姜珊,蔣廣威,尹磊淼,2,徐玉東,2,陳艷焦,2,楊永清,2,王宇,2

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030）

針灸實(shí)驗(yàn)研究多以鼠科動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,為便于針灸操作,多采用在非麻醉狀態(tài)下固定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前針灸研究中采用的動(dòng)物固定方法包括束縛固定[1]、置高臺(tái)固定[2]、懸吊固定[3]。以上固定方法分別與束縛應(yīng)激（捆綁）、恐高應(yīng)激（置高臺(tái)）和失重應(yīng)激（懸吊）相關(guān)。因不同固定方法均會(huì)產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng),影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理、病理指標(biāo),從而影響針灸療效的準(zhǔn)確評(píng)估。筆者通過(guò)分析國(guó)內(nèi)外針灸實(shí)驗(yàn)中不同固定方法對(duì)針灸效應(yīng)的干預(yù),為選擇恰當(dāng)?shù)膭?dòng)物固定方法提供建議,以達(dá)到對(duì)針灸效應(yīng)最小干預(yù)的目的,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 固定應(yīng)激及其對(duì)動(dòng)物生理、病理的影響

1.1 應(yīng)激

應(yīng)激是機(jī)體在受到各種強(qiáng)烈刺激時(shí)所產(chǎn)生的全身性的非特異適應(yīng)性綜合反應(yīng),表現(xiàn)為交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)（sympathetic-adrenomedullar, SSA）系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamo-pituitaryadrenocortical, HPA）系統(tǒng)的活化,并伴有多系統(tǒng)組織和器官功能紊亂[4]。針刺效應(yīng)與SSA和HPA系統(tǒng)密切相關(guān),可有效干預(yù)中樞和外周HPA的各環(huán)節(jié),可明顯降低 HPA軸相關(guān)激素促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）、皮質(zhì)醇（corticosterone, CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）水平[5-6]。因此,應(yīng)激效應(yīng)與針刺效應(yīng)疊加,將影響對(duì)針刺效應(yīng)的準(zhǔn)確評(píng)判。

1.2 導(dǎo)致應(yīng)激的外部因素

應(yīng)激源作用于機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激[7]。動(dòng)物固定是針灸實(shí)驗(yàn)研究中誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激的主要應(yīng)激源之一,包括捆綁束縛固定[1]、固定器束縛固定[8-9]、網(wǎng)罩束縛固定[10]、徒手固定[11]、懸吊固定[3]以及置高臺(tái)固定[12]等。

其中捆綁束縛固定、固定器束縛固定、網(wǎng)罩束縛固定、徒手固定屬于外力固定,可產(chǎn)生不同程度的束縛應(yīng)激;置高臺(tái)固定產(chǎn)生恐高應(yīng)激;懸吊固定產(chǎn)生失重應(yīng)激。

1.3 應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響

在應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體的多種穩(wěn)態(tài)平衡被打破[13]。因應(yīng)激程度、方式不同,可使機(jī)體產(chǎn)生生理性應(yīng)激反應(yīng)和病理性應(yīng)激反應(yīng),即良性反應(yīng)（適度應(yīng)激）和不良反應(yīng)（過(guò)度應(yīng)激）。

研究表明束縛應(yīng)激的實(shí)施時(shí)間與應(yīng)激強(qiáng)度相關(guān)。單次刺激時(shí)間、頻率、強(qiáng)度所致累積刺激量決定應(yīng)激程度。實(shí)驗(yàn)研究中,慢性應(yīng)激多見(jiàn)單次刺激0.5～6 h[14-16],反復(fù)刺激7～24 d[15-17];制備急性應(yīng)激模型多見(jiàn)單次刺激 3～6 h,重復(fù) 1～5 d[18-20]。提示即使采取強(qiáng)刺激,但時(shí)程小,也不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生較大生理影響。對(duì)應(yīng)激程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)可分為短效指標(biāo)、長(zhǎng)效指標(biāo)和疾病指標(biāo)。

1.3.1 束縛應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響

束縛應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大干預(yù)。其中捆綁束縛、徒手固定對(duì)機(jī)體的影響最大,固定器固定、網(wǎng)罩束縛次之。捆綁束縛[21]通過(guò)繩索固定四肢、軀干,使動(dòng)物處于強(qiáng)迫體位,活動(dòng)度小,反抗激烈,應(yīng)激反應(yīng)大;固定器束縛可以調(diào)節(jié)肢體活動(dòng)部位到合適位置,多采用鼠套[22]、布袋[23]等網(wǎng)罩類束縛方法,可使鼠類處于較自然狀態(tài),可減小動(dòng)物強(qiáng)烈反抗程度,應(yīng)激相對(duì)較小[24]。

目前針灸實(shí)驗(yàn)研究多采用捆綁束縛固定方法。研究提示,捆綁束縛固定應(yīng)激可誘發(fā)鼠科整體行為認(rèn)知、內(nèi)分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)生理指標(biāo)改變,以及消化系統(tǒng)器質(zhì)性病變。單次6 h、重復(fù)7～21 d慢性捆綁束縛固定應(yīng)激可使鼠類出現(xiàn)焦慮樣行為、體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢;慢性不可預(yù)測(cè)捆綁束縛性應(yīng)激則會(huì)使鼠類患抑郁癥[15],糖皮質(zhì)激素及其受體表達(dá)增加[25]。單次 2～4 h長(zhǎng)期捆綁束縛應(yīng)激,可激活HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)[26]。單次6 h捆綁束縛冷應(yīng)激可致鼠類患急性胃潰瘍性疾病[20,27]。

固定器束縛應(yīng)激會(huì)造成鼠科整體行為認(rèn)知、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理改變及心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的器質(zhì)性病變。研究表明,單次 2.5 h、重復(fù)7～14 d固定器束縛應(yīng)激,可致鼠類認(rèn)知障礙和海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘缺失[17]。單次0.5 h、9 d的固定器束縛固定,會(huì)造成大鼠體質(zhì)量增幅、痛閾和應(yīng)激效應(yīng)相關(guān)激素含量明顯降低,激活HPA軸,產(chǎn)生慢性應(yīng)激效應(yīng)[14]。固定器束縛應(yīng)激可致大鼠肝臟中過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體α（PPAR-α）及其靶基因肝型肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-I（L-CPT-I）mRNA 表達(dá)增加,但研究表明 PPAR α及其 L-CPT-I表達(dá)的影響與固定器束縛應(yīng)激本身有關(guān),與應(yīng)激時(shí)間長(zhǎng)短關(guān)系不明顯[28]。單次 6 h、1～21 d固定器束縛應(yīng)激可導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 mRNA總量和第四外顯子水平下降[29]。單次6 h、24 d固定器束縛應(yīng)激,降低乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）引起心血管疾病[16,30],發(fā)病率隨應(yīng)激增加而升高[28]。固定器束縛應(yīng)激0.2～1 h會(huì)增加機(jī)體體溫以及CORT水平[31];單次3 h、5 d的固定器束縛應(yīng)激,使HPA軸激活,胃酸、胃酶分泌增多,產(chǎn)生胃潰瘍疾病[19,32]。

單次6 h分別實(shí)施1 d、2 d、3 d網(wǎng)罩束縛,會(huì)誘發(fā)鼠科內(nèi)分泌系統(tǒng)指標(biāo)改變[18]。未見(jiàn)網(wǎng)罩束縛應(yīng)激導(dǎo)致鼠科器質(zhì)性病變的報(bào)道。

1.3.2 置高臺(tái)應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響

實(shí)驗(yàn)研究中,利用鼠科的畏高特性,可制備置高臺(tái)應(yīng)激模型[33-34]。單次30 min置高臺(tái)應(yīng)激時(shí)鼠科會(huì)表現(xiàn)出勃起、長(zhǎng)達(dá)10 min的靜止不動(dòng)、排便、排尿等行為性“凍結(jié)”[35]。研究發(fā)現(xiàn),單次30 min的置高臺(tái)應(yīng)激可以損傷鼠科空間參考記憶提取能力[36]。但置高臺(tái)應(yīng)激可降低鼠科糖尿病模型血糖水平[2]。置高臺(tái)應(yīng)激對(duì)鼠科的生理、病理有一定影響,但未見(jiàn)器質(zhì)性病變報(bào)道。

1.3.3 懸吊應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響

懸吊應(yīng)激會(huì)造成鼠科消化系統(tǒng)器質(zhì)性病變、整體行為認(rèn)知、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等生理、病理改變。單次6 h懸吊應(yīng)激狀態(tài)中鼠類體溫逐漸下降,懸吊加束縛應(yīng)激還可導(dǎo)致胃潰瘍[37]。重復(fù)應(yīng)激使動(dòng)物逐漸產(chǎn)生對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)能力,減緩體溫下降。懸吊應(yīng)激使鼠類性行為周期改變、學(xué)習(xí)記憶能力降低[38]。

不同固定方式對(duì)鼠科基礎(chǔ)生理指標(biāo)、行為學(xué)及各系統(tǒng)的影響見(jiàn)表1。

表1 不同固定方式對(duì)鼠科基礎(chǔ)生理指標(biāo)、行為學(xué)及各系統(tǒng)的影響

2 固定應(yīng)激對(duì)針灸效應(yīng)的干預(yù)

2.1 束縛固定

針灸實(shí)驗(yàn)研究中,捆綁束縛[21]的松緊度很難控制;固定器和網(wǎng)罩類束縛方法,雖可以使鼠類處于俯臥自然狀態(tài),但鼠類均處于強(qiáng)迫體位。針刺時(shí),動(dòng)物因疼痛發(fā)生掙扎,導(dǎo)致體位改變,取穴不準(zhǔn),針刺深度也很難把握,甚至掙脫而咬傷實(shí)驗(yàn)人員,如太緊則易導(dǎo)致動(dòng)物肢體缺血壞死[39]。

研究表明,針灸實(shí)驗(yàn)中采用束縛固定可使鼠類出現(xiàn)毛色暗淡無(wú)光,精神緊張狀態(tài)、萎靡、焦躁,食欲減退,甚至出現(xiàn)嘔吐、便溏現(xiàn)象等不良應(yīng)激反應(yīng)[40]和降低糖尿病模型血糖水平的良性應(yīng)激反應(yīng)[2]。但束縛和針刺均能明顯降低糖尿病模型的血糖水平,束縛應(yīng)激效應(yīng)顯著,在此效應(yīng)疊加基礎(chǔ)上難以準(zhǔn)確評(píng)估針刺效應(yīng)[2]。也有研究表明,用特殊束縛裝置對(duì)鼠類進(jìn)行固定30 min不會(huì)影響鼠科的體質(zhì)量和學(xué)習(xí)記憶能力及視力,束縛本身沒(méi)有使被固定的鼠類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[41]。

單次束縛應(yīng)激0.5～6 h,總時(shí)長(zhǎng)1～24 d,均產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)。在針灸動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,固定時(shí)間多為 30 min,刺激時(shí)間短,可使動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性,減小應(yīng)激不良反應(yīng)。

束縛固定應(yīng)激中超過(guò)一定程度可產(chǎn)生強(qiáng)應(yīng)激,引起生理、病理改變,對(duì)針灸效應(yīng)產(chǎn)生影響。因此在針灸機(jī)制研究中,盡量避免采用束縛固定方法。如果采用束縛固定方法,固定時(shí)間盡量維持在30 min以內(nèi)。

2.2 置高臺(tái)固定

在針灸實(shí)驗(yàn)研究中,置高臺(tái)固定法能有效地減少束縛應(yīng)激對(duì)動(dòng)物模型與針刺效應(yīng)的影響。有研究[2]表明,在置高臺(tái)情況下,去除置高臺(tái)的本底效應(yīng),針刺仍然對(duì)糖尿病大鼠血糖有明顯下調(diào)作用,針刺的效應(yīng)可得到明顯體現(xiàn)。采取置高臺(tái)固定時(shí),動(dòng)物處于俯臥位的自然體位,因此該方法適用于針灸實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物的頭背部、四肢外部的針灸治療。

為了減小動(dòng)物因置高臺(tái)產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),正式實(shí)驗(yàn)前可做2～5次適應(yīng)性訓(xùn)練。置高臺(tái)固定產(chǎn)生較小應(yīng)激,對(duì)生理、病理影響較小,對(duì)針刺效應(yīng)的干預(yù)也較小,因此在針灸機(jī)制研究中,推薦采用置高臺(tái)固定方法。

3 應(yīng)激評(píng)價(jià)方法在針灸研究中的應(yīng)用

不同種類、程度的應(yīng)激對(duì)動(dòng)物的影響存在差異,并與動(dòng)物狀態(tài)（疾病模型）密切相關(guān)。因此,在針刺研究中,要根據(jù)動(dòng)物狀態(tài)（疾病模型）、穴位等實(shí)驗(yàn)條件,依據(jù)應(yīng)激評(píng)價(jià),選用合適的固定方法。在針灸實(shí)驗(yàn)研究中,應(yīng)激的評(píng)價(jià)方法主要包括行為學(xué)評(píng)價(jià)、基本生理指標(biāo)檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)評(píng)價(jià)等。

行為學(xué)評(píng)價(jià)方法包括動(dòng)物整體狀態(tài)評(píng)價(jià)[42]、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[42-43]、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[43]、水迷宮實(shí)驗(yàn)[44]、蔗糖攝取實(shí)驗(yàn)[45]等。其中動(dòng)物整體狀態(tài)評(píng)價(jià)方法更適合于針灸研究領(lǐng)域。應(yīng)激使大鼠產(chǎn)生明顯的行為變化,如排便、站立不動(dòng)、尖叫、發(fā)出超聲波、不斷的趟淚,皮毛和面部不潔、毛須樹(shù)立、長(zhǎng)期不動(dòng)等[42]。應(yīng)激大鼠眼周偶爾有粉紅色分泌物。急性應(yīng)激可導(dǎo)致動(dòng)物行為活動(dòng)增加,而慢性應(yīng)激可導(dǎo)致行為活動(dòng)減少,動(dòng)物隨應(yīng)激時(shí)程延長(zhǎng),其行為表現(xiàn)為由興奮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种茽顟B(tài)。

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要包括腎上腺糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺和CORT。應(yīng)激主要激活HPA軸,下丘腦產(chǎn)生CRH,經(jīng)垂體門(mén)脈系統(tǒng)進(jìn)入垂體前葉,刺激 ACTH的釋放,ACTH作用于腎上腺皮質(zhì),促進(jìn)CORT的分泌,而CORT的分泌反過(guò)來(lái)又抑制ACTH和CRH的釋放,形成負(fù)反饋機(jī)制。研究表明,束縛應(yīng)激后小鼠血清中CORT水平較正常明顯升高[46]。除了以上指標(biāo)外,內(nèi)分泌軸系統(tǒng)也參與應(yīng)激反應(yīng)。因此,可以反應(yīng)應(yīng)激的常用指標(biāo)除去甲腎上腺素、甲狀腺素、CRH、ACTH和CORT外,還有阿片肽、多巴胺、生長(zhǎng)抑制素和P物質(zhì)等。其中,CORT是評(píng)價(jià)針灸研究中最常見(jiàn)的應(yīng)激指標(biāo)之一,可以高度準(zhǔn)確地反映動(dòng)物對(duì)急性應(yīng)激源的反應(yīng)。相關(guān)研究表明,中性粒細(xì)胞:淋巴細(xì)胞比率（NE:LY）也可以有效評(píng)價(jià)慢性應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相對(duì)客觀地反映動(dòng)物整體激素水平的變化[25]。因此,生長(zhǎng)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能相關(guān)指標(biāo),都可用于應(yīng)激評(píng)價(jià)。由于實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)評(píng)估并不能區(qū)分困擾或輕度痛苦,因此應(yīng)綜合參考行為學(xué)評(píng)價(jià)與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行應(yīng)激的有效評(píng)估[47]。

4 討論

在針灸效應(yīng)評(píng)價(jià)中,應(yīng)該充分考慮固定應(yīng)激對(duì)動(dòng)物機(jī)體生理、病理的影響以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)針灸療效。應(yīng)激產(chǎn)生的良性反應(yīng),有助于疾病的改善,因此忽略應(yīng)激良性效應(yīng)因素可能導(dǎo)致針灸的治療效應(yīng)加大,或產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果;應(yīng)激產(chǎn)生的損傷性反應(yīng),可能導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步加重,忽略應(yīng)激非良性效應(yīng)因素可能導(dǎo)致針灸的治療效應(yīng)減小,或產(chǎn)生假陰性結(jié)果。在針灸實(shí)驗(yàn)研究中,因固定導(dǎo)致的應(yīng)激很難避免,為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,應(yīng)盡量減小固定應(yīng)激對(duì)針灸效應(yīng)的干預(yù),或在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置固定對(duì)照組用于分析應(yīng)激效應(yīng)對(duì)于針灸效應(yīng)的影響。為了明確固定方法對(duì)針灸效應(yīng)的干預(yù),在正式開(kāi)展實(shí)驗(yàn)前,應(yīng)首先進(jìn)行應(yīng)激評(píng)估,并在此基礎(chǔ)上選擇合適的動(dòng)物固定方法。

應(yīng)激評(píng)估過(guò)程包括①在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行應(yīng)激評(píng)估預(yù)實(shí)驗(yàn),根據(jù)行為學(xué)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因固定而產(chǎn)生的應(yīng)激進(jìn)行評(píng)估;②正式實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物進(jìn)行固定適應(yīng)性鍛煉,通過(guò)訓(xùn)練,使動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng),以達(dá)到最小化應(yīng)激反應(yīng),避免對(duì)針灸療效產(chǎn)生過(guò)大影響[38];③在正式實(shí)驗(yàn)中,對(duì)鼠類的單次固定時(shí)間盡量控制在30 min以內(nèi);④在針灸治療疾病模型療效評(píng)估時(shí),應(yīng)關(guān)注固定應(yīng)激對(duì)相關(guān)指標(biāo)的干預(yù)。

固定方法的選擇原則具體為①治療取穴位于動(dòng)物頭背部、四肢外側(cè)等部位,建議優(yōu)先選擇置高臺(tái)固定法,其次選擇網(wǎng)罩、固定器固定;②治療取穴位于動(dòng)物腹部、四肢內(nèi)側(cè)等部位,建議選擇網(wǎng)罩或固定器固定;③常規(guī)情況下不建議采用捆綁固定法。如果在特殊實(shí)驗(yàn)條件下,不適合采用置高臺(tái)、網(wǎng)罩、固定器固定等方法,最終可考慮采用捆綁固定法。