李蘭蘭，陳 欣，張恒璐，王 敏，陸衛(wèi)平

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 淮安223300

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，是終末期腎病的主要原因，增加了糖尿病患者的死亡率［1］。DN的病理特征主要表現(xiàn)為腎小球肥大，基底膜增厚，足細(xì)胞凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)沉積等。研究表明，30%～40%的糖尿病患者并發(fā)DN。DN的發(fā)病因素多樣，包括高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素Ⅱ、氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子等［2］。由于DN具體發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚不明確，治療方法有限，主要包括控制血糖、控制血壓和控制血脂等，但眾多DN患者仍然不可避免地發(fā)展為終末期腎病［3］，因此，探索DN的發(fā)病機(jī)制和尋找其治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的非編碼長(zhǎng)鏈RNA［4］。研究表明，lncRNA是多種生物過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與了增殖、纖維化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，在乳腺癌、骨肉瘤和胃癌等癌癥疾病和糖尿病等代謝性疾病中發(fā)揮了重要作用［5-9］。Yin等［10］發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1可以調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能，降低incRNA TUG1的表達(dá)后β細(xì)胞凋亡率增加，胰島素分泌減少，從而調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)生。目前，lncRNA在DN中的作用也逐漸顯現(xiàn)［6］，它可從影響腎纖維化［11］、介導(dǎo)腎臟炎癥［12］、調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞的增殖和凋亡［13］和足細(xì)胞損傷［14］等多方面參與DN的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期通過(guò)lncRNA芯片對(duì)DN小鼠和正常對(duì)照小鼠的腎組織進(jìn)行差異lncRNA篩選，發(fā)現(xiàn)lncRNA 127391在DN小鼠中較正常小鼠表達(dá)顯著降低，因此推測(cè)lncRNA127391可能在DN發(fā)生中發(fā)揮重要作用，并于前期成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDH-lncRNA 127391［15］。本 研 究 將 重 組 質(zhì) 粒pCDH-lncRNA 127391轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細(xì)胞（mice mesangial cell，MMC）細(xì)胞，并觀察MMC細(xì)胞的增殖和纖維化等指標(biāo)的變化。

1 材料和方法

1.1 材料

MMC（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體（Invitrogen公司，美國(guó)）；抗FN抗體、抗α-Tubulin抗體（Abcam公司，美國(guó)）；抗Col-1、抗CyclinD1抗體、抗PCNA抗體（Proteintech公司，美國(guó)）；CCK8試劑盒（Dojindo公司，日本）；Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

8周齡雄性C57BL/KSJ小鼠購(gòu)自南京大學(xué)動(dòng)物模式研究所，分為db/db組和db/m對(duì)照組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測(cè)量體重血糖并用ELISA法檢測(cè)24 h尿白蛋白定量（UAE），待db/db小鼠UAE顯著升高時(shí)，取小鼠腎組織，并行HE及PAS染色，確定DN診斷［16］。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

為了模擬正常與糖尿病生理環(huán)境，將MMC細(xì)胞分別培養(yǎng)在葡萄糖濃度為5、15、25 mmol/L并含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換新鮮培養(yǎng)基。取生長(zhǎng)良好的3～8代細(xì)胞行功能試驗(yàn)。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將MMC細(xì)胞分成對(duì)照組（pCDH）和過(guò)表達(dá)lncRNA127391組（lncRNA127391）。將MMC細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)基。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置過(guò)夜培養(yǎng)。按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，將pCDH和pCDH-lncRNA127391分別轉(zhuǎn)入MMC細(xì)胞中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 h后，更換為完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察，并收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR試驗(yàn)

TRIzol試劑提取細(xì)胞和組織的總RNA。按照HiScriptⅡQ RT SuperMix（南京諾唯贊）試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊）試劑盒說(shuō)明書(shū)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃30 s；循環(huán)反應(yīng)95℃10 s、60℃30 s共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃15 s、60℃60 s、95℃15 s。LncRNA 127391上游引物：5′-GCTCTAGAGCTATGATTTTTTTCATTGTAGGTGAGCTCC-3′，下 游 引 物：5′-CGGGATCCCGGGATATTCATGTTGCTT-3′；β-actin上游引物：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

在細(xì)胞樣本中加入適量配制好的含有PMSF的蛋白裂解液，置于冰上，每10 min渦旋10 s，渦旋3次后，4℃、13 000 r/min離心15 min，吸取上清至新的1.5 mL EP管中。將蛋白樣品用SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后，一抗孵育4℃過(guò)夜，次日回收一抗，用TBST漂洗PVDF膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫下孵育1 h后用TBST漂洗。隨后曝光顯影。

1.2.6 CCK8實(shí)驗(yàn)

將MMC細(xì)胞分別以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，共鋪種5塊板。放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96 h后取出，每孔各加入10 μL CCK8試劑，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.7 凋亡實(shí)驗(yàn)

將MMC細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，按照BD Annexin V FITC Apoptosis Kit凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，細(xì)胞消化后離心，用預(yù)冷的PBS洗2遍，重懸于100 μL 1×Binding Buffer，隨后分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL PI染色，輕輕混勻細(xì)胞，并在室溫避光處放置15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻后在1 h內(nèi)使用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)依標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，CCK-8實(shí)驗(yàn)中兩組間比較采用雙因素方差分析檢驗(yàn)（twoway ANOVA），考慮處理?xiàng)l件及時(shí)間兩個(gè)因素的影響，其余兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA 127391在DN小鼠腎組織及高糖MMC細(xì)胞中低表達(dá)

db/db組小鼠血糖、體重、尿量、24 h尿蛋白定量較db/m對(duì)照組小鼠均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 db/m組和db/db組小鼠的特征Table 1 Characteristics of db/m and db/db mice

HE染色結(jié)果顯示，與db/m小鼠相比，db/db小鼠表現(xiàn)出典型的DN病理改變，其系膜基質(zhì)增生、基底膜增厚（圖1A）。RT-qPCR檢測(cè)lncRNA 127391相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，db/db小鼠腎組織中l(wèi)ncRNA 127391表達(dá)顯著低于db/m小鼠腎組織（圖1B）。且隨著葡萄糖濃度的升高，MMC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 127391表達(dá)水平逐漸降低（圖1C）。

圖1 lncRNA 127391在小鼠腎組織和MMC細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 1 Expression level of lncRNA 127391 in mice kidney tissue and MMC

2.2 重組質(zhì)粒pCDH-lncRNA127391轉(zhuǎn)染MMC細(xì)胞

將空載對(duì)照pCDH和pCDH-lncRNA 127391分別轉(zhuǎn)入MMC細(xì)胞后培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察到綠色熒光表達(dá)（圖2A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCDH-lncRNA127391后，MMC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 127391表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（圖2B）。

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后lncRNA 127391在MMC細(xì)胞中表達(dá)水平Figure 2 Expression level of lncRNA 127391 in MMC after transfection

2.3 過(guò)表達(dá)lncRNA 127391抑制MMC細(xì)胞增殖和纖維化

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后，MMC細(xì)胞中纖維化標(biāo)志物FN、Col-1的蛋白表達(dá)量和增殖標(biāo)志物CyclinD1、PCNA的蛋白表達(dá)量顯著降低（圖3A）。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)lncRNA 127391組的MMC細(xì)胞增殖速度低于對(duì)照組（圖3C）。結(jié)果表明lncRNA 127391可抑制MMC細(xì)胞的增殖。

圖3 過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后抑制MMC細(xì)胞增殖和纖維化Figure 3 Overexpression of lncRNA 127391 inhibits proliferation and fibrosis of MMC

2.4 過(guò)表達(dá)lncRNA 127391促進(jìn)MMC細(xì)胞凋亡

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)lncRNA 127391組的MMC細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于對(duì)照組，表示lncRNA 127391可能促進(jìn)MMC細(xì)胞凋亡（圖4）。

圖4 過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后促進(jìn)MMC細(xì)胞凋亡Figure 4 Overexpression of lncRNA 127391 promotes apoptosis of MMC cells

3 討論

lncRNA是一類參與多種生物學(xué)進(jìn)程和疾病發(fā)展的非編碼RNA，其既可以定位于細(xì)胞核，也可以定位于細(xì)胞質(zhì)。核lncRNA可通過(guò)多種方式介導(dǎo)表觀遺傳調(diào)控，包括表觀轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾，調(diào)控方式包括染色體修飾、轉(zhuǎn)錄干擾或轉(zhuǎn)錄激活。細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA可以起到分子海綿的作用，與microRNA結(jié)合，間接增強(qiáng)蛋白質(zhì)的表達(dá)［17-18］。多項(xiàng)研究表明，lncRNA影響了多種癌癥的發(fā)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCAT19可以促進(jìn)前列腺癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［19］。在另一項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，lncRNA REG1CP結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生［20］。lnc00491可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，與食管癌預(yù)后不良相關(guān)［21］。lncRNA在糖尿病及其并發(fā)癥中同樣起著重要作用，研究表明，lncRNA在調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能，胰島素分泌和胰島素抵抗的發(fā)育中起重要作用［22-24］，影響糖尿病的發(fā)生。在糖尿病并發(fā)癥中，lncRNA的作用也不可忽視。lncRNA MALAT1促進(jìn)包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，糖尿病心肌病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生［25］。DN，作為糖尿病的常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，是造成糖尿病患者死亡的重要原因之一，同時(shí)也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1，RP23、MGC和ASncmtRNA2等可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1途徑促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積聚［6］，促進(jìn)DN的發(fā)生。Huang等［26］發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可以激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路而參與DN的發(fā)病。

本課題組前期已成功構(gòu)建lncRNA 127391過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。本研究將lncRNA 127391過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MMC細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后細(xì)胞增殖標(biāo)志物和細(xì)胞纖維化標(biāo)志物蛋白表達(dá)均下降，CCK8實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后，細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組減慢。以上結(jié)果表明，lncRNA 127391可抑制MMC細(xì)胞的增殖和纖維化。流式分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)lncRNA 127391后，MMC細(xì)胞凋亡數(shù)增加。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了lncRNA 127391在DN中低表達(dá)，并通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)lncRNA 127391重組質(zhì)粒，進(jìn)一步揭示了lncRNA 127391在DN中具有抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和纖維化的作用，但lncRNA 127391在DN中的發(fā)病機(jī)制有待深入探究。