張露凡，宋普文，毋柳柳，胡海燕，李成偉

(河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院/河南省植物遺傳改良與土壤修復(fù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453000)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界最重要的糧食之一，也是我國重要的糧食作物，目前我國耕地面積逐漸減少，保證糧食作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和高質(zhì)量發(fā)展就顯得尤為重要。同時(shí)我國也是小麥的生產(chǎn)大國和消費(fèi)大國，小麥赤霉病的流行已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國的糧食和食品生產(chǎn)安全[1]。

小麥赤霉病是由鐮刀菌屬真菌引起的一種世界性病害，流行年份會導(dǎo)致小麥產(chǎn)量下降，甚至導(dǎo)致絕收[2]。同時(shí)鐮刀菌還會在小麥體內(nèi)產(chǎn)生多種真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等，人畜誤食會造成嚴(yán)重危害[3]。

減輕小麥赤霉病危害最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的手段就是培育抗病品種[4]。但是國內(nèi)外抗源較少，農(nóng)藝性狀較差和抗性機(jī)理不清楚阻礙了抗病品種的培育[5]。因此，挖掘小麥赤霉病抗性基因資源、創(chuàng)制抗赤霉病新種質(zhì)以及研究小麥抗赤霉病抗性機(jī)理仍是目前小麥赤霉病的研究方向。Fhb1是在蘇麥3號中發(fā)現(xiàn)的抗赤霉病效應(yīng)和穩(wěn)定性最好的位點(diǎn)，隨后在望水白、黃方柱和日本品種Nyubai中均發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)[6]。Rawat等[7]通過對蘇麥3號3BS染色體上主效位點(diǎn)Fhb1的精細(xì)定位和圖位克隆，獲得了抗赤霉病擴(kuò)展的基因PFT(pore-forming toxin-like)。2019年Su等[8]在Fhb1位點(diǎn)鑒定到一個(gè)編碼組氨酸富集的鈣離子結(jié)合蛋白基因TaHRC，被認(rèn)為是Fhb1位點(diǎn)的主要抗性基因，并發(fā)現(xiàn)TaHRC基因沉默后小麥抗性增強(qiáng)，而Li等[9]將TaHRC基因過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)小麥抗性增強(qiáng)，所以，其作用機(jī)制目前也存在分歧，同時(shí)也說明了小麥赤霉病抗性機(jī)制可能不是由一個(gè)基因控制的，可能存在其他基因的干預(yù)。He等[10]通過以PFT為誘餌篩選小麥酵母雙雜文庫，得到23種與PFT互作的蛋白，并通過實(shí)時(shí)定量PCR分析這些互作蛋白基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)5種蛋白在植物生長和發(fā)育的各個(gè)過程中以及在抵抗生物和非生物脅迫方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究先以PFT為誘餌蛋白篩選小麥酵母雙雜文庫，得到一個(gè)新的基因，然后通過酵母雙雜交試驗(yàn)、雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量分析，對其表達(dá)模式以及與小麥TaPFT的相互作用進(jìn)行分析，以期為解析小麥赤霉病抗性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

抗赤霉病小麥蘇麥3號和本氏煙草均由河南科技學(xué)院河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心提供。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞、酵母Y2HGold菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 小麥RNA的提取與cDNA的合成

在小麥生長至兩葉一心時(shí)，取一整株小麥用ddH2O沖洗干凈后迅速放入液氮冷凍，-80 ℃保存。采用Trizol法提取小麥RNA，使用RNase-Free DNase I試劑盒去除混雜的基因組DNA，用超微量分光光度計(jì)測量RNA樣品的純度和濃度。cDNA的合成按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(寶生物，大連)說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.2.2 PFT互作蛋白基因的酵母篩庫

將TaPFT基因連接至酵母表達(dá)載體pGBKT7上，通過酵母轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入酵母菌株Y2HGold中，涂布于SD-Trp平板培養(yǎng)基上， 30 ℃培養(yǎng)長出單克隆后，挑取單克隆接種至50 mL SD-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，作為原代培菌液。利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(TaKaRa，大連)制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，將前期制備好的小麥酵母雙雜cDNA文庫轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)中，并涂布于SD/-His-Leu-Trp-Ade平板培養(yǎng)基上，于 30 ℃培養(yǎng)3～7 d后，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，使用酵母質(zhì)粒提取試劑盒(天根，北京)提取酵母質(zhì)粒，并以酵母質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒(天根，北京)進(jìn)行回收后，送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。用ORF Finder分析表明，其中一個(gè)文庫插入序列具有771 bp的完整編碼框，進(jìn)一步BlAST分析表明，其序列與已知小麥cDNA文庫克隆Triticum aestivum clone wyr1c.pk002.o12(BT008921.2)序列具有99.48%的相似性，其編碼蛋白與野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)果糖激酶Fructokinase-2蛋白序列具有99.48%的相似性，因此推測該基因編碼蛋白為Fructokinase，命名為TaFRK。

1.2.3 基因克隆

使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物TaFRK-F/R和 TaPFT-F/R(表1)，擴(kuò)增TaFRK和TaPFT基因的全長序列。以TaFRK和TaPFT的cDNA為模板擴(kuò)增TaFRK(771 bp)和TaPFT(1 434 bp)的編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃(TaFRK：45 s；TaPFT：90 s)，延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 7 mim，4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物膠回收后分別與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂抹于含有Amp+抗性的培養(yǎng)基上，隨機(jī)選取5個(gè)單克隆菌落，菌落PCR鑒定為陽性后，送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 酵母雙雜交分析

使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)的引物pGADT7-TaFRK-F/R和pGBKT7-TaPFT-F/R(表1)分別擴(kuò)增TaFRK和TaPFT基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并進(jìn)行回收后，將回收產(chǎn)物TaFRK連接至經(jīng)過EcoR I和XhoI雙酶切的pGADT7載體上，構(gòu)建pGADT7-TaFRK重組載體；將回收產(chǎn)物TaPFT連接至經(jīng)BamH I和EcoR I酶切的pGBKT7載體上，構(gòu)建pGBKT7-TaPFT重組載體，然后將這兩個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽性克隆送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。用通用引物T7和3AD對pGADT7-TaFRK進(jìn)行測序，用通用引物T7和3BD對pGBKT7-TaPFT進(jìn)行測序，用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行對比分析。

表1 本試驗(yàn)使用的引物Table 1 Primers used in the study

使用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold，以pGBKT7-TaPFT和pGADT7-TaFRK共轉(zhuǎn)化作為試驗(yàn)組，以pGBKT7和pGADT7空載體共轉(zhuǎn)化作為對照組，pGBKT7-TaPFT和pGADT7、pGADT7-TaFRK和pGBKT7共轉(zhuǎn)化作為陰性對照。轉(zhuǎn)化后的酵母涂抹在含有X-α-Gal和AbA的 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板培養(yǎng)基上，于30 ℃靜置培養(yǎng)3～ 5 d，拍照并記錄。

1.2.5 雙分子熒光互補(bǔ)分析

使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)的引物BiFC-TaFRK-F/R和BiFC-TaPFT-F/R(表1)分別擴(kuò)增TaFRK和TaPFT基因的開放閱讀框。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并回收。使用Gateway體系構(gòu)建雙分子熒光互補(bǔ)載體，經(jīng)BP反應(yīng)將回收產(chǎn)物TaFRK和TaPFT分別連接至pDNOR221中間載體，構(gòu)建pDNOR221-TaFRK和pDNOR221-TaPFT重組載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對PCR鑒定為陽性的單克隆送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序正確且含有pDNOR221-TaFRK和pDNOR221-TaPFT的單克隆分別進(jìn)行搖菌提質(zhì)粒后，經(jīng)過MluI快切酶酶切，用回收試劑盒(天根，北京)進(jìn)行回收，將目的基因經(jīng)LR反應(yīng)連接至YC和YN載體中，構(gòu)建YC-TaFRK和YN-TaPFT載體，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對PCR鑒定為陽性的單克隆送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序。用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行對比分析。

將YC-TaFRK和YN-TaPFT載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中進(jìn)行搖培，待OD600約為0.6～0.8時(shí)，5 000 g離心1 min富集菌體，用無菌水洗滌菌體，再用煙草侵染緩沖液(D-glucose 250 mg，0.5 mol·L-1的MES 5 mL， 1 mol·L-1的乙酰丁香酮5 μL，0.02 mol·L-1的Na3PO4·12H2O 5 mL，加無菌水至50 mL)重懸菌體后將兩種菌液等比例混合，黑暗靜置2 h，然后使用注射器將菌液注射至6～8周齡的煙草葉片；同時(shí)設(shè)置對照將空載體YC和YN注射至煙草，用記號筆標(biāo)記注射區(qū)域，25 ℃培養(yǎng)48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果，并拍照。

1.2.6 接種禾谷鐮刀菌后TaFRK基因的表達(dá)模式分析

按照Bai等[11]的方法用綠豆湯培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮刀菌，產(chǎn)生孢子后于7 000 g 離心15 min收集孢子，用無菌水沖洗2～3遍。于小麥開花期，使用移液器將15 μL禾谷鐮刀菌孢子懸浮液(200個(gè)孢子·μL-1)注入穗狀花序的中央小花中，接種過的穗包裹在夾層袋中，夾層袋內(nèi)部用水霧化，分別在小麥接種禾谷鐮刀菌0、 3、6、12、24、36、48和72 h時(shí)取樣，對照組用無菌水接種小麥小穗。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集2個(gè)小穗，取下后置于液氮中冷凍， -80 ℃保存。

為了標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)反應(yīng)中的cDNA總量，并消除樣品之間的差異，以小麥微管蛋白基因Tubulin作為內(nèi)部參照。每個(gè)樣品重復(fù)3次，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算TaFRK基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交載體和雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建

用引物TaPFT-F/R和TaFRK-F/R擴(kuò)增TaPFT和TaFRK基因的全長片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1A和圖1B所示。對擴(kuò)增片段進(jìn)行回收，與pMD19-T載體16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑5個(gè)單克隆搖菌，菌液PCR驗(yàn)證為陽性后進(jìn)行測序。將測序正確的菌液提取質(zhì)粒后分別連接在pGBKT7(BamH I和EcoR I雙酶切)和pGADT7(EcoR I和XhoI雙酶切)載體上。經(jīng)PCR檢測后送測序，分別得到約1 434和771 bp的片段(圖1C和圖1D)，與TaPFT和TaFRK的片段大小一致，表明表達(dá)載體構(gòu)建 成功。

雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建使用Gateway體系，分別使用引物BiFC-TaPFT-F/R和BiFC-TaFRK-F/R分別擴(kuò)增TaPFT和TaFRK基因的開放閱讀框，經(jīng)BP反應(yīng)將TaPFT和TaFRK基因連接至中間載體pDNOR221，菌落PCR驗(yàn)證為陽性后送測序。將測序正確的載體用MluI酶切后回收，然后經(jīng)LR反應(yīng)將TaPFT和TaFRK分別與YN和YC載體連接，并進(jìn)行測序，分別得到大小分別為1 434和771 bp的片段(圖1E和1F)，與TaPFT和TaFRK的片段大小一致，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M：Marker DL2000；M1：Marker DL5000.圖1 TaPFT和 TaFRK基因的克隆及酵母雙雜交載體和雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建Fig.1 Cloning of TaPFT and TaFRK genes and construction of yeast two hybrid vector and bimolecular fluorescence complementary vector of TaPFT and TaFRK

2.2 酵母雙雜交驗(yàn)證 TaFRK和 TaPFT的相互 作用

酵母雙雜交是鑒定蛋白相互作用最常用的手段。將共轉(zhuǎn)pGBKT7-TaPFT和pGADT7-TaFRK、pGBKT7-TaPFT和pGADT7、pGBKT7和pGADT7-TaFRK、pGBKT7和pGADT7的酵母菌菌株Y2HCold在含有X-α-Gal和AbA的SD/-His-Leu-Trp-Ade的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有共轉(zhuǎn)pGBKT7-TaPFT和pGADT7-TaFRK的酵母變藍(lán)(圖2)。表明TaPFT和TaFRK基因可以在酵母中發(fā)生相互作用。

a：pGBKT7-TaPFT載體與pGADT7-TaFRK載體共轉(zhuǎn)酵母涂板；b：pGBKT7-TaPFT載體與pGADT7載體共轉(zhuǎn)酵母涂板；c：pGBKT7載體與pGADT7-TaFRK載體共轉(zhuǎn)酵母涂板；d：pGBKT7載體與pGADT7載體共轉(zhuǎn)酵母涂板。a: pGBKT7-TaPFT vector and pGADT7-TaFRK vector were co-transferred into yeast; b: pGBKT7-TaPFT vector and pGADT7 vector were co-transferred into yeast; c: pGBKT7 vector and pGADT7-TaFRK vector were co-transferred into yeast; d: pGBKT7 vector and pGADT7 vector were co-transferred into yeast.圖2 酵母雙雜交檢測 TaFRK和 TaPFT的相互作用Fig.2 Interaction between TaPFT and TaFRK detected by yeast two-hybrid system

2.3 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證 TaFRK和 TaPFT的相互作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證TaFRK和TaPFT是否可以在植物體內(nèi)發(fā)生相互作用，利用雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)探討TaFRK和TaPFT在煙草細(xì)胞中的相互作用情況。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，攜帶YC-TaFRK和YN-TaPFT農(nóng)桿菌組合的煙草表皮細(xì)胞中可以觀察到黃色熒光，且熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，表明TaFRK和TaPFT在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生了相互作用，而只攜帶YC和YN農(nóng)桿菌組合的煙草表皮細(xì)胞中未觀察到黃色熒光。

圖3 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)檢測 TaPFT和 TaFRK相互作用Fig.3 Interaction between TaPFT and TaFRK detected by Bi-Fluorescent Complementation

2.4 接種禾谷鐮刀菌后 TaFRK的表達(dá)模式

由表2可以看出，隨著時(shí)間的延長，接種禾谷鐮刀菌孢子處理組TaFRK基因的相對表達(dá)量總體上呈上升趨勢(除接種12 h時(shí)有所下降)；而對照組TaFRK基因的相對表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢。在接種6～72 h(除接種12 h)，處理組TaFRK基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組。表明禾谷鐮刀菌孢子侵染后誘導(dǎo)了TaFRK基因的上調(diào)表達(dá)。說明TaFRK基因可能參與小麥赤霉病抗性反應(yīng)。

表2 接種禾谷鐮刀菌后小麥小穗中TaFRK的相對表達(dá)量Table 2 Relative expression of TaFRK gene in wheat spikelets after anoculation with Fusarium graminearum spores

3 討 論

果糖激酶(Frlctokinase，F(xiàn)RK)是己糖激酶的一種，不僅參與糖的代謝，還可作為糖感受器和信號分子來調(diào)控植物的生長發(fā)育[12-14]，激活或阻遏植物體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)來影響細(xì)胞周期、光合作用、碳?xì)浯x、逆境響應(yīng)、萌發(fā)、營養(yǎng)生長、生殖發(fā)育、衰老等過程[15]。Granot等[16]通過嫁接試驗(yàn)表明，反義抑制番茄LeFRK2可引起葉片枯萎以及莖組織中活性木質(zhì)部面積明顯變小。說明LeFRK2參與木質(zhì)部的發(fā)育過程，且木質(zhì)部發(fā)育可能與果糖有關(guān)。果糖是蔗糖的水解產(chǎn)物，蔗糖合成酶(SUSY)可將蔗糖裂解成UDP葡萄糖和果糖，其中UDP葡萄糖已經(jīng)證明參與番茄的維管系統(tǒng)表達(dá)[17-18]，這說明SUSY也可能與木質(zhì)素發(fā)育有關(guān)。

Roach等[19]研究表明，在楊木發(fā)育過程中RNA干擾FRK2基因的表達(dá)，可增加可溶性糖的含量以及降低己糖磷酸和UDP-葡萄糖的含量，表明FRK2基因與胞壁多糖前體的碳流有關(guān)。

FRK2蛋白的活性降低也導(dǎo)致纖維細(xì)胞壁變薄，纖維素比例降低[19]。這一結(jié)果確立了FRK2在木材纖維素碳通量中的中心作用。

Tomassini等[20]研究表明，禾谷鐮刀菌在入侵小麥時(shí)在體外產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶等降解宿主細(xì)胞壁的酶來降解細(xì)胞壁，從而穿透和定殖宿主組織。而木質(zhì)素在禾本科植物細(xì)胞壁占比20%，是一種重要的結(jié)構(gòu)成分，可防御病原體的入侵，使細(xì)胞壁對細(xì)胞壁降解酶更具抵抗力，同時(shí)阻止病原體產(chǎn)生的毒素?cái)U(kuò)散。Lionetti等[21]研究表明，較高的S型木質(zhì)素含量可能是一種與抗病性有關(guān)的細(xì)胞壁生化特性，同時(shí)也表明有利于S型木質(zhì)素積累的基因可能參與了對病原菌的抗性。

Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdFRK2的轉(zhuǎn)錄受到褪黑素(N-乙?；?5-甲氧基色胺)的抑制，較高的褪黑素濃度會抑制MdFRK2的表達(dá)和降低FRK蛋白的活性。褪黑素是植物中廣泛存在的具有高度保守性的多功能小分子，當(dāng)由于生物脅迫導(dǎo)致細(xì)胞滲漏時(shí)，可通過激活防御相關(guān)基因的表達(dá)參與植物的光周期反應(yīng)、清除活性氧以及保護(hù)植物免受細(xì)菌病原體的侵害[23-24]。說明MdFRK2受褪黑素的調(diào)控，進(jìn)而參與植物的抗病 過程。

本研究使用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證明，TaFRK和抗病基因PFT能夠發(fā)生互作反應(yīng)，實(shí)時(shí)熒光定量研究表明，TaFRK基因表達(dá)受赤霉病侵染誘導(dǎo)。而FRK基因在植物細(xì)胞壁和木質(zhì)素合成中起重要作用[20-21]，我們推測TaPFT可能通過與TaFRK互作影響細(xì)胞壁或木質(zhì)素的積累來提高植物細(xì)胞壁的抗病特性。本研究為解讀小麥抗赤霉病抗性機(jī)理具有一定的參考意義，為解析TaPFT抗性機(jī)制提供新途徑。