謝娟平，常永宏，強(qiáng)世喜，劉春陽(yáng)，陳嘉悅

(1.安康學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西 安康 725000；2.安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseYing)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，臨床常用于治療小兒麻痹癥、神經(jīng)衰弱、慢性氣管炎等，是藥用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥之一[1-3]。巫山淫羊藿含多種成分，具有防抑郁、抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能，也具有抗皮膚老化、美白等功能[3]。巫山淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷和朝藿定C是目前市場(chǎng)急需的保健原料之一。但是巫山淫羊藿中的淫羊藿苷含量并不高，目前多采用大孔樹(shù)脂進(jìn)行純化提高含量[4]。而巫山淫羊藿中藥材含有多種與淫羊藿苷結(jié)構(gòu)類(lèi)似的成分，理論上存在生物轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷的可能性，與朝藿定C結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物也有轉(zhuǎn)化為朝藿定C的可能。

生物酶能分解細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素及果膠，加快有效成分溶出，提高提取效率，同時(shí)作用于目標(biāo)產(chǎn)物中立體結(jié)構(gòu)大的活性成分。因此，使用葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)苷酶、淀粉酶等斷裂糖苷鍵，改變理化性質(zhì)，提高效用[5-6]。酶解法高效，條件溫和，操作簡(jiǎn)單，能更好提升產(chǎn)率更利于工業(yè)生產(chǎn)。纖維素酶、果膠酶和α-淀粉酶是目前酶解常用的酶，其中纖維素酶是一種復(fù)合酶，能夠降解纖維素及纖維素衍生物；果膠酶可以降解細(xì)胞間的果膠質(zhì),使細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來(lái)；α-淀粉酶可以斷裂淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵[7-10]。

為探索一種綠色方法來(lái)提高巫山淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C的含量，達(dá)到綠色高效提取的目的，作者將酶解與大孔樹(shù)脂純化相結(jié)合，在巫山淫羊藿提取物中分別加入α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶進(jìn)行酶解，經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后采用HPLC法測(cè)定巫山淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量；并初步研究巫山淫羊藿提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性[11]，為巫山淫羊藿有效成分的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

巫山淫羊藿提取物，安康市寶杰植化有限公司。

淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品、朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)品、α-淀粉酶，上海源葉生物科技有限公司；SCDLP液體培養(yǎng)基、卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；果膠酶、纖維素酶，河南美羅實(shí)業(yè)有限公司；乙腈、甲醇，山東禹王天下新材料有限公司；乙醇，天津天力化學(xué)試劑有限公司；AB-8大孔樹(shù)脂，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；KH-250DE型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱，海慧泰儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巫山淫羊藿提取物的酶解

稱(chēng)取巫山淫羊藿提取物3份，每份5 g，分別置于燒杯中，按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸餾水溶解；分別加入0.5%(以提取物溶液體積計(jì))的α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶，超聲1 h后繼續(xù)保溫(50 ℃)酶解8 h，即得巫山淫羊藿黃酮，分別命名為α-淀粉酶酶解物、果膠酶酶解物、纖維素酶酶解物。

1.2.2 巫山淫羊藿提取物的純化

取AB-8大孔樹(shù)脂4份，每份50 g，分別置于燒杯中，加入95%乙醇浸泡2 h；分別裝柱，蒸餾水清洗至無(wú)醇味。將巫山淫羊藿提取物、α-淀粉酶酶解物、果膠酶酶解物、纖維素酶酶解物分別上柱吸附，蒸餾水洗至無(wú)色后用8 BV 75%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，濃縮，于80 ℃烘箱中干燥6 h，分別得到巫山淫羊藿純化物、α-淀粉酶酶解純化物、果膠酶酶解純化物、纖維素酶酶解純化物。

1.2.3 HPLC法測(cè)定淫羊藿苷和朝藿定C的含量

1.2.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱(chēng)取1.0 mg淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品和朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，混勻，配制成0.1 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.2 供試溶液的制備

精密稱(chēng)取巫山淫羊藿提取物或純化物0.2 g于錐形瓶中，用20 mL 50%乙醇溶解，稱(chēng)重；超聲45 min，補(bǔ)足重量，混勻；取1.0 mL定容至10 mL容量瓶中，混勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾，即得供試溶液。

1.2.3.3 色譜條件[12]

BP-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 濾紙片法測(cè)定巫山淫羊藿提取物的抑菌活性

1.2.4.1 樣品溶液的制備

稱(chēng)取40 mg巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物，分別置于4個(gè)燒杯中，配制成10 mg·mL-1溶液；取直徑1 cm的圓形濾紙片放入上述溶液中浸泡2 h，備用。

1.2.4.2 固體培養(yǎng)基的制備

稱(chēng)取卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.55 g于玻璃瓶中，加入50 mL蒸餾水溶解，封瓶；沸水中加熱溶解至無(wú)沉淀，冷卻后倒入培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺(tái)凝固24 h，備用。

1.2.4.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取SCDLP液體培養(yǎng)基2.28 g于玻璃瓶中，加入60 mL蒸餾水溶解，封瓶；沸水中加熱溶解至無(wú)沉淀，冷卻后倒入培養(yǎng)管中；用移液管取金黃色葡萄球菌或大腸桿菌各1 mL至培養(yǎng)管中，于保溫箱中保溫24 h；取出，用移液管取0.5 mL至固體培養(yǎng)基上，用涂布器涂抹均勻，再將浸泡2 h的圓形濾紙片放在上面，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液在色譜條件下的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和供試溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of complexed standard solution(a) and test solution(b)

由圖1可知，在色譜條件下，樣品各成分分離良好，理論板數(shù)按朝藿定C色譜峰計(jì)算不低于2 000。

2.2 線性關(guān)系

制備濃度分別為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c， μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=14296c-46141，R=0.9994，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1；朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11355c-17916，R=0.9993，線性范圍0.02～0.1 mg·mL-1。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

按1∶1配制50 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.74%、1.77%。表明，儀器精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的巫山淫羊藿提取物，按1.2.3.2方法制備供試溶液，平行制備6份，在色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.35%、1.65%。表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試溶液，在室溫、色譜條件下進(jìn)樣，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算得到淫羊藿苷和朝藿定C峰面積的RSD值分別為1.71%、1.24%。表明，供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的巫山淫羊藿提取物6份，分別加入一定量的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品和朝藿定C標(biāo)準(zhǔn)品，制備供試溶液，在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，淫羊藿苷和朝藿定C的加標(biāo)回收率的RSD值分別為1.09%、2.19%。表明該方法的準(zhǔn)確度較好，可用于淫羊藿苷和朝藿定C的含量測(cè)定。

2.7 樣品測(cè)定

分別稱(chēng)取巫山淫羊藿提取物、α-淀粉酶酶解純化物、果膠酶酶解純化物、纖維素酶酶解純化物，按1.2.3.2方法制備供試溶液，在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算淫羊藿苷和朝藿定C的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 巫山淫羊藿提取物及其酶解純化物中淫羊藿苷和朝藿定C的含量/%

由表2可知，巫山淫羊藿提取物在經(jīng)過(guò)酶解和大孔樹(shù)脂純化后，淫羊藿苷和朝藿定C的含量均明顯增加，其中果膠酶對(duì)兩者含量的影響最大，巫山淫羊藿提取物在經(jīng)過(guò)果膠酶酶解和大孔樹(shù)脂純化后，淫羊藿苷含量為11.65%，朝藿定C含量為31.79%。

2.8 抑菌活性

巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

(a)金黃色葡萄球菌 (b)大腸桿菌

由圖2可知，巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物、果膠酶酶解純化物對(duì)金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌效果，其中巫山淫羊藿提取物的抑菌效果最強(qiáng)(圖2a)；果膠酶酶解純化物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不明顯，巫山淫羊藿提取物、巫山淫羊藿純化物、果膠酶酶解物對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌效果(圖2b)。總體來(lái)看，未酶解的巫山淫羊藿提取物的抑菌活性?xún)?yōu)于酶解物和純化物。

3 結(jié)論

巫山淫羊藿提取物在經(jīng)過(guò)酶解和大孔樹(shù)脂純化后，淫羊藿苷和朝藿定C的含量均明顯增加，其中果膠酶對(duì)兩者含量的影響最大，巫山淫羊藿提取物在經(jīng)過(guò)果膠酶酶解和大孔樹(shù)脂純化后，淫羊藿苷含量為11.65%，朝藿定C含量為31.79%。巫山淫羊藿提取物及果膠酶酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑菌效果，但未酶解的巫山淫羊藿提取物的抑菌活性?xún)?yōu)于酶解物和純化物，原因有待進(jìn)一步深入研究。