王玉恒，吉哈利，彭燕娟，索朗卓嘎，于子淇，鄧 愧，周海娟，其美央宗，丹真次旦，包玉花*

（1.西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000；2.西藏蓮莖生物科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

牦牛主要生活在西藏高海拔地區(qū)，具有耐嚴(yán)寒、耐疲勞、善于走陡坡險(xiǎn)路等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)西藏畜牧業(yè)發(fā)展具有重要作用[1]。近年來(lái)，牦牛的細(xì)菌病感染率、死亡率逐漸增加，已嚴(yán)重影響到牦牛健康及養(yǎng)殖戶(hù)經(jīng)濟(jì)收入。因此，研究牦牛細(xì)菌性傳染病非常必要。

多殺性巴氏桿菌是一種兩端鈍圓、中央微凸的革蘭氏陰性短桿菌，能引起牛、羊、雞、兔等多種動(dòng)物患急性敗血型、炎性出血型等癥狀為主的傳染病。該病主要以呼吸道、消化道、皮膚黏膜損傷及吸血蚊蟲(chóng)叮咬等方式傳播。截至目前，對(duì)多殺性巴氏桿菌分離鑒定、診斷、治療以及防控的研究越來(lái)越多[2-4]。如1954年廖延雄[5]首次研究了牦牛多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特性及生化特性；1979年郭大和等[6]從我國(guó)水牛、黃牛組織中分離出了多殺性巴氏桿菌，經(jīng)鑒定均為B型；1985年肖克宇等[7]發(fā)現(xiàn)了培養(yǎng)多殺性巴氏桿菌的新方法；1995年魏天文等[8]研究了一種檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的多殺性巴氏桿菌的ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法；2001年Townsend等[9]根據(jù)Pm莢膜編碼基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了一套分子生物學(xué)的鑒定及分型方法；2016年李春生等[10]研究了青海牦牛A型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定；2018年蔡其剛等[11]研究了牦牛出血性敗血癥的病原分離及鑒定；2019年闞威等[12]在青海病死牛組織中分離出了4株病原菌，并鑒定為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌。本試驗(yàn)對(duì)病死牦牛的內(nèi)臟組織進(jìn)行了細(xì)菌分離，并通過(guò)涂片鏡檢、生化鑒定、熒光定量PCR法對(duì)分離細(xì)菌株進(jìn)行鑒定，再利用17種抗菌藥物對(duì)該細(xì)菌株進(jìn)行藥敏分析，以期為該病的診斷、治療以及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR? Green Master Mix試劑，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；胎牛血清，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管、抗菌素藥敏片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；分析純均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR儀（QS1，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），體視顯微鏡（CX21FS1C，奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（SHP-300，上海鴻都電子科技有限公司），高速冷凍離心機(jī)（TGL16，湖南星科科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（HH-2A，北京科偉永興儀器有限公司），電子天平（0.001 g）（SY204C，上海佑科儀器儀表有限公司），其余試驗(yàn)耗材均為國(guó)產(chǎn)。

1.3 樣品來(lái)源

樣品來(lái)源于西藏自治區(qū)那曲市安多縣某養(yǎng)殖戶(hù)的一頭病死牦牛，無(wú)菌采集心臟、肝臟、腎臟、脾臟、喉管及淋巴結(jié)等組織樣品，共計(jì)11份。2020年12月24日送至西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 病料觸片鏡檢 將采集的病料心臟、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織的病變部位觸片，革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 病原菌分離及培養(yǎng) 將組織病料接種于含有5%血清的肉湯中進(jìn)行增菌，37℃條件下培養(yǎng)24 h。再將血清肉湯劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿、血清瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿和三糖鐵瓊脂斜面，37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。隨機(jī)挑選單菌落接種于血清肉湯，培養(yǎng)24 h，涂片染色鏡檢。

1.4.3 生化鑒定 按照細(xì)菌微量生化鑒定管說(shuō)明書(shū)，將血清肉湯培養(yǎng)物接種至生化反應(yīng)管，觀察顯色反應(yīng)。結(jié)果判定參照《獸醫(yī)微生物學(xué)》中多殺性巴氏桿菌生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)，詳見(jiàn)表1。

表1 多殺性巴氏桿菌生理生化指標(biāo)

1.4.4 細(xì)菌基因組DNA提取 取純化后血清肉湯培養(yǎng)物1 ml，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌DNA提取。

1.4.5 引物合成 參考Townsend K M等[9]研究文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)多殺性巴氏桿菌鑒定引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及大小見(jiàn)下表2。

表2 Real-time PCR引物信息

1.4.6 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件 多殺性巴氏桿菌熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl，具體操作如下：SYBR? Green Master Mix 10 μl，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。PCR擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 15 s，退火溫度（表2）15 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)；溶解曲線：測(cè)量溫度為50～95℃。每組樣品重復(fù)檢測(cè)3次，分析擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增溶解曲線。

1.4.7 藥敏試驗(yàn) 取已鑒定培養(yǎng)后菌液200 μl滴加至血清瓊脂平皿，用無(wú)菌涂菌棒涂布菌液，保證涂布均勻。再用鑷子取藥敏片貼至血清瓊脂平皿表面并壓平，37℃條件下培養(yǎng)18 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。每種藥物3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值，判定敏感程度。藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。

表3 藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 病料鏡檢結(jié)果

在肺臟、肝臟病料組織中，鏡檢到短小桿菌。經(jīng)革蘭氏染色，結(jié)果為革蘭氏陰性桿菌，見(jiàn)圖1。

圖1 病料組織的革蘭氏染色

2.2 病原分離培養(yǎng)結(jié)果及菌落形態(tài)特征

將病料組織的5%血清肉湯培養(yǎng)液接種于血清瓊脂平皿，培養(yǎng)24 h，形成了表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣較整齊的半透明灰白色菌落，無(wú)溶血情況；接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上菌落貧瘠，且直徑小于血清瓊脂平皿上的菌落；接種于麥康凱瓊脂平皿上未見(jiàn)生長(zhǎng)；三糖鐵瓊脂斜面底部變?yōu)辄S色。挑取血清瓊脂平皿上的菌落，涂片鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌，見(jiàn)圖2。

圖2 細(xì)菌液的革蘭氏染色

2.3 生化鑒定結(jié)果

經(jīng)細(xì)菌微量生化鑒定，該細(xì)菌株產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可分解葡萄糖、蔗糖和甘露醇，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖，氧化酶、觸酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性，脲酶試驗(yàn)為陰性，表明該細(xì)菌株符合多殺性巴氏桿菌生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

以細(xì)菌組DNA為模板，利用熒光定量PCR檢測(cè)法對(duì)多殺性巴氏桿菌鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增。由圖3、圖4可知，Kmt1基因的擴(kuò)增曲線有明顯的S型指數(shù)增長(zhǎng)曲線，且溶解曲線為單峰；由圖5、圖6可知，16S rRNA的擴(kuò)增曲線有明顯的S型指數(shù)增長(zhǎng)曲線，且擴(kuò)增溶解曲線為單峰。表明該細(xì)菌株DNA基因組中能擴(kuò)增出多殺性巴氏桿菌鑒定基因。

圖3 Kmt1基因的擴(kuò)增曲線

圖4 Kmt1基因的溶解曲線

圖5 16S rRNA的擴(kuò)增曲線

圖6 16S rRNA的溶解曲線

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)檢測(cè)了該細(xì)菌株對(duì)鏈霉素、頭孢類(lèi)等17種抗菌藥物的敏感程度。由表4可知，該細(xì)菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、氧氟沙星、麥迪霉素等13種抗菌藥物表現(xiàn)為敏感，對(duì)氨曲南、頭孢噻肟、哌拉西林、鏈霉素等4種抗菌藥物表現(xiàn)為中介，無(wú)抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

受西藏地區(qū)空氣稀薄、氣壓低、含氧量少等因素影響，大多數(shù)牦牛的呼吸系統(tǒng)易遭受損傷。多殺性巴氏桿菌主要侵襲呼吸系統(tǒng)、局灶性感染以出血性敗血癥為主要特征，是影響西藏牦牛健康的主要細(xì)菌之一。

首先，本研究無(wú)菌采取病死牦牛組織樣品11份，觸片鏡檢發(fā)現(xiàn)大量革蘭氏陰性短桿菌，再利用5%血清肉湯培養(yǎng)液復(fù)壯，接種于血清瓊脂平皿、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿等平皿，結(jié)果顯示該細(xì)菌株在血清瓊脂平皿可形成表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣較整齊的半透明灰白色菌落，無(wú)溶血情況；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上菌落貧瘠，且直徑小于血清瓊脂平皿的菌落；在麥康凱瓊脂平皿上未見(jiàn)生長(zhǎng)；三糖鐵瓊脂斜面底部變?yōu)辄S色，菌液鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌，因此初步懷疑為巴氏桿菌。

其次，利用微量生化鑒定管對(duì)該細(xì)菌株進(jìn)行了生化鑒定，結(jié)果顯示該細(xì)菌株符合多殺性巴氏桿菌生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

再次，以細(xì)菌組DNA為模板，用熒光定量PCR檢測(cè)法對(duì)多殺性巴氏桿菌鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該細(xì)菌株DNA基因組中能擴(kuò)增出多殺性巴氏桿菌鑒定基因，進(jìn)一步表明該細(xì)菌株為多殺性巴氏桿菌株。

最后，利用17種抗菌藥物對(duì)該細(xì)菌株進(jìn)行了藥敏分析，結(jié)果顯示鏈霉素、頭孢類(lèi)等17種抗菌藥物中13種抗菌藥物對(duì)該細(xì)菌株有抑制作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)病死牦牛內(nèi)臟組織進(jìn)行了細(xì)菌分離，再通過(guò)涂片鏡檢、生化鑒定、熒光定量PCR法對(duì)分離細(xì)菌株進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明分離細(xì)菌株為多殺性巴氏桿菌株。通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松、頭孢他啶、氧氟沙星、麥迪霉素等13種抗菌藥物對(duì)該細(xì)菌株有顯著抑制作用，但其抑菌機(jī)理還需進(jìn)一步研究。對(duì)氨曲南、頭孢噻肟、哌拉西林、鏈霉素等4種抗菌藥物表現(xiàn)為中介，無(wú)抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥。