徐文秀，蔣夢萍，王丹丹，張 建，吳 旸，張 薇，唐金海

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南京210029

乳腺癌是女性中最常見的一種惡性腫瘤，同時致死率也居于女性癌癥第1位［1］。乳房鉬靶密度（mammographic density，MD）指的是在乳腺鉬靶中整個乳房中致密組織的百分比，乳房中致密區(qū)域主要是由成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和結(jié)締組織組成的纖維腺乳腺組織［2］。乳腺纖維腺組織在乳腺鉬靶上看起來很致密，而脂肪則顯得稀疏，所以比脂肪組織更能阻擋X射線，因此在乳房鉬靶上顯示為白色［3］。致密的乳腺組織的存在極大增加了患乳腺癌的風(fēng)險［4］。在1項評估乳房密度為乳腺癌獨(dú)立危險因素研究的薈萃分析中，與密集乳房相關(guān)的相對風(fēng)險為：密度為50%～74%的乳房為2.92，密度為75%或更高的乳房為4.64［5］。與低密度乳腺組織相比，致密的乳腺組織還具有更大的DNA損傷反應(yīng)（DDR）基因表達(dá)和較短的端粒長度［6］。這些數(shù)據(jù)表明，MD的增加與乳腺癌風(fēng)險的增加之間存在很強(qiáng)的正相關(guān)性。

近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，基因芯片和基因測序的運(yùn)用已成為研究腫瘤疾病必要且高效的方法。如今是數(shù)據(jù)共享時代，各大數(shù)據(jù)庫中擁有豐富的基因檢測和分析結(jié)果，但缺少精確、有效的數(shù)據(jù)挖掘。越來越多的研究者將目光投到基于生物信息學(xué)來分析各種癌癥的分子機(jī)制［7-8］。迄今為止很多研究表明致密型乳腺與乳腺癌患病風(fēng)險增加有關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)一些潛在的差異表達(dá)基因，核心基因和相關(guān)的信號通路，這可能有助于了解高M(jìn)D增加乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制，并為高M(jìn)D乳腺癌患者的治療提供候選靶點(diǎn)。本研究從美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（NCBIGEO）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載原始的微陣列數(shù)據(jù)集GSE38506并進(jìn)行分析，以獲取高M(jìn)D和低MD的正常女性之間的差異表達(dá)基因。隨后，為了確定相關(guān)的基因和信號通路，進(jìn)行了基因本體論（gene ontology，GO），京都市基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集途徑分析和蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。通過生物信息學(xué)研究了正常女性不同MD的差異表達(dá)基因，為臨床治療和藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供了潛在的生物標(biāo)志物。

1 資料和方法

1.1 資料

NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫是一個公共的存儲高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)、芯片和微陣列的數(shù)據(jù)庫，從中下載數(shù)據(jù)集GSEGSE38506進(jìn)行分析，該芯片數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺，共13例組織樣本，其中包括6位低MD女性以及7位高M(jìn)D女性的正常乳腺組織樣本。

1.2 方法

1.2.1 鑒定差異表達(dá)基因

GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）用于鑒定高M(jìn)D組和低MD組的差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。在分析結(jié)果中，基因表達(dá)的差異用P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對數(shù)（logFC）表示。此次研究將P＜0.05且|log-FC|＞1的基因納入DEG。

1.2.2 DEGs的GO及KEGG信號通路富集分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，v6.8）［10］對DEG進(jìn)行GO和KEGG功能注釋和富集分析，發(fā)掘其涉及的相關(guān)通路。GO的功能注釋主要分為3部分，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）。KEGG是一個包含關(guān)于基因組、生物途徑、疾病和化學(xué)物質(zhì)信息的數(shù)據(jù)庫集合。富集分析的結(jié)果以P＜0.05作為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫［11］（https：//string-db.org）對DEG蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行分析，構(gòu)建DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)。綜合得分＞0.4作為相互作用存在的標(biāo)準(zhǔn)。Cytoscape軟件（3.8.0版）是用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的開源生物信息學(xué)軟件平臺［12］，可對STRING數(shù)據(jù)庫得到的PPI信息進(jìn)一步構(gòu)建。MCODE是Cytoscape中一種用于基于拓?fù)鋵o定網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類以發(fā)現(xiàn)密集連接區(qū)域的插件［13］，可篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中最顯著的模塊。

1.2.4 Hub基因的篩選

使用Cytoscape的CytoHubba插件，用5種分類方法來評估核心基因。先篩選出每種方法分值排名前15位的基因，然后根據(jù)5種方法重疊的基因篩選為Hub基因。

1.2.5 Hub基因的預(yù)后分析

Breast Cancer Gene-Expression Miner（bc-GenEx-Miner）數(shù)據(jù)庫是一個收錄乳腺癌數(shù)據(jù)的在線數(shù)據(jù)挖掘工具（http：//bcgenex.centregauducheau.fr/，v4.5），提供了評估乳腺癌基因預(yù)后信息，并可將結(jié)果繪制為生存分析曲線圖，分析腫瘤中某特定基因與死亡時間的關(guān)系，結(jié)果以95%置信區(qū)間（CI）和危險比來表示［14-15］。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

通過對基因芯片GSE65652的分析，以P＜0.05且|Log2FC|≥1為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到830個DEG，其中442個為上調(diào)基因，388個為下調(diào)基因，將結(jié)果繪制為熱圖（圖1）和火山圖（圖2）。

圖1 顯著差異基因的熱圖Figure 1 The heat map of DEGs

圖2 所有差異基因的火山圖Figure 2 Volcanic map of all the different genes

2.2 DEG的GO功能富集及KEGG通路分析

然后，使用在線軟件DAVID對這830個DEG進(jìn)行功能分類。如圖3所示，顯示了GO分析的每個部分的前7個富集分析。對于BP富集分析，結(jié)果表明DEG顯著參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0007165）、GTP酶活性的正調(diào)控（GO：0043547）、固有免疫反應(yīng)（GO：0045087）、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0035556）、細(xì)胞黏附（GO：0007155）、MAPK級聯(lián)（GO：0000165）和血管形成（GO：0001525）。對于CC富集分析，本研究表明DEG主要涉及質(zhì)膜（GO：0005886）、質(zhì)膜組成部分（GO：0005887）、細(xì)胞表面（GO：0009986）、黏著斑（GO：0005925）、細(xì)胞連接（GO：0030054）、細(xì)胞骨架（GO：0005856）和核膜（GO：0031965）。此外，在MF的富集分析中，DEG主要富集于ATP結(jié)合（GO：0005524）、肌動蛋白結(jié)合（GO：0003779）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（GO：0008134）、鈣調(diào)蛋白結(jié)合（GO：0005516）、Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子活性（GO：0005088）、酪氨酸激酶活性（GO：0004713）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3激酶活性（GO：0046934）和鳥嘌呤核苷酸交換因子活性（GO：0005085）。KEGG通路分析表明，DEG主要富集在癌癥通路（hsa05200）、PI3K-Akt信號通路（hsa04151）、Rap1信號通路（hsa04015）、神經(jīng)活動配體-受體相互作用（hsa04080）、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)（hsa04810）、癌癥中蛋白多糖（hsa05205）、Ras信 號 通 路（hsa04014）和MAPK信 號 通 路（hsa04010），見圖4。

圖3 DEG的GO富集通路圖Figure 3 Enrichment analysis of GO in DEG hy GO

圖4 DEG的KEGG富集通路圖Figure 4 Enrichment analysis of KEGG in DEG

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)建立和模塊分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫對DEG進(jìn)行PPI分析，節(jié)點(diǎn)代表DEG，邊緣代表DEG之間的相互作用。然后，使用cytoHubba軟件的MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分組，形成多個模塊。最終，本研究篩選出最顯著的（評分排名前2位）的模塊（圖5）。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)的排名前2的模塊1（A）和模塊2（B）Figure 5 Top 2 modules of PPI network

2.4 Hub基因篩選

根據(jù)cytoHubba中的5種分類方法，選擇每種排名方法的前15個基因。最終，通過重疊前15個基因來鑒定了5個核心基因，即EGFR、JUN、CDC42、SRC和RAC1（圖6）。

圖6 5種分類方法的韋恩圖Figure 6 Venn diagrams for 5 classifi caticn methods

2.5 Hub基因的預(yù)后信息

本研究在bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫中采用生存曲線評價了5個Hub基因在乳腺癌組織中總生存期（OS）的預(yù)后價值。在乳腺癌患者中，乳腺癌患者中高 表 達(dá)SRC基因的OS更 差（HR=1.16，95% CI：1.07～1.27，P=0.000 7），高表達(dá)JUN（HR=0.89，95%CI：0.81～0.97，P=0.006 4）和CDC42（HR=0.87，95%CI：0.79～0.95，P=0.002 4）基因的OS更佳（圖7）。

圖7 Hub基因的Kaplan-Meier生存曲線Figure 7 Survival curves of Hub gene

3 討論

目前，高M(jìn)D和患乳腺癌的風(fēng)險增加之間的關(guān)聯(lián)是公認(rèn)的［16-21］。然而，具體發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制仍未充分闡明。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，在基因組水平探討致密型乳腺的女性易患乳腺癌的分子機(jī)制成為可能，進(jìn)而可以尋找更多的基因靶標(biāo)。評估乳房鉬靶MD的最常用工具是乳房成像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）［22］。在1項美國佛蒙特州人口研究中，使用BI-RADS乳房密度分類，乳房極致密的女性被診斷出患有乳腺癌的相對風(fēng)險為4.6（95%CI：1.7～12.6）［23］。

本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測致密型乳腺的女性乳腺癌高發(fā)的潛在治療和預(yù)后評估靶點(diǎn)。最終篩選出5個關(guān)鍵基因，分別為EGFR、JUN、CDC42、SRC、RAC1。EGFR屬于受體酪氨酸激酶的ErbB家族，主要生理功能是調(diào)節(jié)上皮組織的發(fā)育和體內(nèi)平衡［24］。EGFR經(jīng)常在不同類型的人類癌癥中發(fā)生突變或過表達(dá)，是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素，并且是目前臨床實(shí)踐中采用的多種癌癥療法的靶標(biāo)［25-26］。JUN屬于激活蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子家族，參與許多細(xì)胞活動，例如增殖、凋亡、存活、腫瘤發(fā)生和組織形態(tài)發(fā)生［27］。在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，包括惡性黑色素瘤、鼻咽癌等［28-29］。SRC原癌基因是1種蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，在細(xì)胞生長、分裂、遷移和存活信號通路中起關(guān)鍵作用［30］。RAC1是小鳥苷三磷酸酶（GTPase）Rho家族的成員，屬于Ras超家族［31］。RAC1定位于染色體7p22，并包含7個外顯子，全長29 kb［32］，對許多細(xì)胞活動至關(guān)重要，例如吞噬作用、黏附和運(yùn)動、細(xì)胞增殖、軸突和樹突生長以及血管生成［33］。CDC42也是1個與多種人類癌癥相關(guān)的小鳥苷三磷酸酶，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移/侵襲、腫瘤生長、血管生成和致癌轉(zhuǎn)化有關(guān)［34］。此外，在數(shù)據(jù)庫中分析了這5個Hub基因與OS的關(guān)系，提示了它們可能在乳腺癌進(jìn)展中的作用，可能是致密型乳腺癌潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，但后續(xù)仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。