宋正陽，王小娟，錢恩芳，師 源，董 薇，陳 飛，李彩霞，黃 江，江 麗*

1貴州醫(yī)科大學法醫(yī)學院，貴州 貴陽550004；2公安部物證鑒定中心，法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術研究中心，現(xiàn)場物證溯源技術國家工程實驗室，北京100038；3貴州省人民醫(yī)院法醫(yī)司法鑒定所，貴州 貴陽550002；4泰安市公安局刑事科學技術研究所，山東 泰安271000；5黔東南州公安局，貴州 凱里556000

人類Y染色體呈父系遺傳，其中非重組區(qū)約占95%，以單倍型形式傳遞給男性后代［1］。常用遺傳標記有Y染色體短串聯(lián)重復序列（Y chromosome short tandem repeat，Y-STR）、Y染色體單核苷酸多態(tài)性位點（Y chromosome single nucleotide polymorphism，Y-SNP）等。Y-STR基因座組成的單倍型在不同家系間具有較高多態(tài)性，廣泛用于家系排查［2-4］，為案件偵查提供線索。此外，高突變率的快速突變YSTR（rapid-mutating Y-STR，RM Y-STR）基因座［5］和高遺傳多態(tài)性的多拷貝Y-STR（multi-copy Y-STR，MC Y-STR）基因座［6］可進一步提高對同一家系中親緣關系較近的男性個體的區(qū)分能力。一般來說，兩男性個體間單倍型容差≥3，可排除來自于同一生物學家系，但研究發(fā)現(xiàn)在排查親緣關系較遠的個體時，26個Y-STR基因座容差可低至1，增加6個RM Y-STR及MC Y-STR基因座后總容差＞3［7］。因此，在實際應用時應綜合考慮比對樣本間存在容差的基因座數(shù)目及其步長、突變率等，適當調整閾值標準［8］。

Y-SNP在家系調查研究中也有重要應用，其具有突變率低、隨父系遺傳等特征，突變可穩(wěn)定遺傳給男性后代，后代在祖先突變基礎上累積新突變［9-10］。Y染色體單倍群是指具有共同祖先來源的一組Y-SNP單倍型，其分布具有群體和地理特異性，可用于未知男性生物樣本的父系溯源［11］。國際Y染色體命名委員會（the Y chromosome consortium，YCC）將世界男性分為20個主干單倍群（A-T）［12］，其中單倍群OM175、C-M130、D-M174、N-M231約占東亞所有男性的93%，單倍群O-M175約占東亞男性的60%［13］。已有國內外學者將Y-STR和Y-SNP聯(lián)合應用于家系相關的研究，如Lkhagvasuren等［14］利用Y-STR和YSNP調查蒙古皇室金氏家族5具遺體之間的關系；Claerhout等［15］建立了Y-STR和Y-SNP遺傳標記與姓氏相關的預測模型；Wang等［16］通過分析曹操同姓后代家族中Y-SNP單倍群及其分布頻率，可反推該歷史人物最可能的單倍群；錢恩芳等［17］將Y-SNP和Y-STR兩種遺傳標記相結合應用于家系調查，顯著提高家系認定的可信度等。

本研究通過調研相關數(shù)據(jù)庫及文獻，篩選東亞地區(qū)典型分布的Y-SNP位點，基于微測序技術構建復合體系，并評估該體系在家系排查中的應用效能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 位點篩選及引物設計

參照2019版Y染色體譜系樹（International Society of Genetic Genealogy，ISOGG）（https：//isogg.org/tree/index.html），結合文獻調研篩選Y染色體主干單倍群及高頻分布于東亞地區(qū)的O-M122單倍群下游SNP位點。共篩選74個Y-SNP位點，分為兩組：①核心體系，包含主干單倍群的37個SNP位點（圖1A）；②O體系，包含O-M122單倍群下游分支的37個SNP位點（圖1B）。利用軟件Primer Premier V5.0設計PCR及延伸引物（表略，可掃OSID碼查看附表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 74個Y-SNP位點譜系樹Figure 1 Phylogenetic tree of 74 Y-SNP

1.1.2 復合擴增、純化及分型檢測

PCR反應體系為5 μL，包括去離子水1.05 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+15 mmol/L）0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.7 μL，引物混合物0.5 μL，5 U/μL Hotstar Taq Plus DNA聚合酶（Qiagen公司，德國）0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.05 μL，5 ng/μL模板DNA 2 μL。PCR反應條件：95℃5 min后，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環(huán)40次，延伸72℃10 min。向PCR產物中加入去離子水1.3 μL，ExoⅠ（10 U/μL）0.4 μL，SAP（1 U/μL）1 μL，10×SAP Buffer 0.3 μL進行純化，37℃30 min，96℃10 min。

單堿基延伸反應體系為5 μL，包含純化后PCR產物1.5 μL，延伸引物0.3 μL，SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix 2.5 μL，ddH2O 0.7 μL。循環(huán)參數(shù)：96℃10 s后，50℃5 s，60℃30 s，循環(huán)25次。向延伸產物中加入0.5 μL SAP（1 U/μL）進行純化，37℃孵育1 h，75℃15 min。

利用3130xl遺傳分析儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）進行電泳檢測，GeneMapper v3.2軟件（Thermo Fisher Scientific公司，美國）分析結果。

1.1.3 Y染色體單倍群判別

根據(jù)樣本在74個Y-SNP位點上的分型結果，依據(jù)在譜系樹中突變情況遞推判別其所屬的單倍群類型。

1.1.4性能驗證

①準確性：取男性標準品DNA 2800（Promega公司，美國）、DNA 9948（Promega公司，美國）及10份無親緣關系的男性樣本DNA，對74個Y-SNP位點進行Sanger直接測序（生工生物工程股份有限公司），用于驗證體系分型結果的準確性。②靈敏度：利用Y-SNP體系分別檢測模板量為10.00、6.00、2.00、1.60、1.20、0.80、0.40、0.20、0.16、0.12、0.08、0.06、0.018 ng的男性標準品DNA 2800重復檢測3次，測試體系的靈敏度。③重復性：以檢測最優(yōu)量對男性標準品DNA 2800重復檢測3次，比較3次檢測結果的分型與出峰位置的一致性。④檢材適應性：檢測男性FTA血卡、口腔拭子、指甲、毛發(fā)（帶毛囊）等常見檢材各8份，分別取10 ng進行檢測，統(tǒng)計不同類型檢材的出峰率。⑤抗女性成分干擾：取男性標準品DNA 2800和女性標準品DNA 9947按1∶1、1∶10、1∶100的比例進行混合，確保每管內男性DNA 2800的濃度均為0.5 ng/μL，分別取2 μL進行檢測并與僅存在男性成分時的檢測結果進行比對。⑥種屬特異性：取恒河猴、黑猩猩、雞、牛、蛇、鼠、魚、豬等非人源樣本各10 ng進行檢測，統(tǒng)計各種屬的出峰數(shù)目。

1.2 方法

1.2.1 樣本及DNA提取與定量

本研究收集來自4個社會學家系（分別命名為P1～P4家系）共20份男性血卡樣本，其中P1家系3例，P2家系6例，P3家系6例，P4家系5例。采用QIAamp?DNA Blood Mini M48試劑盒（QIAGEN公司，德國）提取DNA，使用NanoDrop 2000c分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司，美國）進行定量，用去離子滅菌水稀釋至5 ng/μL待檢。本實驗室樣本均來源于國家科技資源共享服務平臺計劃項目（編號：YCZYPT［2017］01-3），所有樣本對象均簽署知情同意書，本研究已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會的倫理審查（批準號：2017LLSC-005）。

1.2.2 分型檢測

所有樣本采用本研究構建的體系按照1.1.2方法進行Y-SNP分型檢測；采用DNA TyperTMY29試劑盒（公安部物證鑒定中心，北京）進行Y-STR檢測，包括26個Y-STR基因座（DYS19、DYS385、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、GATA-H4、DYS444、DYS447、DYS460、DYS481、DYS508、DYS533、DYS643、DYF387S1、DYS518、DYS449、DYS576），其中3個基因座（DYS449、DYS518、DYS576）為RM Y-STR，2個基因座（DYS385、DYS389Ⅰ/Ⅱ）為MC Y-STR，1個基因座（DYF387S1）既是RM Y-STR也是MC YSTR。

1.3 統(tǒng)計學方法

根據(jù)Y-SNP分型結果判別樣本Y-SNP單倍群類型，統(tǒng)計家系內Y-SNP單倍群分布情況。以家系內成員中共享人數(shù)最多的單倍型為參考，統(tǒng)計家系內Y-STR單倍型分布情況及不同單倍型之間的容差和累計突變步長?；?3個單拷貝Y-STR基因座分型，根據(jù)Median-Joining方法，使用Network v10.0和Network Publisher軟件分別對4個家系中YSTR單倍型變異情況進行網(wǎng)絡圖可視化分析。

2 結果

2.1 體系構建

男性標準品DNA 2800用本研究構建的Y-SNP體系檢測的分型圖譜如圖2所示。其中核心體系SNP位點延伸片段長度在37～116 bp之間（圖2A），O體系SNP位點延伸片段長度在31～115 bp之間（圖2B）。在DNA模板量為10 ng時（濃度5 ng/μL，體積2 μL），各位點均有分型峰，且峰高均超過200 RFU。

2.2 體系性能驗證

①準確性：12份DNA樣本的分型結果與Sanger直接測序結果的基因分型完全一致，構建的復合體系對74個Y-SNP位點的基因分型結果準確性可達100%，DNA2800核心體系檢測結果可掃OSID碼查看附圖1，O體系檢測結果可掃OSID碼查看附圖2，余11份DNA結果可掃OSID碼查看附表2。②靈敏度：對不同模板量的樣本進行Y-SNP體系檢測，以等位基因峰高低于100 RFU視為位點丟失為標準。結果顯示，在DNA檢測量最低為0.14 ng（核心體系0.06 ng，O體系0.08 ng）時，74個Y-SNP位點均可正確判型，檢測結果可掃OSID碼查看附圖3。③重復性：74個Y-SNP位點在3次重復實驗中的分型結果一致，相同位點之間的出峰位置差距平均為0.087 bp（核心體系0.025 bp，O體系0.061 bp），均≤1 bp（可掃OSID碼查看附表3）。說明Y-SNP體系重復檢測相同的DNA樣本時，均能獲得相同的分型結果。④檢材適應性：利用Y-SNP體系檢測的FTA血卡、口腔拭子、指甲、毛發(fā)（帶毛囊）DNA樣本，均能獲得完整分型，且同一樣本不同類型檢材分型結果一致，說明該體系可以用于常用檢材的檢測（可掃OSID碼查看附圖4）。⑤抗女性成分干擾：在男性與女性成分比例為1∶1、1∶10、1∶100時，核心體系及O體系的出峰率均為100%。所出分型峰均與男性成分單獨檢測結果相同（可掃OSID碼查看附圖5）。⑥種屬特異性：所檢測的靈長類動物黑猩猩檢出52個位點峰，恒河猴檢出30個位點峰，其余樣本均未檢出特異性峰（可掃OSID碼查看附圖6）。

圖2 男性標準品DNA 2800分型圖譜Figure 2 The typing profile of male standard DNA 2800

2.3 家系排查應用

來自4個社會學家系的20例男性樣本均獲得完整的Y-SNP與Y-STR分型，Y-SNP單倍群和YSTR單倍型分型結果可掃OSID碼查看附表4。家系內各樣本間網(wǎng)絡圖以及結合家系調研信息繪制的家譜圖見圖3，網(wǎng)絡圖對家系內Y-STR以及YSNP的變異情況進行可視化。Y-STR單倍型編號對應的分型可掃OSID碼查看附表4。

P1家系3例男性樣本Y-STR單倍型完全一致，其Y-SNP單倍群均屬于N1b-F2930。在圖3A中3例樣本聚在一起。

P2家系6例男性樣本共檢出4種Y-STR單倍型，其中單倍型H2共3例，H3共1例，H4共1例，H5共1例。以單倍型H2為參考，其與H3之間的容差為1，與H4之間的容差為4，與H5之間的容差為5，累計突變步長分別為1、4、5步。所有樣本之間有5個Y-STR基因座（DYS439、GATA-H4、DYS518、DYS576、DYS385）的突變步長均為1步，其余21個基 因 座（DYS19、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、DYS444、DYS447、DYS460、DYS481、DYS508、DYS533、DYS643、DYF387S1、DYS449）分型一致。6例樣本Y-SNP單倍群均屬于N1b-F2930。在圖3B中，3例H2單倍型的個體聚在一起，與H3單倍型個體之間容差相差1，與H4單倍型個體之間容差相差3，與H5單倍型個體之間容差相差4。

P3家系6例男性樣本共檢出3種Y-STR單倍型，其中單倍型H6共4例，H7共1例，H8共1例。以單倍型H6為參考，其與H7以及H8之間的容差均為18。所有樣本之間僅3個Y-STR基因座（DYS391、DYS438、GATA-H4）分 型 一 致，在DYS458基因座中檢出分型14.1（H6）、18（H7）、17（H8），其余基因座之間的突變步長在1～8步不等，其中DYS385基因座突變步長最高為8步。6例樣本分別屬于3種Y-SNP單倍群，其中單倍型為H6的所有個體均屬于N1b-F2930單倍群；H7和H8單倍型的個體分別歸屬于單倍群C1-F3393和O2a1c1-F18。在圖3C中3種Y-STR單倍型各自聚在一起，且分別屬于不同的Y-SNP單倍群。

P4家系5例男性樣本共檢出2種Y-STR單倍型，其中單倍型H9共3例，H10共2例。2種單倍型之間的容差為10。所有樣本之間有8個Y-STR基因座（DYS391、DYS439、DYS447、DYS456、DYS533、DYS576、DYS385、DYS389I/II）的突變步長為1步，1個基因座（DYF387S1）的突變步長為2步，DYS449基因座檢出分型32（H9）、30.2（H10），其余16個基因座（DYS19、DYS390、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS444、DYS448、DYS458、DYS460、DYS481、DYS508、DYS635、DYS643、GATA-H4、DYS518）分型一致。5例樣本Y-SNP單倍群均屬于O1a1a-M307.1。在圖3D中，分別屬于2種單倍型的個體聚在一起，容差為7。

3 討論

本研究構建的Y-SNP體系共篩選74個Y-SNP位點，包含核心體系及O體系兩組子體系。該體系準確性達100%，重復性好，最低DNA檢出量為0.14 ng；適用于常用檢材的檢測；在男女組分混合比例為1∶100時仍可檢出男性的完整分型，可用于混合斑的檢測；在非人源DNA中，由于黑猩猩與人類的Y染色體非重組區(qū)域相似性達98.3%［18］，恒河猴與人類基因組有93%同源性［19］，所以僅在兩者DNA中檢出少許位點峰，但難以判別其單倍群，無實際意義。Y-SNP體系可用于男性樣本Y-SNP單倍群的檢測。

來自同一父系的樣本Y單倍群類型相同，不同單倍群類型的樣本可排除來自同一父系。本研究篩選的Y-SNP位點其突變發(fā)生時間最近可追溯至2000年前（https：//www.yfull.com/chart/tree/），以本體系所選位點判斷的單倍群可回溯至80代（按照25年/代計算）。目前通常在家系調查或排查大家系時，Y-STR可追溯至2～10余代共同祖先［8］，本體系在應用時可完全覆蓋。當兩個體間Y-STR單倍型與Y-SNP單倍群均相同時，不排除來自同一父系，如本文中的P1家系；反之，當Y-STR單倍型與Y-SNP單倍群均不同時則可排除來自同一家系，如本文中的P3家系中的H7、H8個體。Lkhagvasuren等［14］同樣通過2個個體間Y-STR單倍型與Y-SNP單倍群均不同，排除了2個個體源自同一父系。由于兩個體間親緣關系較遠，減數(shù)分裂次數(shù)較多導致其YSTR單倍型容差可能稍大，采用常用標準閾值可能導致錯誤排除，如本文中P2家系的H2單倍型個體與H4、H5單倍型個體之間分別為9級親緣關系和5級親緣關系，容差分別為4和5，但該家系成員均屬于同一Y-SNP單倍群，因此不能簡單地依據(jù)常用標準閾值排除該家系成員來自同一父系。有研究表明，在考慮遠親關系時，用于家系排查的標準應適當上調，如兩個體間25個Y-STR基因座的容差閾值3可調整為4［20］。Y-SNP單倍群在Y-STR發(fā)生突變難以判斷時起到重要的輔助判斷作用。同時，在家系排查時，需注意家系成員中是否存在收養(yǎng)、抱養(yǎng)、入贅、非婚生子女等情況，避免家系排查的結果與家系調研的成員所屬親緣關系不符。

然而值得注意的是，由于Y-SNP單倍群在不同人群中頻率分布不同，兩個體之間可能出現(xiàn)Y-STR單倍型相差較大，但因抽樣隨機性而同屬相同YSNP單倍群的情況。在實際應用中若樣本所屬單倍群在人群中分布頻率較高，則可能會出現(xiàn)不排除的結論，這就要求在應用時需了解單倍群分布頻率數(shù)據(jù)。如本文中的P4家系，在排查時應謹慎。在20個Y-SNP主干單倍群中，約75%的中國人可歸為單倍群O-M175［21］，該單倍群的3個主要下游：單倍群O1a-M119主要分布在中國東南沿海、侗傣族群以及臺灣原住民［22-24］；單倍群O1b-M268在中國的東部、南部以及北部的漢族［13］中均有分布；單倍群O2-M122主要分布在中國的漢族（南方漢族約占53.72%，北方漢族約占52.06%），其下游3個主要支系O2a1b-002611、O2a2b1-M134、O2a2b1a1-M117各占漢族的16.9%、11.4%、16.3%［13，25］。P4家系成員所屬的Y-SNP單倍群O1a1a-M307.1為單倍群O1a-M119的下游分支，單倍群O1a1a在中國東部（22.2%）、南部（12.3%）、北部（1.6%）的漢族均有分布［13］。因此，相同Y-SNP單倍群的男性個體可能來自于不同父系。Y-SNP單倍群分支越精細，分布越局限，則越可能區(qū)分親緣關系較近的人群。如單倍群O1a-M119的下游O1a2-M110分布于中國臺灣（34.1%）、菲律賓（12.8%）、東南亞群島的中部和東部（2.5%和9.7%），而在東亞和東南亞的大陸以及東南亞群島的西部未見分布［24，26］。

同時，在本文中的4個家系中，在DYS458和DYS449基因座上檢出了微變異等位基因（14.1、30.2）。非整數(shù)與整數(shù)（例如31→30.2）STR等位基因之間的突變機制不同于滑動鏈錯配模式，其通常是因堿基缺失導致。這類突變的概率低于STR平均突變率，而高于SNP突變率［27-28］。因此，屬于同一父系的成員發(fā)生此類突變的幾率較低。

綜上所述，本文構建的Y-SNP體系可用于實際案件樣本檢測以及家系排查。在家系排查中，由于Y-STR的高突變率，Y-STR難以用于相隔三代以上的父系親緣關系判定［29］，而Y-SNP單倍群可起到對Y-STR單倍型結果的補充和驗證的作用，Y-SNP與Y-STR遺傳標記和網(wǎng)絡圖的聯(lián)用，可提高家系排查的準確率，為案件的偵查提供相應線索。