張念鑫,孔 勇,于君君,舒鳳月,周 晶*,王慶峰,于國(guó)紅

(1 曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,曲阜 273165;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,上海 201403;3河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所,衡水 053000)

濕地是陸生生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)的過度地帶,是具有保護(hù)生物多樣性、改善水質(zhì)等功能的重要生態(tài)系統(tǒng)。 近年來由于人們對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)的過度污染,造成了濕地面積銳減等嚴(yán)重的環(huán)境問題[1]。 作為中國(guó)南水北調(diào)東線工程重要輸水通道的南四湖,其濕地生態(tài)系統(tǒng)的水質(zhì)良好是確保南四湖水質(zhì)安全及調(diào)水工程順利實(shí)施的重要保證。 為了提高南四湖水質(zhì)、恢復(fù)濕地生物多樣性,南四湖流域開展了大規(guī)模的濕地修復(fù)工程,人工濕地的修建促進(jìn)了水體凈化和物質(zhì)循環(huán),其中氮元素的循環(huán)過程受到特別關(guān)注[2]。

氮素循環(huán)是生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)之一,其循環(huán)過程主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4 個(gè)過程,均由微生物驅(qū)動(dòng)[3]。 硝化作用是固氮作用和反硝化作用之間的重要環(huán)節(jié)[4],進(jìn)一步分為兩個(gè)關(guān)鍵過程:第一階段的氨氧化過程和第二階段的硝化過程,其中氨氧化細(xì)菌參與的氨氧化反應(yīng)是硝化反應(yīng)的限速步驟。 自1890 年,Winogradsky 首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的氨氧化作用以來,研究者對(duì)氨氧化細(xì)菌的作用機(jī)理和分離純化方式十分關(guān)注。 氨氧化細(xì)菌的氨氧化作用包括2 個(gè)氧化過程[5],分別利用自身的氨單加氧酶(Ammonia Mono Oxygenase,AMO)和羥胺氧化酶(Hydroxylamine Oxidoreductase,HAO)進(jìn)行反應(yīng)[6],最終將氨氧化為亞硝酸鹽。 氨氧化細(xì)菌屬于革蘭氏陰性專性化能自養(yǎng)細(xì)菌,由于其自身的依附性以及生長(zhǎng)速率慢等特性,使得從環(huán)境中分離純化氨氧化菌成為一大難題。 如今,最常用的方法是先將樣品通過富集培養(yǎng),再利用硅膠培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基分離純化氨氧化菌。

目前,關(guān)于南四湖人工濕地微生物的研究相對(duì)較少,而對(duì)于氨氧化菌的研究更是微乎其微。 氨氧化細(xì)菌作為污水生物處理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)氨氮去除的主體,其種群結(jié)構(gòu)組成和種群數(shù)量在一定程度上決定了南四湖水體中氮素的循環(huán)速率,進(jìn)一步?jīng)Q定了南四湖水體的富營(yíng)養(yǎng)程度。 本研究通過從南四湖人工濕地沉積物中分離出具有氨氮去除能力的細(xì)菌,以了解南四湖水質(zhì)的現(xiàn)狀,并為污染水體的生物修復(fù)提供初步候選菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

富集培養(yǎng)基(SM):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO40.35 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,CaCl20.18 g,蒸餾水500 mL,pH 8.0。

分離培養(yǎng)基(BTB 培養(yǎng)基):(NH4)2SO42 g,K2HPO40.75 g,NaH2PO40.25 g,MgSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.01 g,CaCO35 g,蒸餾水 1 L,pH 7.2。

營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液:(NH4)2SO45.5 g,蒸餾水100 mL。

硅膠分離培養(yǎng)基:在155 mL 蒸餾水中加入5.5 mL 相對(duì)密度為1.84 的濃硫酸,在185 mL 蒸餾水中加入22 mL 相對(duì)密度為1.19 的濃鹽酸,兩者混合即為稀酸液。 在500 mL 蒸餾水中加入82.59 g 硅酸鈉,攪拌溶解即為水玻璃。 提取12 mL 水玻璃和8 mL 稀酸液于燒杯中,快速攪拌至均勻后,倒入培養(yǎng)皿中,靜置60 min 凝固。 凝固后用蒸餾水輕輕沖洗5—8 次,每次15—25 min。 用1%的硝酸銀溶液檢查氯離子的去除效果,若呈白色則繼續(xù)沖洗。 當(dāng)氯離子除去后,用無菌水將硅膠平板沖洗1 次,倒置曬干[7]。 在硅膠平板表面加入2 mL 氨氧化菌分離培養(yǎng)液,然后放入烘箱中,35—45 ℃維持1.0—1.5 h 至表面無液體流動(dòng),然后與培養(yǎng)皿蓋一同在紫外燈下照射30 min,即為用于分離氨氧化細(xì)菌的硅膠平板。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

南四湖是微山湖、昭陽湖、獨(dú)山湖、南陽湖的總稱,為淮河流域第二大淡水湖。 其中微山湖面積最大,故又統(tǒng)稱為微山湖。 湖泊北高南低,南北長(zhǎng)約125 km,東西寬5.6—30 km,湖區(qū)面積1 225 km2,儲(chǔ)水量19.3 億m3。 隨著人為活動(dòng)的影響,導(dǎo)致南四湖生態(tài)環(huán)境惡化,富營(yíng)養(yǎng)化和沼澤化狀況嚴(yán)重。 2005 年3 月,位于南四湖新薛河的人工濕地示范區(qū)建設(shè)工程正式啟動(dòng),使得南四湖的水質(zhì)得到很大程度的改善。本研究采樣地點(diǎn)位于山東省南四湖新薛河人工濕地,該地為暖溫帶、半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,年平均氣溫14.2 ℃,年降水量700 mm。 于2015 年9 月底采集薛河濕地滯留塘底泥,釆用“之”字形布點(diǎn)取樣(圖1),取樣深度均為0—20 cm。 使用取泥器取同樣深度的土樣9 份,充分混合均勻后放入無菌袋中,每處理取4 個(gè)重復(fù),封裝后帶回實(shí)驗(yàn)室,4 ℃冰箱保存。

圖1 采樣點(diǎn)Fig.1 Schematic diagram of sampling points

1.2.2 好氧氨氧化菌的分離篩選

將采集的底泥以每10 mL 添加1 g 底泥的比例加入富集培養(yǎng)基中,置28 ℃恒溫室中培養(yǎng)10—15 d。用格利斯試劑在白瓷板上檢測(cè)亞硝酸的生成情況[8]。 格利斯試劑檢驗(yàn)為紅色的富集液中加入1 mL 營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液,繼續(xù)恒溫培養(yǎng)。 再次檢驗(yàn),當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)深紅色時(shí),吸取1 mL 富集液移至新鮮培養(yǎng)液中恒溫培養(yǎng)。 連續(xù)2 次營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和移液富集后,吸取0.05 mL 富集液于硅膠平板上28 ℃培養(yǎng)2—4 周,挑取針尖大小的單菌落于瓊脂平板上劃線分離,在28 ℃恒溫室中培養(yǎng)。 重復(fù)劃線分離,純化細(xì)菌。

1.2.3 16S rDNA 序列擴(kuò)增

采用愛思進(jìn)生物科技有限公司AxyPrep 細(xì)菌基因組DNA 小量制備試劑盒抽提細(xì)菌基因組DNA,并用DNA 純化試劑盒純化DNA 樣品。 以純化后的DNA 為模板進(jìn)行16S rDNA 靶標(biāo)基因的擴(kuò)增,引物采用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Escherichia coli對(duì)應(yīng)位置為 8—27) 和 1541R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。 PCR 擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40 s,33 個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。 PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物,電泳檢測(cè)片段大小合格后,進(jìn)行切膠回收,用天根生化公司的DNA 純化回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。 將純化產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司測(cè)序。 將測(cè)序后的序列導(dǎo)入NCBI 數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行比對(duì),尋找親緣關(guān)系相近的菌種,并用MEGA 6.1 軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

對(duì)底泥經(jīng)過2 次的富集培養(yǎng)后,通過純化分離獲得5 株氨氧化細(xì)菌。 在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌能在氨氧化菌富集培養(yǎng)基和瓊脂平板上生長(zhǎng),表明菌株的營(yíng)養(yǎng)來源方式多樣,適應(yīng)能力強(qiáng)。 在瓊脂平板上,菌落呈半透明淺灰白色,表面濕潤(rùn)光滑,微隆起,邊緣整齊(圖2)。 經(jīng)革蘭氏染色后,置油鏡下觀察,5 株菌均呈現(xiàn)出紅色,均為革蘭氏陰性菌。

圖2 各菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology pictures of each strain

2.2 16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過NCBI 的Bastln 檢索系統(tǒng)進(jìn)行基因序列同源性分析,16S rDNA 序列同源性比對(duì)結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn),篩選分離出的5 株菌中,分別與異氧硝化菌(3 號(hào)和11 號(hào))、嗜酸菌(5 號(hào))、酯香微桿菌(4 號(hào)和12 號(hào))親緣關(guān)系較近。 進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),分離篩選出的異氧硝化菌(3 號(hào)和 11 號(hào)) 與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)和風(fēng)濕桿菌(Diaphorobacter oryzae)聚為一簇,進(jìn)一步與亞硝基滯氮桿菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羥基丁酸正交桿菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)聚為一小簇。 說明3 號(hào)和11 號(hào)菌株都與Diaphorobacter屬細(xì)菌的親緣關(guān)系最近。 該屬的細(xì)菌對(duì)含苯環(huán)的物質(zhì)具有一定的降解作用,且具有一定的絮凝作用,有較強(qiáng)的環(huán)境和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化作用是Diaphorobacter 屬的主要脫氮形式,將硝氮、亞硝氮、氨氮轉(zhuǎn)化并加以利用進(jìn)行菌體生長(zhǎng),可促進(jìn)污染水體的氮循環(huán)[9]。 酯香微桿菌(4 號(hào)和11 號(hào))與蘇氏微桿菌(Microbacterium suwonense)、酮側(cè)體微桿菌(Microbacterium ketosireducens)、解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)聚為一簇,其中與解阿拉伯半乳聚糖微桿菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)的進(jìn)化關(guān)系最為接近。 說明4 號(hào)和12 號(hào)與Microbacterium屬具有高度相似性,此屬細(xì)菌常發(fā)現(xiàn)于乳制品、污水和昆蟲等。Microbacterium在自然界中廣泛存在,具有極強(qiáng)抗逆性,是修復(fù)環(huán)境污染的理想微生物。 可修復(fù)受油污染的地表水、脫除有機(jī)硫,以及降解有機(jī)污染物[10]。 嗜酸菌(5 號(hào))與纈草酸卵菌(Acidovorax valerianellae)、西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli) 和沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)聚為一簇,說明5 號(hào)與Acidovorax 屬細(xì)菌具有高度的相似性,該屬細(xì)菌屬于好氧或兼性厭氧非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌。 嗜酸菌是極端環(huán)境微生物的主要類群之一,生長(zhǎng)在酸性環(huán)境,這是由于硫或硫化物的存在及氧化,嗜酸菌在地球物質(zhì)循環(huán)方面做出了重要貢獻(xiàn)[11]。 可以看出,整個(gè)進(jìn)化樹將嗜酸菌屬(Acidovoraxsp.)、微桿菌屬(Microbacteriumsp.)、Diaphorobacter 屬分為 3 簇。

圖3 16S rDNA 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences

3 結(jié)論與討論

近幾十年來,以無機(jī)或有機(jī)物作為氮源的異養(yǎng)硝化微生物(包括細(xì)菌、放線菌、真菌)相繼在土壤、污泥、湖水、深海火山口等處被發(fā)現(xiàn)和分離[9]。 和大多數(shù)自養(yǎng)硝化細(xì)菌相比,異養(yǎng)型硝化菌生長(zhǎng)速率快、細(xì)胞產(chǎn)量高并且能忍受酸性較強(qiáng)的環(huán)境,雖然至今對(duì)異氧硝化菌的代謝途徑不甚了解,但其仍具有一定的硝化性能。 異氧硝化菌能夠利用有機(jī)碳生長(zhǎng),并將含氮化合物硝化成亞硝酸鹽、硝酸鹽等產(chǎn)物[10],在人工濕地的氮循環(huán)過程中十分重要。

通過對(duì)5 株菌的16S rDNA 序列和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),3 號(hào)與11 號(hào)屬于Diaphorobacter屬,該菌屬在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體增長(zhǎng)迅速的同時(shí)去除氨氮的效率增高。 在氨氮濃度較低時(shí)菌體生長(zhǎng)會(huì)進(jìn)入穩(wěn)定期,在菌體生長(zhǎng)過程中會(huì)檢測(cè)到少量的硝氮和亞硝氮這是由于菌體發(fā)生了異養(yǎng)硝化,但在氨氮濃度偏低時(shí)會(huì)將這些副產(chǎn)物消耗掉。 而且Diaphorobacter屬細(xì)菌在脫氮促進(jìn)氮素循環(huán)的同時(shí),還可降解苯酚類有機(jī)物,苯酚對(duì)人體和動(dòng)植物均有毒害作用。 因此,3 號(hào)和11 號(hào)可作為較好的候選生物修復(fù)菌株。

本研究主要是為了篩選具有氨氮去除能力的細(xì)菌,用于促進(jìn)人工濕地污水凈化中的氮素循環(huán)。 人工濕地是指將污水有控制的投配到經(jīng)人工建造的濕地上,污水在沿一定方向流動(dòng)的過程中,通過土壤、植物、微生物、人工基質(zhì)等作用,對(duì)其自身進(jìn)行一定程度的凈化技術(shù)[12]。 在污水被凈化的過程中,氮元素的去除主要通過氨化、硝化、反硝化、植物吸收和基質(zhì)吸附等途徑[13]。 南四湖在南水北調(diào)東線建設(shè)中具有重要地位,其水質(zhì)對(duì)南水北調(diào)的整體質(zhì)量影響較大[14]。 在5 株氨氧化菌的篩選培養(yǎng)過程中,本研究選用氨氧化菌富集培養(yǎng)基和瓊脂平板對(duì)其進(jìn)行分離純化,結(jié)果表明5 株氨氧化菌均能夠利用無機(jī)氮和有機(jī)氮進(jìn)行生長(zhǎng),其營(yíng)養(yǎng)來源多樣,能夠適應(yīng)南四湖人工濕地的復(fù)雜環(huán)境,促進(jìn)氮素循環(huán)凈化水質(zhì)。