李軍帥，黃美瑕，宋 敏，付體華

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

小麥是世界上主要糧食作物之一，同時也是我國第三大糧食作物，其生產(chǎn)的安全性對保障中國糧食安全和社會穩(wěn)定具有重要的意義[1]。在長期的小麥育種中，由于注重骨干或核心高產(chǎn)品種資源之間的雜交，當今廣泛種植的小麥栽培品種遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，遺傳多樣性逐漸降低，因此，開發(fā)新的小麥遺傳資源對解決小麥育種當前問題以及對小麥種質(zhì)資源的創(chuàng)新至關(guān)重要[2-3]。

染色體在生物進化進程中會發(fā)生變異，其中易位是其重要變異方式之一。染色體易位可以在物種內(nèi)自然產(chǎn)生，也可以人工誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括利用物理化學(xué)誘導(dǎo)劑、遠緣雜交等染色體工程技術(shù)。染色體易位不僅使遺傳連鎖群發(fā)生改變，而且影響基因的表達，生物性狀也隨之變化。染色體易位也是物種進化進程中新基因組產(chǎn)生的重要驅(qū)動力量，新物種的形成往往伴隨著染色體易位的發(fā)生[4-5]。另外染色體易位可使物種在特定環(huán)境中具備更好的適應(yīng)性，如小麥中4A、5A與7B染色體之間的環(huán)狀易位，4AL-5AL易位早在二倍體水平上就已經(jīng)發(fā)生，之后在四倍體小麥中進一步與7B染色體發(fā)生易位，形成4AL-5AL-7BS易位，前人根據(jù)該易位，提出了有關(guān)染色體倒位與易位的起源進化假說[6-12]。因此，發(fā)現(xiàn)更多染色體水平的易位，不僅可以驗證相關(guān)易位理論，還會豐富小麥的遺傳變異[13-14]。

Huang等[15]對我國373個栽培小麥品種進行了熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析，發(fā)現(xiàn)49個品種中含有小麥相互易位染色體；Badaeva等[16]從世界不同區(qū)域的406種多倍體小麥中檢測出大量的不同染色體易位類型，且歐洲小麥中廣泛存在5B與7B染色體的易位。研究表明，染色體易位提高了小麥的黃銹病抗性以及對當?shù)丨h(huán)境的適應(yīng)性[17-18]；除此之外，多個帶有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的小麥品種(如薩達姆27、揚麥3號、豐抗13、Eshimashinrik、川麥62等)都被鑒定出小麥染色體發(fā)生了相互易位[19-23]。這些結(jié)果表明，染色體易位在現(xiàn)代小麥品種中分布十分普遍，在生產(chǎn)實踐上發(fā)揮了重要作用。

自20世紀以來，育種學(xué)家們進行了大量有關(guān)小麥與其近緣物種遠緣雜交的研究，極大地豐富了小麥的遺傳資源庫。遠緣雜交產(chǎn)生的雜種后代中，也會出現(xiàn)多種小麥染色體之間的易位變異[24]。然而，大多數(shù)研究者主要關(guān)注于小麥與外源染色體之間所產(chǎn)生的變異及其對小麥性狀的影響，而對小麥染色體之間易位的相關(guān)研究報道還比較少，因此，其遺傳育種價值未得到有效利用。本課題組前期在利用八倍體小偃麥品系12-1179與普通小麥川麥107雜交轉(zhuǎn)移偃麥草優(yōu)異基因的過程中，獲得了一些性狀發(fā)生明顯變異的小麥染色體之間易位的材料。本研究利用非變性FISH(ND-FISH)技術(shù)對4個小麥染色體相互易位品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)進行分析鑒定，以期為創(chuàng)新小麥優(yōu)異種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所鑒定的4個小麥品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)皆為八倍體小偃麥品系12-1179與普通小麥品種川麥107雜交后再與川麥107回交，然后至少連續(xù)自交10次以上的穩(wěn)定品系，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗室提供。由于品系TC對條銹病表現(xiàn)為免疫，并且大穗多花、籽粒飽滿、千粒重較高，因此重點對其農(nóng)藝性狀與其親本川麥107進行對比，同時與高感條銹病小麥品系SY95-71雜交得到F1代，F(xiàn)1代自交得到F2代，對其條銹病抗性進行遺傳分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 ND-FISH分析

染色體制片按照Han等[26]的方法進行。ND-FISH分析所采用的寡核苷酸探針包括能夠區(qū)分小麥染色體的Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1[27]、區(qū)分小麥B和D染色體組的Oligo-B和Oligo-D[28]以及著絲粒特異探針Oligo-CCS1[27]。其中Oligo-pSc119.2-1、Oligo-D、Oligo-CCS1三種寡核苷酸探針以6-FAM-5-dUTP(綠色)進行標記，Oligo-pTa535-1、Oligo-B以Tamra-5-dUTP(紅色)進行標記，探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。雜交程序參照Fu等[29]的方法。在每管探針粉末中用 1×TE緩沖液(pH=7.0)溶解為100倍的探針母液，用2×SSC和1×TE緩沖液進一步再稀釋10倍成為探針工作液。每張載玻片上滴加10 μL探針工作液，置于37 ℃恒溫水浴鍋中雜交2 h，雜交完后用2×SSC溶液清洗，晾干后向每張載玻片上滴加10 μL DAPI復(fù)染液，黑暗環(huán)境下放置10 min后，用熒光顯微鏡Nikon ECLIPSE 80i進行觀察并拍照。

1.2.2 農(nóng)藝性狀及抗病性調(diào)查

將供試材料種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場。品系TC與親本川麥107各種植4行，2個重復(fù)，成熟后各行隨機取10株對其有效分蘗、小穗數(shù)、穗長、千粒重等農(nóng)藝性狀進行調(diào)查。品系TC與高感條銹病品系SY95-71雜交F1和F2代在田間分別種植1行和8行，每行15株左右，以SY95-71作為對照，于分蘗期接種含有CYR31、CYR32、CYR33、CYR34、水源11等條銹菌混合菌種，待對照葉片全部感染后對F1和F2代進行觀察并記載反應(yīng)型(infection type,IT)，按0、0；、1、2、3、4六級標準記載，其中，0、0；、1、2為抗病型，3和4為感病型[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個小麥品系的親本核型

八倍體小偃麥品系12-1179是以中國春為母本，與中間偃麥草雜交得到F1代雜種，再與小麥栽培品種綿陽26回交得到F2代雜種，從F2代雜種連續(xù)自交過程中篩選結(jié)實性好的植株，繁殖至少8代而形成，楊 園等[30]對其染色體結(jié)構(gòu)進行了研究，結(jié)果表明，其染色體構(gòu)成為2n=56，含有 12條中間偃麥草染色體和44條小麥染色體，其中5D染色體為4條，沒有發(fā)現(xiàn)小麥之間易位的染色體。本研究采用混合寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對親本川麥107進行ND-FISH分析，對照Tang等[27]的小麥標準ND-FISH核型，也未發(fā)現(xiàn)其存在小麥之間易位的染色體(圖1)，表明所鑒定材料發(fā)生的易 位均在八倍體小偃麥與普通小麥雜交過程中 產(chǎn)生。

綠色和紅色分別表示Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1探針信號。Green and red indicate the signals of Oligo-pSc119.2-1 and Oligo-pTa535-1,respectively.圖1 川麥107的ND-FISH雜交結(jié)果Fig.1 ND-FISH hybridization result of Chuanmai 107

2.2 4個小麥品系的核型

2.2.1 品系TC的核型

隨機選取10粒TC的種子，待發(fā)根后進行染色體計數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，其染色體數(shù)目為2n=42。利用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對染色體進行分析，發(fā)現(xiàn)TC在7B和3D染色體之間發(fā)生了相互易位(圖2A)，易位染色體在短臂之間和長臂之間相互結(jié)合。采用混合探針Oligo-B和Oligo-D也證實了這種結(jié)果(圖2B)。進一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系TC的著絲粒位置，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)易位染色體斷裂點在著絲粒區(qū)域(圖2C和2D)，說明小麥品系TC具有一對3DS·7BS和一對3DL·7BL相互易位純合染色體。

A：以O(shè)ligo-pSc119.2-1(綠色)和Oligo-pTa535-1(紅色)作探針；B和D：以混合的Oligo-B(紅色)和Oligo-D(綠色)作探針，圖B和圖D分別表示不同的細胞；C：以O(shè)ligo-CCS1(綠色)作探針。圖4和圖5同。白色箭頭指示3DL·7BL易位染色體，紅色箭頭指示 3DS·7BS易位染色體。A:Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used as ND-FISH probes；B and D:Mixed Oligo-B(red) and Oligo-D(green) were used as ND-FISH probes,figure B and figure D indicate the different cells；C:Oligo-CCS1(green) was used as the ND-FISH probe.The same in figure 4 and figure 5.White and red arrows indicate 3DL·7BL and 3DS·7BS translocation chromosomes, respectively.圖2 品系TC的ND-FISH分析Fig.2 ND-FISH analysis of line TC

2.2.2 品系19Y-145的核型

隨機選取10粒19Y-145的種子，待發(fā)根后進行染色體計數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，19Y-145的染色體數(shù)目為2n=42條。用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對染色體進行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-145在2D與3B染色體之間發(fā)生了相互易位(圖3A)，易位染色體在短臂之間和長臂之間相互結(jié)合。采用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證實這種結(jié)果(圖3B)。進一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-145的著絲粒位置(圖3C)，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)易位斷裂點也處于著絲粒區(qū)域，說明品系19Y-145具有一對2DS·3BS和一對2DL·3BL相互易位染 色體。

A：以O(shè)ligo-pSc119.2-1(綠色)和Oligo-pTa535-1(紅色)作探針；B：以混合Oligo-B(紅色)和Oligo-D(綠色)作探針；C：以O(shè)ligo-CCS1(綠色)作探針。白色和紅色箭頭分別指示2DL·3BL和 2DS·3BS易位染色體。A:Oligo-pSc119.2-1(green) and Oligo-pTa535-1(red) were used as ND-FISH probes. B:Mixed Oligo-B(red) and Oligo-D(green) were used as ND-FISH probes. C:Oligo-CCS1(green) was used as the ND-FISH probe. White and red arrows indicate 2DL·3BL and 2DS·3BS translocation chromosomes,respectively.圖3 品系19Y-145的ND-FISH分析Fig.3 ND-FISH analysis of line 19Y-145

2.2.3 品系19Y-185的核型

隨機選取10粒19Y-185的種子，待發(fā)根后進行染色體計數(shù)和ND-FISH分析，結(jié)果表明，該品系的染色體數(shù)目為2n=42。使用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對染色體進行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-185在7B與4D 染色體之間發(fā)生了相互易位，易位染色體在短臂之間和長臂之間相互結(jié)合(圖4A)。利用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證明了這種結(jié)果(圖4B)。進一步用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-185的著絲粒位置，并與混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)19Y-185易位染色體的斷裂點位于7B染色體的長臂和4D染色體的短臂上(圖4C和4D)，具有一對4DS-7BS·7BL和一對4DL·4DS-7BL相互易位染色體，但具體斷裂點還需采用分子生物學(xué)方法進行進一步確定。

白色和紅色箭頭分別示4DL·4DS-7BL和4DS-7BS·7BL易位染色體。White and red arrows indicate 4DL·4DS-7BL and 4DS-7BS·7BL translocation chromosomes,respectively.圖4 品系19Y-185的ND-FISH分析Fig.4 ND-FISH analysis of line 19Y-145

2.2.4 品系19Y-200的核型

對19Y-200進行染色體計數(shù)和ND-FISH分析發(fā)現(xiàn)，19Y-200的染色體數(shù)目為2n=42條。用寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對染色體進行分析，發(fā)現(xiàn)19Y-200在3B與3D染色體之間發(fā)生了相互易位(圖5A)。使用混合寡核苷酸探針Oligo-B和Oligo-D也證實了這種結(jié)果(圖5B)。用著絲粒探針Oligo-CCS1明確品系19Y-200的著絲粒位置，并結(jié)合混合探針Oligo-B和Oligo-D的雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)19Y-200易位染色體的斷裂點在3B和3D染色體的長臂上(圖5C和5D)，具有一對3BS·3BL-3DL和一對3BL-3DS·3DL相互易位染色體，但具體斷裂點還需通過分子生物學(xué)方法進一步確定。

白色和紅色箭頭分別示3DL-3BS·3BL和3DS·3DL-3BL易位染色體。White and red arrows indicate 3DL-3BS·3BL and 3DS·3DL-3BL translocation chromosomes. respectively.圖5 品系19Y-200的ND-FISH分析Fig.5 ND-FISH analysis of line 19Y-200

2.3 品系TC的農(nóng)藝性狀和條銹病抗性

從外觀形態(tài)來看，品系TC與親本川麥107具有明顯差異，TC對條銹病表現(xiàn)免疫(IT=0)，而川麥107表現(xiàn)為感病(IT=3～4)，同時TC的每穗小穗數(shù)、穗長和千粒重顯著或極顯著高于川麥107，因此品系TC具有比川麥107更優(yōu)異的農(nóng)藝性狀(表1和圖6)。

A：植株；B：麥穗；C：籽粒。在每個小圖中，左為品系TC，右為親本川麥107。A:Plant; B:Spike; C:Grain. In each picture,TC is on the left,and Chuanmai 107 is on the right.圖6 品系TC與親本川麥107的形態(tài)特征Fig.6 Morphology features of line TC and Chuanmai 107

表1 品系TC與CM107的農(nóng)藝性狀比較Table 1 Comparison of agronomic traits between line TC and Chuanmai 107

對TC與SY95-71雜交后得到的F1代和自交獲得的F2代的條銹病抗性進行調(diào)查，結(jié)果表明，在SY95-71重度感染(IT=4)的情況下，雜種F1代和TC均對條銹病表現(xiàn)為免疫。雜種F2代共有109株，其中抗病株數(shù)為74株，感病株數(shù)為35株，經(jīng)χ2測驗，符合3∶1分離比例，說明品系TC的條銹病抗性是受一對顯性單基因控制。

3 討 論

染色體易位是物種進化過程中基因組形成的重要驅(qū)動力，易位后的基因擁有更高的進化速度，其不僅改變了基因的連鎖群及其位置(表現(xiàn)出位置效應(yīng)等遺傳現(xiàn)象)，而且基因的重組頻率也發(fā)生改變[31]。楊財容[32]通過研究不同區(qū)域的六倍體披堿草，發(fā)現(xiàn)高海拔的六倍體披堿草屬物種具有更復(fù)雜的染色體組間易位，推測可能與其所處環(huán)境有關(guān)，染色體易位使其更能適應(yīng)高海拔環(huán)境。易位也是植物改變?nèi)旧w近著絲粒部分連鎖情況的主要方式，在小麥的進化中發(fā)揮了較大作用[33]。

普通小麥作為異源六倍體作物，在長期進化和人工育種進程中，染色體之間存在大量的易位變異。其中，5B-7B、3B-3D、4A-6B、2A-3A、2B-3B、3B-7B和2D-7B是常見的染色體易位類型[34]。但是由于受技術(shù)限制，多數(shù)易位的斷裂點還不確定，僅有5B-7B、5B-6B、4B-6B等少數(shù)幾個易位類型由于有明顯的Giemsa C帶帶紋特征，通過Giemsa C帶技術(shù)可確定是染色體之間的臂間易位[20,35-36]。本研究4個小麥品系(TC、19Y-145、19Y-185、19Y-200)均是八倍體小偃麥和川麥107通過遠緣雜交創(chuàng)制的染色體易位材料。采用ND-FISH和特定的重復(fù)序列為探針進行多重FISH分析，發(fā)現(xiàn)TC和19Y-145分別是7B-3D和3B-2D通過著絲粒斷裂而形成的臂間易位純合品系，品系TC含有一對3DS·7BS和一對3DL·7BL相互易位染色體，品系19Y-145含有一對2DS·3BS和一對2DL·3BL相互易位染色體；而品系19Y-185中易位染色體的斷裂點在7B染色體的長臂和4D染色體的短臂上，形成的是一對4DS-7BS·7BL和一對4DL·4DS-7BL染色體相互易位的純合體；品系19Y-200中易位染色體的斷裂點位于3B和3D染色體的長臂上，形成的是一對3BS·3BL-3DL和一對3DS·3DL-3BL染色體相互易位的純合體。這4種易位類型除3B-3D染色體易位類型[37]外，其余3種未見前人進行過相關(guān)報道，是新的小麥染色體核型變異類型。

Qi等[38]研究表明，普通小麥染色體的B基因組比A和D基因組更容易進行重排。本研究中所鑒定的四種染色體變異均為B和D染色體組之間的易位，而未發(fā)現(xiàn)A基因組的易位。但前人研究認為，A和B染色體組之間更易發(fā)生易位[34]，原因可能是本研究鑒定到的4個小麥品系為八倍體小偃麥和普通小麥雜種后代的高世代材料，而在八倍體小偃麥和普通小麥雜種后代的低世代材料中，由于存在大量單價染色體的斷裂與融合，既會產(chǎn)生小麥與中間偃麥草染色體的易位，也會出現(xiàn)小麥自身不同染色體的易位。Law等[22]報道，不管是自然雜交品種還是育成品種，小麥自身染色體易位的發(fā)生具有一定地域特性。如5B-7B染色體易位更常見于西方國家的小麥；埃塞俄比亞四倍體小麥中發(fā)現(xiàn)了新的染色體易位T2A·4B、T1B·6B和T5B·6B[16,39]；兩份中國云南特有的云南鐵殼麥中發(fā)現(xiàn)了1BS·1BL-2DL和2DS·2DL-1BL染色體易位[40]。本研究中鑒定到的小麥染色體4種易位類型僅發(fā)生B和D基因組染色體之間，推測可能與四川的環(huán)境、氣候相關(guān)，小麥B-D染色體易位增加了其在當?shù)丨h(huán)境中的適應(yīng)性。

本研究的4個染色體易位材料中，品系TC表現(xiàn)出良好的大穗多花、籽粒飽滿、千粒重高等農(nóng)藝特征，而且對條銹病表現(xiàn)為高抗。對其抗病性分析發(fā)現(xiàn)，其受一對顯性基因控制。因此品系TC可能是一個優(yōu)良的育種材料。這些良好的農(nóng)藝性狀和高抗條銹病的特性是否涉及染色體易位或連鎖群改變，還需進一步研究。