)胞中HDAC7的增加會損害線粒體功能和胰島素分泌[15]，而2型糖尿病HDAC抑制劑givinostat可以修復(fù)β細(xì)胞中HDAC7過表達(dá)出現(xiàn)的胰島素分泌不足[16]，這為2型糖尿病提供了一種潛在的新療法。其他一些基因，如NR4A3、PARK2、PID1和SOCS2等，也在2型糖尿病患者胰島中表現(xiàn)出DNA甲基化和表達(dá)水平的變化，與葡萄糖刺激的胰島素分泌受損有關(guān)[17]。

關(guān)于DNA甲基化參與2型糖尿病病理生理機(jī)制的研究介紹，一方面，針對胰島素分泌不足的研究雖然已經(jīng)有不少成果，但涉及的基因較多，針對性不強(qiáng)，證據(jù)不夠充足；另一方面，針對胰島素抵抗的研究目前很少，后續(xù)應(yīng)該重點關(guān)注。

2 DNA甲基化與2型糖尿病的危險因素

既往研究報道，與女性相比，男性胰島的胰島素分泌功能較差[17]，男性患2型糖尿病的風(fēng)險高于女性[18]。兩性之間存在很大的甲基化差異，且其中＞90%的重要CpG位點都位于X染色體上[17]。與女性相比，男性胰島中X染色體上約40%的重要CpG位點甲基化程度更高，這可能與較差的胰島素分泌功能有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，APLN和NKAP基因在女性胰島中被高度的甲基化抑制，當(dāng)在克隆β細(xì)胞中使用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)Apln和Nkap表達(dá)使克隆β細(xì)胞具備“女性化”特征時，克隆β細(xì)胞胰島素分泌增多[17]。

年齡是2型糖尿病的危險因素之一。同樣，隨著年齡的增長，人體組織中DNA甲基化模式發(fā)生改變[19]。Fraga等[20]發(fā)現(xiàn)，表觀基因組在正常年輕同卵雙胞胎的細(xì)胞中相似，而在正常老年同卵雙胞胎中則不同，這支持年齡對DNA甲基化有顯著影響的觀點。此后許多研究調(diào)查了年齡對2型糖尿病重要組織表觀基因組的影響，發(fā)現(xiàn)正常人體中脂肪、肝臟和血液這3種組織類型的3470個CpG位點的DNA甲基化程度隨著年齡的增高發(fā)生變化[21]，并且如FHL2、ELOVL2和KLF14等的一些重要CpG位點的甲基化似乎在所有組織中都以相同的方式變化。這些與2型糖尿病緊密相關(guān)的組織中的基因甲基化程度隨年齡改變的證據(jù)可能提示，DNA甲基化在年齡這種危險因素中發(fā)揮了一定的作用。一項隊列研究分析了87例年齡在26～74歲的非糖尿病患者胰島的基因組甲基化，發(fā)現(xiàn)241個位點的DNA甲基化程度隨著年齡的增長而增加，這些位點包含了與2型糖尿病和胰島素分泌相關(guān)的基因[22]。這些研究作為一些間接證據(jù)反映了在2型糖尿病相關(guān)的組織中存在與年齡相關(guān)的DNA甲基化改變，但還需一些直接證據(jù)證明年齡作為一種重要危險因素在DNA甲基化與2型糖尿病中發(fā)揮的潛在作用。

不同的食物攝入及飲食模式會通過影響DNA甲基化狀態(tài)來促進(jìn)2型糖尿病的進(jìn)展，如葉酸可以提供甲基供體，進(jìn)入體內(nèi)后DNMT進(jìn)一步將這些甲基連接到DNA和組蛋白尾部，實現(xiàn)機(jī)體所需的表觀遺傳調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的葉酸水平降低，且葉酸水平與236個CpG位點的平均甲基化程度呈正相關(guān)[23]。動物研究表明，葉酸可改變高脂飲食小鼠脂肪組織中與2型糖尿病相關(guān)基因的甲基化水平，降低小鼠的脂肪含量和血清葡萄糖水平，并改善胰島素抵抗[24]。攝入大量葡萄糖和棕櫚酸都會損害葡萄糖刺激的胰島素分泌。暴露于高水平葡萄糖后，GLRA1、RASD1、VAC14、SLCO5A1和CHRNA5等與胰島功能相關(guān)的基因的表達(dá)水平和甲基化程度均發(fā)生改變[25]。暴露于高水平棕櫚酸酯后，包括TCF7L2和GLIS3在內(nèi)的290個基因的甲基化水平發(fā)生了變化，其中37個基因在2型糖尿病患者的胰島中差異表達(dá)[26]。

肥胖是2型糖尿病重要的危險因素，HIF3a編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)機(jī)體對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。R?nn等[27]發(fā)現(xiàn)肥胖與2型糖尿病患者包括FTO、TCF7L2和IRS1在內(nèi)的幾個候選基因的甲基化存在相關(guān)性。

糖尿病的危險因素很多，除了上述提到的以外，2型糖尿病還存在如種族、吸煙和靜坐生活方式等多種危險因素，但DNA甲基化相關(guān)的研究在這些方面涉及較少，需要后續(xù)進(jìn)一步的關(guān)注。

3 DNA甲基化與2型糖尿病的環(huán)境因素

2型糖尿病涉及的環(huán)境因素包括子宮內(nèi)環(huán)境和母體環(huán)境暴露[28]。宮內(nèi)生長受限對個體調(diào)控胰島和外周組織中葡萄糖和能量穩(wěn)態(tài)的基因表達(dá)具有深遠(yuǎn)的影響。各種原因?qū)е碌奶簩m內(nèi)生長受限會增加罹患糖尿病的風(fēng)險，DNA甲基化在其中發(fā)揮了一定的作用。Thompson等[29]分離了在胎兒時期暴露于宮內(nèi)生長受限模型的成年雄性大鼠的胰島，發(fā)現(xiàn)了1400個差異甲基化位點，其中多數(shù)差異甲基化CpG位點位于保守的基因區(qū)域，且靠近先前被發(fā)現(xiàn)為胰島β細(xì)胞生理過程（如細(xì)胞分裂和死亡、血管形成和胰島素分泌）關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因，提示這些差異甲基化CpG位點的功能與胰島β細(xì)胞功能可能相關(guān)。在表觀基因組關(guān)聯(lián)研究中，胎兒時期處于母體2型糖尿病的成年人被發(fā)現(xiàn)存在包含29個基因和10個基因間區(qū)域的48個差異甲基化CpG位點[30]，其中一些位點的甲基化改變會損害胰島素分泌并增加成年后患2型糖尿病的風(fēng)險[31]。

母體環(huán)境暴露同樣會增加后代罹患2型糖尿病的風(fēng)險。鄰苯二甲酸酯是常用的增塑劑，添加于多種日常用品中，但因其存在的健康隱患，正在被美國和歐盟多個國家淘汰。母體經(jīng)常暴露于鄰苯二甲酸酯，后代的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4基因甲基化程度增高，表達(dá)下降，而這種基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4在葡萄糖的攝取和代謝過程中發(fā)揮著重要作用。雙酚A是一種廣泛用于制造聚碳酸酯塑料的環(huán)境激素，母體大鼠在整個妊娠和哺乳期間暴露于雙酚A會導(dǎo)致后代小鼠整體甲基化水平降低、編碼DNMT 3B的基因表達(dá)增加[32]，這些變化與成年后代發(fā)生胰島素抵抗有關(guān)。

4 DNA甲基化與2型糖尿病的并發(fā)癥

4.1 動脈粥樣硬化性心血管疾病 動脈粥樣硬化性心血管疾病是2型糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者重要的死亡原因[33-34]。以血管平滑肌細(xì)胞增殖和積累失衡為核心的新生內(nèi)膜增生，導(dǎo)致了動脈粥樣硬化和狹窄等病理改變，這是糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化性心血管疾病的病理基礎(chǔ)。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）是腫瘤增殖和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵介質(zhì)，在糖尿病中發(fā)揮重要作用，組織因子通道抑制因子2（recombinant tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）是血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的組織因子途徑抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠模型中，PARP1作為負(fù)調(diào)控因子增加了TFPI2啟動子的DNA甲基化水平，下調(diào)TFPI2表達(dá)，進(jìn)而加速主動脈新生內(nèi)膜的增生[35]。大血管的動脈粥樣硬化改變是聯(lián)系2型糖尿病與缺血性卒中的關(guān)鍵病理變化，未來還需更多的臨床隊列及基礎(chǔ)研究來探索DNA甲基化在其中的作用。

4.2 糖尿病腎病 糖尿病腎?。╠ iab etic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，2型糖尿病患者中約有40%會發(fā)展為DKD[36]。DKD的特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在腎內(nèi)聚，引起腎小管間質(zhì)纖維化等一系列病理變化，導(dǎo)致腎功能障礙[37]。UNC13B基因被認(rèn)為介導(dǎo)了高血糖導(dǎo)致的腎小球細(xì)胞凋亡，與DKD的發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)，與健康人相比，在糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)了包括UNC13B基因在內(nèi)的多個基因的差異甲基化[38]。DKD患者長期暴露于高血糖環(huán)境會誘導(dǎo)包括轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的上調(diào)可誘導(dǎo)Rasal1啟動子的高甲基化，導(dǎo)致Ras-GTP抑制因子的表達(dá)減少，Ras-GTP信號傳導(dǎo)增加，成纖維細(xì)胞活化增加，纖維化加速[39]。有研究提議可以使用DNA甲基化譜作為生物標(biāo)志物幫助預(yù)測2型糖尿病患者DKD的進(jìn)展，但還需進(jìn)一步的臨床驗證。

4.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變 糖尿病視網(wǎng)膜病變是2型糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是成年人失明的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者視網(wǎng)膜及其毛細(xì)血管細(xì)胞中的MMP-9水平升高，損傷線粒體，進(jìn)而加速視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，這是發(fā)展至視網(wǎng)膜病變前的一種病理現(xiàn)象[40]。一項基于糖尿病小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，盡管高糖狀態(tài)促進(jìn)了DNMT1與MMP-9啟動子的結(jié)合，促進(jìn)基因表達(dá)，但在相同的啟動子位點，去甲基化酶Tet2結(jié)合同期增加，抑制了基因表達(dá)，最終結(jié)果為MMP-9啟動子甲基化水平降低，去甲基化水平升高，MMP-9表達(dá)增加。這提示在高糖狀態(tài)時，MMP-9的表達(dá)由活躍的DNA甲基化-去甲基化過程控制，調(diào)節(jié)該機(jī)制可能有助于維持線粒體穩(wěn)態(tài)并抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展[41]。

5 展望

過去幾年涌現(xiàn)了大量關(guān)于DNA甲基化與2型糖尿病相關(guān)性的研究，證實DNA甲基化可通過多種途徑參與2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展，少數(shù)DNA甲基化位點甚至可以預(yù)測2型糖尿病的發(fā)生。然而，目前這些研究仍主要以橫斷面研究為主，未來需要更多前瞻性隊列中的DNA甲基化數(shù)據(jù)來挖掘更多具有臨床應(yīng)用潛能的DNA甲基化標(biāo)志物。全基因組DNA甲基化譜作為一種新興生物標(biāo)志物，在未來不僅可用于預(yù)測個體患2型糖尿病或2型糖尿病特定并發(fā)癥的風(fēng)險，還可以開發(fā)包含遺傳信息和DNA甲基化的智能化2型糖尿病診療系統(tǒng)，針對特定甲基化位點及相關(guān)的關(guān)鍵酶也可作為未來藥物治療的靶標(biāo)，由此開發(fā)出更多的創(chuàng)新療法，為缺血性卒中的一級及二級預(yù)防提供更多治療方法。