鄭雪,蕭有智,吳夢蝶,吳煥淦,馬喆,王文佳,黃艷,李琪,李璟

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;4.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是臨床上常見的一種消化系統(tǒng)疾病,病理表現(xiàn)主要為胃黏膜固有腺體的減少,伴或不伴腸上皮化生和（或）異型增生[1]。本病臨床表現(xiàn)常輕重不一,以胃脘痛、上腹部不適、食欲不振、泛酸、飽脹、惡心嘔吐等為主,伴隨乏力、噯氣、抑郁、焦慮等癥狀[2]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),萎縮伴腸化發(fā)展為胃癌的中位時間為6.1年,低度異型增生為2.6年[3],且胃癌的發(fā)病人群主要集中在日本、中國、南美等國家[4]。積極有效地防治CAG,阻斷其向胃癌發(fā)展,已成為預(yù)防胃癌的重要途徑。CAG發(fā)病機制尚未明確,認(rèn)為該病與幽門螺旋桿菌感染、免疫、年齡、十二指腸液返流、家族遺傳史等多種因素有關(guān)[5]。CAG具有病程長、癥狀反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特點,給患者和社會造成巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。積極探討其發(fā)病機制,尋求有效的治療方法迫在眉睫。

CAG基礎(chǔ)上伴發(fā)的腸上皮化生及不典型增生,屬于胃癌前期病變,是從正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的重要階段。磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tension homolog deleted onchromosome ten,PTEN）是至今為止發(fā)現(xiàn)的首個具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因,其從慢性淺表性胃炎開始表達(dá)降低,在萎縮、萎縮伴腸化和異型增生至胃癌的進(jìn)展過程中持續(xù)丟失[6]。研究表明,PTEN的缺失可激活PI3K/AKT信號通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。PI3K/AKT通路是一條經(jīng)典的抗凋亡和促存活的信號傳導(dǎo)通路,在介導(dǎo)細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞生長及增殖,抑制細(xì)胞凋亡等方面起到關(guān)鍵作用,該通路已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中異常激活,與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。CAG是胃癌進(jìn)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),積極探討PTEN/PI3K/AKT信號通路在CAG的作用機制,逆轉(zhuǎn)其發(fā)展進(jìn)程對胃癌的防治具有積極意義。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏有效治療 CAG的方法,臨床上主要以根除幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori,Hp）感染、補充葉酸、保護(hù)胃黏膜、改善胃動力、消除致病因素等作為常用的治療方法[9]。近年來,中醫(yī)藥尤其是針灸療法在治療 CAG中占據(jù)重要的地位,動物實驗和臨床試驗均表明針灸在治療 CAG中具有獨特優(yōu)勢[10-11]。本課題組前期臨床研究證實,艾灸能調(diào)節(jié)胃腸功能、促進(jìn)胃黏膜修復(fù)、提高機體免疫[12-13]。但目前大多數(shù)研究停留在臨床療效觀察階段,艾灸治療 CAG的作用機制尚未明確。因此,本研究通過動物實驗,探討艾灸干預(yù) CAG的效應(yīng)機制,擬證實艾灸可能通過影響CAG大鼠胃黏膜組織PTEN/PI3K/AKT通路,調(diào)控其相關(guān)基因的表達(dá),有效控制 CAG胃黏膜損傷,達(dá)到防治CAG癌前病變的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性 Wistar大鼠 52只,6周齡,體質(zhì)量（150±30） g,由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物合格證編號為 2015000538649;許可證號為SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為室內(nèi)濕度40%～70%,室溫（18～22） ℃。實驗操作均在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理委員會制定的實驗動物使用及保護(hù)條例的指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 藥物和試劑

N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG）（日本東京株式會社）;葉酸片（常州制藥廠有限公司）;4%多聚甲醛和二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;蘇木素和伊紅（南京建成科技有限公司）;Anti-PIP2抗體（Abcam,ab11039）;Anti-PTEN抗體（Abcam, ab31392）;AKTPhospho-S473 抗體（proteintech, 66444-1-Ig）;MDM2抗體（SantaCruz, sc-13161）;Anti-Caspase-9 抗體（Abcam, ab52298）。

1.3 模型制備與鑒定

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為正常組（12只）和造模組大鼠（40只）。正常大鼠予以常規(guī)飲食,造模大鼠采用 MNNG誘導(dǎo)劑結(jié)合夾尾刺激與饑飽失常法制備CAG大鼠模型[14],造模周期為34周。造模大鼠每日自由飲用濃度為 170 mg/L的 MNNG溶液,每日更換 1次。飽食2 d,禁食1 d,循環(huán)實施。每周用夾尾夾夾住大鼠尾部1次,持續(xù)10 min,使之保持激怒、互相攻擊的狀態(tài)。34周后從造模大鼠取4只大鼠進(jìn)行模型鑒定,取大鼠胃竇組織并做HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化,觀察到大鼠胃黏膜出現(xiàn)萎縮、或/和腸上皮化生病理變化,確定模型成功。

1.4 分組與干預(yù)

至34周造模組大鼠死亡6只,取4只進(jìn)行模型鑒定。造模結(jié)束余正常組大鼠12只,造模大鼠30只。剩余30只造模成功大鼠隨機分為模型組、隔藥餅灸組和西藥組,每組10只。正常組與模型組不進(jìn)行任何干預(yù),只做同隔藥灸組相同的抓取和固定;西藥組予葉酸懸濁液灌胃給藥（每100 g體質(zhì)量給藥1 mL）,每日1次,1周6次,共4周;隔藥餅灸組取穴中脘和氣海穴,將大鼠固定于自制大鼠固定架上,用調(diào)制好的藥餅（直徑 1 cm、厚度 0.5 cm）放置大鼠的穴區(qū),上置 90 mg艾炷,每穴灸2壯,每日1次,1周6次,共4周。中脘穴定位為大鼠腹白線上,臍上20 mm。氣海穴定位為大鼠腹白線上,臍下 12.5 mm[15]。干預(yù)期間,模型組大鼠死亡1只,剩9只。

1.5 標(biāo)本采集及處理

治療結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水24 h,以10%水合氯醛溶液（每 100 g體質(zhì)量注射0.3 mL）麻醉,待大鼠麻醉后腹部朝上固定在解剖板上,迅速用手術(shù)剪打開大鼠腹腔,立即摘除全胃,沿胃大彎剪開,0.9%氯化鈉溶液將胃內(nèi)容物洗凈,肉眼觀察并記錄胃黏膜情況;切取病變胃黏膜組織,取1/2胃竇部組織于4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋切片與染色;另取1/2胃竇部組織,剪碎置于凍存管內(nèi),液氮冷凍 1 h后放置于﹣80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 各組大鼠胃竇組織病理學(xué)觀察

將切片置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ各 10 min;下行梯度100%、90%、80%、70%乙醇溶液各5 min;自來水沖洗;蘇木素浸染10 min后流水沖洗10 min,1%鹽酸酒精溶液分化10 s,流水沖洗至細(xì)胞核呈藍(lán)色;伊紅溶液浸染 30 s～5 min;自來水沖洗數(shù)秒鐘;上行梯度70%、80%、90%、100%乙醇溶液各1～2 s;二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ透明各 15 min;封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組胃黏膜病變程度。

1.6.2 各組大鼠胃竇組織 PTEN、PIP2、p-mTOR、Caspase-9、MDM2蛋白檢測

取大鼠胃竇組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后于37 ℃條件下滴加一抗,4 ℃冰箱過夜并于第2天滴加二抗孵育;PBS溶液沖洗后用DAB顯色;蘇木素染色,脫水,封片。對照組分別設(shè)陽性、陰性、空白對照,用已知陽性表達(dá)組織的切片作為陽性對照組,以 PBS溶液作為空白對照組。采用 LAS Version 4.30圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行電腦圖像拍片,每張組織切片要求在固定光亮度下,隨機選取3個視野進(jìn)行拍照。拍片結(jié)束后,采用Image J 6.0軟件進(jìn)行半定量分析,可得到每張照片的平均陽性面積率（%Area）,最后取3張照片的平均值即為該組織切片的陽性目標(biāo)的平均陽性面積率。

1.6.3 各組大鼠胃竇組織 PTEN、PI3KCA、Caspase-9、MDM2 mRNA表達(dá)檢測

主要步驟為總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR擴增等。表達(dá)量的統(tǒng)計方法為采用2﹣ΔΔCt法分析數(shù)據(jù),得到各個標(biāo)本基因的 Ct值,計算△Ct,△Ct＝目的基因Ct－內(nèi)參基因Ct;△Ct的相反數(shù)＝﹣△△Ct,2﹣ΔΔCt＝﹣-△△Ct 作 2 的冪運算,即 2﹣ΔΔCt＝Fold change。序列參照Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中各目的基因及內(nèi)參基因的序列,引物由NCBI Primer-blast設(shè)計,由蘇州金唯智合成,引物序列見表1。

表1 各檢測指標(biāo)引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示,若數(shù)據(jù)方差齊則組間比較采用完全隨機單因素方差分析（One-wayANOVA）,進(jìn)一步采用SNK-q檢驗、LSD-t檢驗行多重比較;不符合正態(tài)性的計量資料采用非參數(shù)檢驗（Mann-WhitneyTest）。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05,以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃竇組織病理學(xué)改變

正常組大鼠胃黏膜固有腺體結(jié)構(gòu)排列整齊,黏膜層少見中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,但胃主細(xì)胞、壁細(xì)胞未見減少;模型組大鼠固有腺體結(jié)構(gòu)紊亂,腺體減少,變薄,形態(tài)不一,成纖維細(xì)胞增生,可見杯狀細(xì)胞,發(fā)生萎縮、腸上皮化生、假幽門腺化生和（或）異型增生,甚至個別大鼠達(dá)到低分化腺癌,黏膜層及黏膜下層有大量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等。經(jīng)4周治療后,與模型組比較,西藥組、隔藥餅灸組大鼠固有腺體排列不規(guī)整,黏膜層及下層炎性細(xì)胞相對減少,固有腺體萎縮、腸上皮化生、異型增生減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠胃竇組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）

2.2 各組大鼠胃竇組織中 PTEN、PlP2、p-mTOR、Caspase-9和MDM2蛋白表達(dá)比較

2.2.1 各組大鼠胃竇組織PTEN蛋白表達(dá)比較

正常組胃竇組織PTEN蛋白高表達(dá),胃黏膜固有腺體內(nèi)細(xì)胞核呈大面積棕褐色顆粒,胞漿黃染,分布密集;模型組胃竇組織PTEN蛋白陽性表達(dá)較低,胃黏膜固有腺體內(nèi)少量表達(dá),染色為淺藍(lán);與模型組比較,隔藥餅灸組和西藥組胃竇組織 PTEN蛋白在固有腺體內(nèi)呈散在分布黃色顆粒,主要集中在固有腺體基底部,胞漿有黃染的趨勢。與正常組比較,模型組胃竇組織PTEN蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較,西藥組和隔藥餅灸組胃竇組織PTEN蛋白陽性表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠胃竇組織PTEN的蛋白表達(dá)比較（lHC，×200）

表2 各組大鼠胃竇組織PTEN蛋白表達(dá)比較 （±s）

表2 各組大鼠胃竇組織PTEN蛋白表達(dá)比較 （±s）

注:與正常組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05

組別 n 平均陽性面積率（%area）正常組 6 49.801±6.377模型組 6 5.810±4.3541）西藥組 6 14.408±8.1661）2）隔藥餅灸組 6 13.899±3.8641）2）

2.2.2 各組大鼠胃竇組織P-AKT蛋白表達(dá)比較

正常組胃竇組織 P-AKT蛋白陽性表達(dá)較少,僅見固有腺體基底部少量胞漿黃染,著色較淺;模型組胃竇組織 P-AKT蛋白陽性表達(dá)增多,胃黏膜固有腺體大面積胞漿黃染,著色較深;與模型組比較,隔藥餅灸組和西藥組胃竇組織 P-AKT蛋白陽性表達(dá)減少,胞漿著色變淡。與正常組比較,模型組胃竇組織P-AKT蛋白陽性表達(dá)顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較,西藥組和隔藥餅灸組胃竇組織 P-AKT蛋白陽性表達(dá)下調(diào),具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

表3 各組大鼠胃竇組織P-AKT蛋白表達(dá)比較 （±s）

表3 各組大鼠胃竇組織P-AKT蛋白表達(dá)比較 （±s）

注:與正常組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05

?

圖3 各組大鼠胃竇組織P-AKT的蛋白表達(dá)比較（lHC，×200）

2.2.3 各組大鼠胃竇組織PIP2蛋白表達(dá)比較

正常組胃竇組織PIP2蛋白有少量表達(dá);模型組大鼠胃竇組織 PIP2蛋白在腺體內(nèi)高表達(dá),染色深,棕褐色顆粒分布密集;與模型組比較,隔藥餅灸組和西藥組胃竇組織PIP2蛋白表達(dá)不同程度減少,散在分布黃色顆粒,染色變淡。與正常組比較,模型組胃竇組織PIP2蛋白表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較,西藥組和隔藥餅灸組胃竇組織PIP2蛋白表達(dá)顯著降低,均具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖4、表4。

圖4 各組大鼠胃竇組織PlP2的蛋白表達(dá)比較（lHC，×200）

表4 各組大鼠胃竇組織PlP2蛋白表達(dá)比較 （±s）

表4 各組大鼠胃竇組織PlP2蛋白表達(dá)比較 （±s）

注:與正常組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05

?正常組 6 7.012±0.927模型組 6 19.821±3.7081）西藥組 6 11.976±3.7481）2）隔藥餅灸組 6 12.090±1.7391）2）

2.2.4 各組大鼠胃竇組織MDM2蛋白表達(dá)比較

正常組胃竇組織MDM2蛋白呈低表達(dá),胞漿染色為淺藍(lán)色;模型組大鼠胃竇組織MDM2在腺體內(nèi)呈高表達(dá),胞漿黃染,彌漫分布,胞核棕褐色顆粒分布密集;與模型組比較,隔藥餅灸組和西藥組胃竇組織MDM2蛋白陽性表達(dá)降低,胞核上的黃色顆粒變少,胞漿染色變淺。與正常組比較,模型組大鼠的 MDM2蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較,西藥組和隔藥餅組胃竇組織MDM2蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖5、表5。

圖5 各組大鼠胃竇組織MDM2的蛋白表達(dá)比較（lHC，×200）

表5 各組大鼠胃竇組織MDM2蛋白表達(dá)比較 [M（P25，P75）]

2.2.5 各組大鼠胃竇組織Caspase-9蛋白表達(dá)比較

正常組胃竇組織 Caspase-9蛋白高表達(dá),胃黏膜腺體內(nèi)大面積棕褐色顆粒,胞漿彌漫性黃染;模型組胃竇組織 Caspase-9蛋白低表達(dá),胃黏膜腺體內(nèi)少量表達(dá),染色為淺藍(lán);與模型組比較,隔藥餅灸組和西藥組胃竇組織 Caspase-9蛋白陽性表達(dá)有不同程度增加,主要表現(xiàn)在胃黏膜腺體基底部的黃色顆粒增加,胞漿呈淡黃色。與正常組比較,模型組胃竇組織Caspase-9蛋白陽性表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較,西藥組和隔藥餅灸組胃竇組織Caspase-9蛋白表達(dá)量增加,均具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖6、表6。

圖6 各組大鼠胃竇組織Caspase-9的蛋白表達(dá)比較（lHC，×200）

表6 各組大鼠胃竇組織Caspase-9蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠胃竇組織Caspase-9蛋白表達(dá)比較（±s）

注:與正常組比較 1）P＜0.05;與模型組比較 2）P＜0.05

組別 n 平均陽性面積率（%area）正常組 6 29.700±5.373模型組 6 8.009±2.8971）西藥組 6 16.057±3.3541）2）隔藥餅灸組 6 14.622±4.4021）2）

2.3 各組大鼠胃竇組織 PTEN、Pl3KCA、Caspase-9和P53 mRNA表達(dá)比較

與正常組比較,模型組胃竇組織 PTEN、Caspase-9 mRNA表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較,隔藥餅灸組胃竇組織Caspase-9、PI3KCA mRNA表達(dá)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;西藥組胃竇組織 PTEN、Caspase-9、PI3KCA mRNA表達(dá)均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表 7。

表7 各組大鼠胃竇組織PTEN、Pl3KCA、Caspase-9和P53 mRNA的表達(dá)比較

4 討論

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病,本病遷延不愈發(fā)展易發(fā)生癌變。CAG到胃癌的演變是多因素、多階段、多步驟的綜合結(jié)果,目前公認(rèn)的胃癌發(fā)生模式為正常胃黏膜、慢性胃炎、萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型增生最終發(fā)展為胃癌（gastric cancer, GC）[16]。本研究采用 MNNG誘導(dǎo)聯(lián)合夾尾刺激加饑餓失常的綜合方法復(fù)制了 CAG大鼠模型,其出現(xiàn)組織病理學(xué)變化與臨床CAG的組織形態(tài)比較接近,可見炎癥、萎縮、腸化和異型增生,甚至出現(xiàn)腺癌的變化。提示MNNG誘導(dǎo)的CAG動物模型比較適合用于基礎(chǔ)研究[14,17]。

針灸在治療慢性萎縮性胃炎中發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道艾灸可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外信號分子的表達(dá),抑制Hp對胃黏膜的炎性損傷[18]。筆者團(tuán)隊前期和本次研究結(jié)果均提示,隔藥餅灸CAG大鼠中脘、氣海兩穴干預(yù)后,能觀察到艾灸能改善 CAG大鼠的胃竇組織形態(tài)學(xué)的變化,減輕胃黏膜炎癥反應(yīng),降低腺體萎縮、腸化和異型增生的程度[19]。中脘和氣海皆為任脈要穴,中脘為胃之募穴,氣海為肓之原,是目前灸法治療CAG及調(diào)節(jié)免疫功能常用取穴思路[20-21]。

艾灸可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點治療CAG大鼠。早期發(fā)現(xiàn)PTEN的雜合性缺失發(fā)生率隨CAG到GC病理進(jìn)展增加[22];臨床胃黏膜組織PTEN表達(dá)隨著病灶的加重而降低[23],相比于癌旁正常胃黏膜,異形增生和胃癌患者的胃黏膜PTEN表達(dá)具顯著差異。胃癌患者癌組織發(fā)現(xiàn)多種形式的 PTEN的失活[24],除了胃癌組織外,PTEN在多種瘤組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異常[25-28]。本研究發(fā)現(xiàn),隔藥餅灸干預(yù)CAG大鼠中脘和氣海穴后,胃黏膜組織的PTEN蛋白表達(dá)明顯增加,提示艾灸能促進(jìn)抑癌基因 PTEN的蛋白及 mRNA表達(dá),可能是艾灸抑制 CAG大鼠胃黏膜組織炎-癌轉(zhuǎn)變的作用基礎(chǔ)。

胃腸道腫瘤發(fā)病機制與抑癌基因丟失和癌基因活化導(dǎo)致信號通路的異常激活密切相關(guān)[6]。單核苷酸多態(tài)性研究指出PTEN、PI3KCA、AKT的遺傳變異與胃癌的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)[29]。CAG胃黏膜病灶病理程度升高,P-AKT陽性表達(dá)亦高[30]。對 1 275例 GC患者和1 436例對照病例進(jìn)行對照研究指出PI3K/AKT通路參與胃癌的發(fā)生[31]。其中 P-AKT陽性表達(dá)高的 AKT rs1130233多態(tài)性與Hp陰性感染者的CAG風(fēng)險增加有關(guān),與Hp感染者的CAG到胃癌級聯(lián)風(fēng)險有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),艾灸能上調(diào)PI3KCA的mRNA表達(dá)水平,抑制PIP2蛋白表達(dá),抑制AKT磷酸化,提示艾灸發(fā)揮抑癌作用可能是通過PTEN-AKT途徑發(fā)揮作用。PI3K通過磷酸化磷脂酰肌醇 4,5-雙磷酸[PI（4,5）P2]累積磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸[PI（3,4,5）P3]活化 AKT,PTEN 可水解 PI（3,4,5）P3 和磷脂酰肌醇 3,4-雙磷酸[PI（3,4）P2]的D3位磷酸拮抗PI3K/AKT信號[32],抑制細(xì)胞過度的生長與增殖,降低腫瘤發(fā)生可能。除了PI（3,4,5）P3之外,PI（3,4）P2與AKT活性直接相關(guān)[33],表明PIP2的生成或降解作為PI3K和PTEN的第二信使參與此促癌通路。CAG患者胃黏膜病理程度升高,P-AKT陽性率亦高[31]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是PTEN/PI3K/AKT通路的重要協(xié)調(diào)因子,PI3Ks分3類,其中I類PI3Ks依據(jù)調(diào)控模式分IA類和IB類,PIK3CA作為同源類IA催化亞型于腫瘤中廣泛表達(dá),其基因突變或異常表達(dá)是導(dǎo)致 PI3K/AKT信號通路過度激活的關(guān)鍵因素[34-36]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),隔藥餅灸可能通過上調(diào)PTEN-AKT抑癌途徑,抑制 MDM2蛋白活性,促進(jìn)Caspase-9凋亡蛋白的表達(dá),修復(fù)損傷的胃黏膜,改善CAG大鼠胃黏膜的萎縮、腸化生和異型增生的病理狀態(tài),防治CAG發(fā)生癌前病變。PI3K/AKT信號通路中的AKT活化可磷酸化MDM2或Caspase-9。在CAG到GC的病理進(jìn)程,隨著程度加重,胃黏膜病變組織 MDM2蛋白陽性表達(dá)也逐增[37],表明MDM2參與胃黏膜病變的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道 PTEN的過表達(dá)抑制 AKT活化,激活Caspase-9從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[38];AKT活化誘導(dǎo)Caspase-9的前體（pro caspase-9）第196位Ser磷酸化,阻斷其與凋亡活化因子結(jié)合,抑制Caspase-9促凋亡信號[39-41],抑制胃癌前病變細(xì)胞凋亡,促進(jìn)CAG到GC的級聯(lián)進(jìn)程。

綜上所述,艾灸有調(diào)節(jié)免疫、改善血液循環(huán)、抗癌及抗衰老等作用[42]。CAG伴有胃腺部分萎縮、黏膜受損和炎癥,艾灸對 CAG臨床治療有改善胃部不適等癥狀,也能減輕胃黏膜炎癥。代謝組學(xué)及外周血差異表達(dá)基因研究,說明艾灸治療 CAG大鼠效應(yīng)機制涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、免疫疾病、氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝等通路[19,43]。本研究從CAG胃黏膜的PTEN表達(dá)降低,伴隨AKT的過度激活的角度,研究具有脂質(zhì)和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因 PTEN,作用于 PIP2,通過PI3K/AKT的信號通路,介導(dǎo)了MDM2和Caspase-9的生物學(xué)功能。但也有研究發(fā)現(xiàn)MNNG造模的CAG大鼠胃黏膜PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)降低,而PI3K、AKT mRNA和蛋白表達(dá)升高[44]。通過本研究,艾灸中脘、氣海穴干預(yù) CAG大鼠的胃黏膜保護(hù)效應(yīng)可能是通過 PTEN-AKT抑癌途徑,影響MDM2和Caspase-9的生物學(xué)功能而發(fā)揮作用的。