吳曉光，楊傳熙，張 晶，趙 錕，孫 偉，孔祥清*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京210029；2同濟大學醫(yī)學院，同濟大學附屬楊浦醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海200090

肥胖是全球范圍內(nèi)的一種健康問題，能引起多種疾病，如代謝綜合征（高血脂、高三酰甘油血癥和2型糖尿病等）、心血管疾病、慢性炎性反應和腫瘤等，嚴重威脅人類健康［1］。大鼠脂肪來源的間充質(zhì)干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC）具有很強的增殖潛能，同時能夠定向分化為成骨細胞、肌源性細胞和脂肪細胞［2］。成熟脂肪細胞的形成有兩個關鍵步驟，即成熟期和終末分化期。ADSC在成熟期中被誘導成前脂肪細胞，在終末分化期定向分化為脂肪細胞［3］。脂肪分化過程受到多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如過氧化物增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα）和脂蛋白脂肪酶等［3］。除此之外，由于成脂分化伴隨脂肪生成，所以負責脂肪生成的酶，例如脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）也被認為是脂肪生成的重要標志。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是體內(nèi)非常重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定系統(tǒng)。RAS在體內(nèi)分布非常廣泛，不僅存在于循環(huán)系統(tǒng)中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管壁、腎臟、腎上腺等也有廣泛分布［4］。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中的主要活性物質(zhì)，是前體物質(zhì)血管緊張素原在腎素作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ），再由血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin onverting enzyme，ACE）催化生成。AngⅡ可以在胞外血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）作用下轉(zhuǎn)化成血管緊張素1-7［angiotensin（1-7），Ang（1-7）］，通過與Mas受體（一種G蛋白偶聯(lián)受體）的相互作用，Ang（1-7）通常拮抗AngⅡ的作用［5］。Ang（1-7）可以脫羧成一種叫Alamandine的肽。有趣的是，Alamandine被發(fā)現(xiàn)是Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體D（mas associated G protein coupled receptor D，MrgD）的內(nèi)源性配體［6］。RAS同樣也是能量代謝的一個重要調(diào)節(jié)因子，在代謝紊亂如肥胖和胰島素抵抗中起作用［7］。脂肪組織是一種高度活躍的代謝和內(nèi)分泌器官，是RAS成分的來源之一。另一方面，AngⅡ受體和Mas受體在脂肪細胞共表達，意味著局部RAS系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)脂肪細胞功能［8］。

已有研究表明，在人和小鼠3T3-L1前體脂肪細胞中，Ang（1-7）-Mas信號通過激活PI3K/Akt和抑制MAPK激酶/ERK途徑促進脂肪生成，Ang（1-7）-Mas是通過抑制AngⅠ-AT1觸發(fā)的MAPK激酶/ERK途徑拮抗AngⅠ-AT1的抗脂肪生成作用［9］。AngⅠ/AT1-ACE2-Ang（1-7）/Mas軸對脂肪形成的自分泌調(diào)節(jié)也已被揭示，表明了局部調(diào)節(jié)微妙平衡的RAS對脂肪形成的重要性及其作為肥胖癥和相關代謝紊亂的新治療靶點的潛力［8］。然而Alamandine對于脂肪生成的效應尚且未知。因此，闡明Alamandine在ADSC成脂分化過程中的分子機制可能為肥胖癥等代謝性疾病的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基（MSCM）（Gibco公司，美國），間充質(zhì)干細胞-脂肪細胞分化培養(yǎng)基（MADM，Scien Cell公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum FBS）、青霉素、鏈霉素（Biological Industries公司，以色列），膠原酶1型（上海Biosharp公司），油紅O、甘油三酯檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（上海碧云天），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），BSA（ICN生物醫(yī)學化學藥品公司，美國），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司），β-actin抗體、ACC抗體、C/EBP-α抗體、PPAR-γ抗體、FAS抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），Alamandine（上海Phoenix Pharmaceuticals公司），AngⅡ（Sigma公司，美國），Dpro7（Bachem公司，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮下間充質(zhì)脂肪干細胞提取和培養(yǎng)

取6～8周Sprague-Dawley（SD）大鼠腹股溝皮下脂肪，用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3次，去除脂肪組織中可見的血管和結(jié)締組織，將脂肪組織剪成1 mm3碎塊。加入適量膠原酶消化液（1 mg/mLⅠ型膠原酶，1%BSA）。37℃恒溫搖床充分消化30 min，完全培養(yǎng)基（DMEM，10%FBS）終止消化。100目分子篩過濾，1 000 r/min離心10 min，去除懸浮的脂肪細胞和脂滴。PBS洗滌離心2次，用MSCM（含5%FBS）重懸。血細胞計數(shù)板計數(shù)，按5×107個/L的濃度將細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，標記為F0代。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后用預溫的PBS洗2次，加入3 mL完全MSCM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，以去除懸浮細胞。當細胞生長匯合度達80%時進行傳代培養(yǎng)。取F2代細胞，開始用MADM（5%FBS，5%間充質(zhì)干細胞脂肪分化生長因子，1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)（定義為day1）。以后每2 d換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 ADSC干預

取F2代ADSC，PBS沖洗，加無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓12 h。進行隨機分組：Alamandine不同濃度組（0、0.1、1.0、10.0 μmol/L），Western blot檢測ADSC中ACC、FAS、PPAR-γ、CEBP-α蛋白表達水平，油紅O染色、光鏡觀察脂肪細胞分化情況和細胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇測定，根據(jù)得出的Alamandine最適濃度進行以下實驗：Alamandine不同處理時間組：向無血清培養(yǎng)基中添加/不添加10 μmol/L Alamandine分別處理ADSCs 1、3、6、10 d；Sham組：無血清培養(yǎng)基；Alamandine組：含10 μmol/L Alamandine的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ組：含1 μmol/L AngⅡ的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ+Alamandine組：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Alamandine的無血清培養(yǎng)基；Alamandine+D-pro7組：含10 μmol/L Alamandine和10 μmol/L D-pro7的無血清培養(yǎng)基；AngⅡ+Alamandine+Dpro7組：含1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Alamandine，10 μmol/L D-pro7的無血清培養(yǎng)基。以上實驗各重復3次。

1.2.3 Western blot

細胞用預冷的PBS清洗2遍，加入適量新制的磷酸酶/蛋白酶抑制劑與RIPA蛋白裂解液的混合物，刮除細胞置于冰上充分裂解30 min，4℃離心20 min，收集上清，檢測蛋白含量。蛋白定量后加入上樣緩沖液100℃水浴變性。蛋白等量上樣，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在含5%BSA的TBST封閉2 h后，一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗滌條帶3次后，用辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育2 h。再次洗滌3～4次，增強化學發(fā)光法進行蛋白顯影。

1.2.4 油紅O染色

4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗滌3次，加入過濾后的油紅O染料（1.8 mg/mL油紅O和60%（V/V）溶于雙蒸水的異丙醇）染色60 min。雙蒸水洗滌3次后，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 細胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇測定

細胞甘油三酯含量測定采用脂肪細胞分化檢測試劑盒，在大鼠ADSC分化10～12 d后，細胞用PBS重復洗2次，刮除，超聲處理以使懸浮液均勻化，測定細胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量。用蛋白試劑盒測定這些細胞的總蛋白濃度，作為內(nèi)部對照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，所有實驗均重復3次，結(jié)果以均值依標準差（±s）表示，采用軟件Graphpad prism 7繪制圖表。數(shù)據(jù)處理時，計量資料經(jīng)檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Alamandine對大鼠ADSC有促成脂分化效應且成劑量依賴性

ADSC向成熟脂肪細胞的轉(zhuǎn)化需要多種轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)節(jié)。其中，PPAR-γ被認為是最基本的轉(zhuǎn)錄因子。在誘導分化10～12 d后，許多成纖維細胞樣紡錘形大鼠ADSC分化成為成熟的脂肪細胞，光鏡下可以看到成熟脂肪細胞成球形且胞質(zhì)內(nèi)有脂滴積聚（圖1A），且隨著Alamandine劑量的增加，脂肪細胞的數(shù)量也在增加。脂質(zhì)積聚是脂肪形成程度的一個指標，可通過脂滴的油紅O染色進行評估，還可通過直接測量細胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量進行定量評估。在分化過程中外源性施用Alamandine顯著增加了脂肪細胞的比例（圖1B），以及胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量，與Sham組相比，隨著Alamandine濃度的升高，總膽固醇以及甘油三酯水平也在升高，其中10 μmol/L Alamandine處理組的總膽固醇以及甘油三酯水平最高，且差異有統(tǒng)計學意義（n=3，P＜0.05，圖1C）。同樣，Alamandine增加了脂肪細胞生成標志物PPAR-γ、CEBP-ɑ、FAS、ACC的表達（圖1D、E），與Sham組相比，10 μmol/L Alamandine處理組在4種成脂分化相關蛋白檢測上的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，n=3），故選用10 μmol/L Alamandine作為最適濃度。

圖1 Alamandine對大鼠ADSC有促成脂分化效應且成劑量依賴性Figure 1 Alamandine can promote lipid differentiation in a dose-dependent manner in ADSC

2.2 Alamandine促進大鼠ADSC成脂分化且成時間依賴性

選取10 μmol/L濃度的Alamandine作用于大鼠ADSC，與空白對照一起，在第1、3、6、10天測定成脂分化程度。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，誘導第1、3天的ADSC脂肪細胞生成標志物PPAR-γ、C/EBP-ɑ、FAS、ACC表達略有升高，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05，n=3），誘導第6、10天的脂肪細胞生成標志物表達水平相比空白對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，n=3），且誘導第10天脂肪細胞生成標志物水平最高（圖2A、B）。倒置顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)脂滴含量同樣隨著誘導時間的延長而增加（圖2C）。

圖2 Alamandine促進大鼠ADSC成脂分化且成時間依賴性Figure 2 Alamandine promoted adipogenic differentiation of ADSCs in a time-dependent manner

2.3 AngⅡ拮抗了Alamandine對大鼠ADSC的成脂分化效應

之前有研究表明，AngⅡ?qū)θ说闹鹃g充質(zhì)干細胞有抑制成脂分化的效應，而在大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞上則沒得到驗證。正如預期的那樣，在加入AngⅡ后，大鼠ADSC成脂分化效應減弱，AngⅡ組相較于Sham組，成脂分化相關蛋白表達水平明顯降低，細胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇水平同樣降低且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，n=3，圖3A～C）。光鏡及油紅O染色觀察脂肪細胞分化情況，（圖3D、E），同樣發(fā)現(xiàn)AngⅡ抑制成脂分化。可以得出AngⅡ是通過作用于ADSC的AT1受體達到抑制成脂分化的效應［5］。有趣的是，在AngⅡ和Alamandine共處理大鼠ADSC后，AngⅡ減弱了Alamandine對大鼠ADSC的促成脂分化效應。

圖3 AngⅡ拮抗Alamandine對大鼠ADSC的成脂分化Figure 3 AngⅡantagonism Alamandine for differentiation of ADSC into fat effect in rats

2.4 Alamandine通過作用于大鼠ADSC MrgD受體達到促成脂分化效應

為了驗證Alamandine是否通過作用于大鼠ADSC的MrgD受體達到促成脂分化的效應，應用了MrgD受體拮抗劑D-pro7。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，Alamandine+D-pro7組相較于Alamandine組，脂肪細胞生成標志物CEBP-α、PPAR-γ、ACC、FAS表達水平明顯降低（圖4A、B），總膽固醇和甘油三酯含量也明顯降低（圖4C），且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，n=3），油紅O染色和光鏡觀察提示脂肪細胞數(shù)量也顯著減少（圖4D、E）。綜上，Alamandine是通過作用于MrgD來起到促進成脂分化的作用。AngⅡ+Alamandine+Dpro7組與AngⅡ+Alamandine相比脂肪細胞生成標志物水平以及甘油三酯，總膽固醇水平均明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0，05，n=3），提示D-pro7與AngⅡ具有協(xié)同效應，均能抑制成脂分化。

圖4 Alamandine通過作用于大鼠ADSC MrgD受體促進成脂分化Figure 4 Alamandine promotes lipid differentiation by acting on the MrgD receptor of ADSC in rat

3 討論

脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞是一類易于獲得、增殖和分化能力強大的成體間充質(zhì)干細胞［10］。肥胖是全球發(fā)病率非常高的疾病，會誘發(fā)心血管疾病、高血壓、糖尿病和腫瘤等多種疾?。?1］。目前認為，肥胖是白色脂肪細胞肥大，增生和脂肪形成共同作用的結(jié)果。脂肪組織內(nèi)的ADSC是體內(nèi)新生脂肪細胞的重要來源。因此，ADSC過度的成脂分化被認為是導致肥胖的重要原因［12］。

RAS是控制身體電解質(zhì)和血壓平衡穩(wěn)態(tài)的激素回路［13］。AngⅡ是這個激素回路中的核心物質(zhì)，在成人組織中，AngⅡ的主要靶點是1型受體（AT1），由多種細胞表達，包括內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，AngⅡ以AT1依賴的方式引起炎癥和纖維化［14］。而Ang（1-7）和Alamandine作為一種有益的系統(tǒng)，它們分別與Mas和MrgD受體相互作用，對抗AngⅡ/AT1軸的有害影響［15］。局部組織產(chǎn)生的血管緊張素原和它的加工酶存在于腎臟、大腦、心臟、胰腺和脂肪組織等多個器官中［16］。實驗研究表明，在脂肪組織中表達的RAS與脂肪細胞形成的調(diào)節(jié)有關，且AngⅡ?qū)χ拘纬善鸬截撔哉{(diào)節(jié)的作用［17］。

MrgD受體主要表達于背根神經(jīng)節(jié)和感覺神經(jīng)節(jié)，在小腦、棕色脂肪、白色脂肪和胃腸道中有少量表達［5］，MrgD受體最初被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)疼痛有關，除了與鈣釋放和磷酸激酶A激活有關外，MrgD信號轉(zhuǎn)導尚不清楚［18］。既往研究發(fā)現(xiàn)，Ang（1-7）對ADSC有促進成脂分化的作用［8］。而Alamandine是Ang（1-7）脫羧形成的多肽，盡管二者結(jié)構(gòu)相似，但是卻作用于不同的受體，Ang（1-7）作用于Mas受體，而Alamandine作用于MrgD受體。Alamandine一般與AngⅡ相拮抗，發(fā)揮保護性作用。例如Alamandine通過MrgD，抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大［19］，以及Alamandine通過MrgD受體保護心臟免受再灌注損傷［20］。研究表明，Mas敲除小鼠在阻斷AT1受體后引起的抗肥胖效應更顯著［21］，但是Alamandine對于ADSC的成脂分化的影響卻尚未給予太多關注，本文首次闡明Alamandine對大鼠脂肪來源間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，Alamandine這種Ang（1-7）脫羧形成的新型肽，能夠顯著促進大鼠皮下ADSC成脂分化，成脂分化相關蛋白標志物水平增加呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，細胞內(nèi)脂滴含量、甘油三酯以及膽固醇水平同樣在Alamandine誘導后增加，而AngⅡ抑制了大鼠ADSC的成脂分化。為了繼續(xù)探究Alamandine促進大鼠ADSC成脂分化的機制，在運用Alamandine的作用受體——MrgD受體的拮抗劑D-Pro7后，Alamandine促進ADSC成脂分化效應被顯著減弱，證實了Alamandine是通過作用于MrgD受體來發(fā)揮成脂分化效應的。但尚未在動物水平上繼續(xù)驗證Alamandine對成脂分化或是肥胖的影響，需要進一步的驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Alamandine能夠促進大鼠ADSC的成脂分化，其機制與其受體MrgD的相互作用有關。這項研究結(jié)果的啟示性在于，抑制脂肪間充質(zhì)干細胞MrgD受體的表達可能為肥胖癥的治療提供一些新的思路。