周子欣，楊旭樂，張 許，李 仲

南京醫(yī)科大學罕見代謝性疾病研究重點實驗室，南京醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，江蘇省人類功能基因組重點實驗室，江蘇 南京211166

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是在全球范圍內(nèi)引起慢性肝病的主要原因，其典型特征為：在沒有大量攝入酒精、感染病毒或其他明確病因的情況下，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)中性脂肪堆積，主要為甘油三酯。作為一類進行性疾病，NAFLD的病程可由非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌，直至死亡［1-3］。肝臟作為脂類代謝的重要臟器，是脂肪酸、膽固醇和脂蛋白合成的樞紐，若β-氧化、極低密度脂蛋白分泌、脂肪酸合成等生物途徑發(fā)生改變，或外周血非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）增加，均可引起脂肪肝。

不僅如此，肝臟脂代謝過程還受到更復雜的分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)。研究表明，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBP）家族包含由2個基因編碼的3種蛋白。其中，SREBP1基因在不同的啟動子作用下可編碼產(chǎn)生SREBP-1a和SREBP-1c，而SREBP2基因則編碼SREBP2。Shimomura等［4］發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c是SREBP分布在小鼠和人類多個組織內(nèi)的主要形式，在肝臟、白色脂肪、骨骼肌、腎上腺及腦組織中高表達，參與脂肪酸和甘油三酯代謝；而SREBP-1a則主要分布在脾臟及小腸組織，參與調(diào)控細胞增殖及脂質(zhì)代謝。SREBP在剪切后發(fā)揮作用。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，SREBP與SREBP裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）結(jié)合形成復合體，經(jīng)過外殼蛋白復合物（coat protein complexⅡ，COPⅡ）介導的囊泡運輸，轉(zhuǎn)移至高爾基體，先后經(jīng)過蛋白酶S1P、S2P的剪切，形成具有活性的SREBP剪切體。多種脂質(zhì)攝取及合成酶序列的啟動子含有固醇調(diào)節(jié)元件（sterol regulatory element，SRE），SREBP剪切體入核后可與SRE相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)脂代謝［4-5］。

既往報道顯示，去泛素化酶YOD1是卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶（OTU）家族的一員，其UBX結(jié)構(gòu)域可與含纈酪肽蛋白VCP（又稱P97或CDC48）形成復合物，使折疊錯誤的蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分離［6］。在酵母細胞中，YOD1的同源異構(gòu)體OUD1可被VCP招募，使轉(zhuǎn)錄因子STP23（哺乳動物NF-κB的同源物）去泛素化而活化，從而調(diào)節(jié)酵母細胞內(nèi)不飽和脂肪酸的穩(wěn)態(tài)［7-8］。除了脂肪酸代謝外，研究還發(fā)現(xiàn)，YOD1參與了免疫調(diào)節(jié)及腫瘤免疫等多種生物過程［9-10］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)后，小鼠肝臟中的YOD1表達下降。本研究為了探索YOD1在肝細胞營養(yǎng)代謝中的作用，分別檢測了短期高脂飲食小鼠、db/db小鼠肝臟中以及經(jīng)OA處理后的Hepa1-6細胞內(nèi)YOD1的表達水平，并觀察了其在小鼠體內(nèi)的組織分布以及小鼠在不同營養(yǎng)狀態(tài)下的表達情況，并在Hepa1-6細胞中過表達YOD1，經(jīng)OA處理后觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況，檢測下游相關(guān)基因，為進一步揭示去泛素化酶YOD1在肝臟脂質(zhì)代謝中的功能及作用提供新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

db/db雄性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），實驗動物的使用及操作均獲得南京醫(yī)科大學倫理委員會批準（批準編號：IACUC-1901025）。抗Calnexin抗體（Stress gen公司，加拿大），抗Flag抗體、抗SREBP-1c抗體（Cell Signaling公司，美國），抗Insig-1抗體（Abcam公司，美國）；蛋白marker（Bio-Rad公司，美國）；TRIzol、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美國）；引物由上海捷瑞基因有限公司合成；甘油三酯檢測試劑盒（北京普利萊生物公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；SYBR GreenⅠMaster（Roche公司，瑞士）；脫脂奶粉（青島MDBio公司）；Hepa1-6細胞（ATCC細胞庫，美國）；腺病毒（上海漢恒生物科技有限公司）；60 kcal%高脂飼料（D12492）（Research Diets公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和處理

選取4周齡C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常飲食組及高脂飲食組，每組各8只，喂養(yǎng)4周后摘取肝臟組織［11］。對8周齡C57BL/6雄性小鼠進行饑餓再喂食造模［12］，分別給予小鼠如下處理：正常飲食、饑餓24 h以及饑餓24 h后再喂食12 h，每組隨機納入6只小鼠，處理結(jié)束后摘取小鼠肝臟。

1.2.2 Hepa1-6細胞培養(yǎng)和處理

在5% CO2的37℃的環(huán)境下，給予Hepa1-6細胞10%胎牛血清的高糖DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)。以pcDNA3.3質(zhì)粒為載體，構(gòu)建YOD1過表達質(zhì)粒。使用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體LipofectamineTM2000與質(zhì)粒，LipofectamineTM2000與質(zhì)粒按照2∶1的比例分別配置轉(zhuǎn)染液并混勻，加入細胞培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)染細胞4～6 h后換液。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR（Q-PCR）

勻漿機、離心機4℃預冷。將1 mL TRIzol加入勻漿管內(nèi)，置于冰上預冷。切取小鼠肝臟，加入TRIzol中勻漿。向勻漿管內(nèi)加入200 μL氯仿，劇烈震蕩30 s，并靜置5 min。12 000g離心30 min，轉(zhuǎn)移上清至潔凈EP管中（細胞RNA提取：500 μL TRIzol，100 μL氯仿）。向管內(nèi)加入等量異丙醇，輕柔混勻，靜置10 min，10 000g離心10 min，棄上清保留沉淀，加入預冷的75%DEPC乙醇，10 000g離心10 min洗滌RNA沉淀，棄上清，晾干至乙醇揮發(fā)。加入DEPC水溶解沉淀，并使用儀器Nano drop測濃度。

逆轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 1 μg與DEPC水共計5.5 μL，反應液（5×）2 μL，RNA酶抑制劑（20 U/μL）0.5 μL，dNTP混合液（10 mmol/L）1 μL，隨機引物0.5 μL。逆轉(zhuǎn)錄程序如下：95℃預變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸1 min，返回上一步循環(huán)40次，95℃變性1 min。取出cDNA樣品，置于4℃保存。

Q-PCR體系如下：互補DNA（cDNA）1 μL，SYBR Green染料5 μL，上游引物（2.5 mol/L）0.75 μL，下游引物（2.5 mol/L）0.75 μL，去離子水2.5 μL。QPCR程序如下：95℃預變性，10 min；95℃變性，15 s；60℃退火延伸，60 s；循環(huán)40次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法

勻漿機、離心機4℃預冷。配制組織裂解液，4℃預冷。向EP內(nèi)加入500 μL裂解液，切取小鼠肝臟組織，浸入其中，并勻漿。而6孔板細胞蛋白提取步驟如下：棄培養(yǎng)液，預冷PBS溶液輕柔洗去殘留培養(yǎng)液，加入適量裂解液，冰上裂解30 min。隨后，10 000g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至潔凈EP管中。使用Thermo試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線，計算得到蛋白濃度。

配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，過夜后使用。將上樣緩沖液（5×）與蛋白樣品混勻，金屬浴95℃加熱10 min，蛋白充分變性后置于冰上，并逐一上樣。調(diào)節(jié)電壓至80 V，待樣品通過濃縮膠后，增加電壓至120 V，繼續(xù)電泳。結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，預先裁剪PVDF膜，甲醇激活后使用，貼合膜布與凝膠，并除氣泡，以濕轉(zhuǎn)“三明治”結(jié)構(gòu)，在100 V、1 h的條件下轉(zhuǎn)膜。配制5%牛奶溶液，將PVDF膜浸入，室溫封閉60 min。

取出預先以1%BSA抗體稀釋液配置的一抗，置于冰上，將PVDF膜置于塑封膜內(nèi)，加入一抗，熱合封閉塑封膜，置于搖床上，4℃過夜，使一抗與目的蛋白充分結(jié)合。次日，取出PVDF膜，回收抗體、洗膜，并配置二抗。室溫條件下，使PVDF膜結(jié)合二抗，孵育1 h，并洗膜。將ECL發(fā)光液均勻滴加在PVDF膜上，曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，并作圖。所示數(shù)據(jù)均以均數(shù)依標準差（±s）的形式表示。組間比較采用Studentt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 短期高脂飲食降低C57BL/6小鼠肝臟中YOD1的表達水平

前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)后，小鼠肝臟中的YOD1表達下降?；诖?，首先檢測了短期高脂飲食的小鼠肝臟中YOD1的表達情況，并發(fā)現(xiàn)短期高脂飲食可降低C57BL/6小鼠肝臟中YOD1表達水平（圖1A）。接下來，又檢測了遺傳性肥胖的db/db小鼠肝臟，與db/+小鼠相比，YOD1的表達水平并未觀察到改變（圖1B），提示YOD1的表達變化并非遺傳因素所致。為了進一步明確YOD1是否受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)，利用單不飽和脂肪酸油酸（oleic acid，OA，200 μmol/L）處理Hepa1-6細胞16 h后，通過使用QPCR檢測YOD1的表達水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過OA處理后，細胞內(nèi)的YOD1表達水平顯著下降（圖1C）。

圖1 短期高脂飲食可降低C57BL/6小鼠肝臟中的YOD1的表達水平Figure 1 Short-term HFD could reduce the expression level of YOD1 in the liver of C57BL/6 mice

2.2 YOD1的表達水平受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控

為了明確YOD1的組織分布情況，提取了C57BL/6小鼠多個組織器官的RNA。利用Q-PCR的方法檢測白色脂肪組織、棕色脂肪組織、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺中YOD1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)YOD1在肝臟中表達豐度最高（圖2A），進一步提示YOD1可能在肝臟中發(fā)揮重要作用。為驗證YOD1是否參與肝臟中的營養(yǎng)代謝，對C57BL/6小鼠進行禁食后再喂食處理，并觀察到禁食24 h后，小鼠肝臟YOD1表達水平顯著升高，再喂食后又顯著下降（圖2B）。上述結(jié)果提示，YOD1受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控，并可能參與肝臟營養(yǎng)代謝。

圖2 YOD1在C57BL/6小鼠肝臟中的表達受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控Figure 2 The expression of YOD1 in C56BL/6 mice was regulated by nutritional status

2.3 過表達YOD1的Hepa1-6細胞中OA誘導的脂質(zhì)堆積明顯減少

為了進一步探索YOD1在肝細胞中的功能，通過構(gòu)建YOD1質(zhì)粒，在Hepa1-6細胞中過表達目的基因，并給予Hepa1-6細胞OA處理。通過甘油三酯試劑盒檢測細胞中甘油三酯含量，結(jié)果顯示與空載對照組相比，過表達YOD1的Hepa1-6細胞內(nèi)，甘油三酯含量顯著降低（圖3A）。同時，對經(jīng)過OA處理后的Hepa1-6細胞進行油紅染色，鏡下觀察到過表達YOD1的Hepa1-6細胞內(nèi)，脂滴數(shù)量明顯減少，且體積亦變?。▓D3B），與細胞內(nèi)甘油三酯含量的變化趨勢相一致。

使用脂質(zhì)體將YOD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入Hepa1-6細胞后，使用200 μmol/L的OA處理Hepa1-6細胞16 h。A：利用甘油三酯試劑盒檢測Hepa1-6細胞內(nèi)甘油三酯含量，兩組比較，*P＜0.05（n=3）；B：Hepa1-6細胞經(jīng)過OA處理后，使用10%多聚甲醛固定細胞，異丙醇溶液漂洗，使用油紅染料在室溫下染色10 min（×20）。

2.4 過表達YOD1抑制SREBP-1c的剪切

由于過表達YOD1后，Hepa1-6細胞內(nèi)的甘油三酯含量顯著下降，且脂質(zhì)堆積明顯減少。因此，初步推測，過表達YOD1后，可能引起Hepa1-6細胞中脂質(zhì)合成減少。根據(jù)文獻報道，SREBP家族的蛋白分子SREBP-1c作為轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)過剪切入核后，通過結(jié)合啟動子含有SRE序列的下游基因，可以激活乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶以及甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶等關(guān)鍵酶，從而促進脂肪酸及甘油三酯的合成［4］。

據(jù)此，首先在Hepa1-6細胞內(nèi)過表達YOD1并使用OA（200 μmol/L）處理16 h后，通過蛋白免疫印跡法檢測其表達效率，可知YOD1過表達成功（圖4A）。進一步檢測細胞內(nèi)SREBP-1c的mRNA水平，與空載對照組相比，過表達YOD1后，SREBP-1c的總mRNA水平并未觀察到變化（圖4B）。由于SREBP-1c蛋白需要先后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體上經(jīng)過剪切，才能以具有活性的剪切體形式入核發(fā)揮作用［4-5］。接下來，進一步通過蛋白免疫印跡法檢測SREBP-1c的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)過表達YOD1后，SREBP-1c前體的表達水平?jīng)]有變化，但是SREBP-1c剪切體表達水平明顯降低（圖4C）。提示過表達YOD1抑制SREBP-1c的剪切，從而影響下游脂代謝。

圖4 Hepa1-6細胞內(nèi)過表達YOD1可抑制SREBP-1c的剪切Figure 4 YOD1 overexpression in Hepa1-6 cell line inhibitedSREBP-1c cleavage

3 討論

隨著工業(yè)化進程的發(fā)展，人們的生活方式和飲食習慣的改變，NAFLD及與之相伴的肥胖、糖尿病和代謝綜合征愈加多見。近十年來，NAFLD在亞洲流行率逐年增長，由1995—2005年的25.28%增至2012—2017年的30.90%，且患者普遍預后較差，成為公共衛(wèi)生難題［13］。肝臟脂質(zhì)合成的異常激活往往與肥胖、代謝紊亂的發(fā)生機制相關(guān)，尤其多見于NAFLD。在病理狀態(tài)下，肝臟由于慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并伴隨著未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），隨著SREBP-1c激活，脂肪變性、細胞應激和炎癥反應加劇，導致病程發(fā)展［4］。最近研究發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶USP20可以通過調(diào)節(jié)mTORC1-HMGCR軸調(diào)控肝臟中的膽固醇代謝，提示在肝臟中去泛素化酶在肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用［14］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)后，小鼠肝臟中的YOD1表達下降。本研究首先檢測了高脂飲食小鼠肝臟中YOD1的表達水平，并觀察到短期高脂飲食可誘導YOD1表達下調(diào)。但在正常飲食的遺傳性肥胖的db/db小鼠肝臟中未觀察到Y(jié)OD1表達水平的變化。另外，通過OA處理Hepa1-6細胞，觀察到細胞內(nèi)YOD1的mRNA水平也出現(xiàn)顯著下降。接下來，進一步明確了YOD1在C57BL/6小鼠體內(nèi)的組織分布情況，發(fā)現(xiàn)其在肝臟中表達豐度最高，提示YOD1在肝臟內(nèi)可能發(fā)揮重要作用。同時，對C57BL/6小鼠進行饑餓再喂食的處理，觀察到饑餓后，小鼠肝臟中的YOD1表達水平顯著增加，而再次喂食后，YOD1表達明顯減少，綜合以上結(jié)果，提示YOD1在肝臟中的表達受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控。為探索該基因在肝臟中的作用，在Hepa1-6細胞中過表達YOD1，并使用OA處理細胞。本研究觀察到，過表達YOD1后，細胞內(nèi)甘油三酯含量顯著下降；而油紅染色顯示，過表達YOD1后，細胞內(nèi)脂滴變小、數(shù)量明顯減少，提示YOD1影響肝細胞內(nèi)的脂代謝。由于SREBP-1c在肝臟脂肪酸及甘油三酯的代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過Q-PCR在經(jīng)OA處理的細胞中，發(fā)現(xiàn)過表達YOD1并不影響SREBP-1c的mRNA水平。既往研究已經(jīng)揭示了SREBP-1c蛋白需經(jīng)過剪切方可活化的現(xiàn)象，進一步通過蛋白免疫印跡法檢測蛋白水平，發(fā)現(xiàn)過表達YOD1后SREBP-1c剪切體表達水平明顯下調(diào)。結(jié)合本研究中過表達YOD1的Hepa1-6細胞經(jīng)OA處理后，其甘油三酯含量較對照組出現(xiàn)顯著下降的結(jié)果，提示過表達YOD1可抑制SREBP-1c的剪切減少細胞中脂肪酸和甘油三酯的合成，從而降低細胞中脂質(zhì)的積累。

SREBP-1c具有bHLH-zip（basic-helix-loop-helix leucine zipper）結(jié)構(gòu)，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游基因前，需要在高爾基體上進行剪切。首先，絲氨酸蛋白酶S1P在前體SREBP-1c兩個跨膜結(jié)構(gòu)域之間的環(huán)區(qū)進行切割，分離出N端的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域。為鋅離子依賴的金屬蛋白酶S2P提供底物，在S2P作用下，將bHLH結(jié)構(gòu)域從高爾基體膜上游離下來，形成具有活性的核型SREBP-1c片段。入核后，SREBP-1c作為轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合靶基因啟動子中SRE元件，可激活乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）硬脂酰CoA去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）以及甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol 3-phosphate acyltransferase，GPAT）等，并最終促進脂肪酸及甘油三酯的合成［4-5］。

本研究現(xiàn)階段的結(jié)果表明，去泛素化酶YOD1主要分布在肝臟，其表達水平受營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)控，在Hepa1-6細胞中過表達YOD1，可以使OA誘導的脂質(zhì)堆積明顯減少，并抑制SREBP-1c的剪切，提示YOD1可能對于SREBP-1c信號通路下游基因的表達也有影響，我們將在后續(xù)實驗中進一步驗證。對YOD1的研究將為進一步了解肝臟中脂質(zhì)代謝的調(diào)控機制提供新的思路。