賈楓，葉海容，曾云龍，辛茶香，熊國亮，王彩紋

（江西省胸科醫(yī)院，江西 南昌 330000）

結(jié)核病是由于感染了結(jié)核分枝桿菌而引起的一種慢性傳染病,也是目前由單一病原菌引起人類死亡人數(shù)最多的傳染病[1,2]。 我國因人口基數(shù)龐大,一直是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。 據(jù)2020年世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告，全球估計(jì)1000 萬人感染結(jié)核病，而我國就有約84 萬，居世界第三位；耐藥結(jié)核以14%的占比居世界第二位[3]。 減少傳染源、有效控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵就在于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者并進(jìn)行有效治療[4]。 目前，發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段仍然是細(xì)菌學(xué)檢查。 涂片抗酸染色法雖然操作簡(jiǎn)單、快速，但是敏感性較差，其陽性率僅有20～30%；結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)法陽性率雖相對(duì)高一些，但培養(yǎng)時(shí)間太久，一般需要6～8 周，難以滿足臨床快速診斷的需要。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，在鏈置換DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[5]來對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群DNA 進(jìn)行快速檢測(cè), 其前處理簡(jiǎn)便，且閉管無污染，1h 即可完成試驗(yàn)。 目前，應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌雖在國內(nèi)外均有報(bào)道[6,7]，但在本省還較少涉及，本研究通過對(duì)涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法的陽性檢出率進(jìn)行比較，來評(píng)估LAMP 法在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 收集140 例本院臨床診斷為肺結(jié)核或懷疑為肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本作為本研究對(duì)象。 囑所有的研究對(duì)象晨起涮口后留取深咳痰約3～5ml。

1.1.2 儀器及試劑 （1）奧林巴斯顯微鏡CH2，購自日本公司；（2）恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀（LF-10）及核酸提取或純化試劑盒，由日本榮研化學(xué)株式會(huì)社提供；（3）抗酸染色液自配，改良羅氏培養(yǎng)管購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；（4）BSC-ⅡB2 生物安全柜，購自濟(jì)南鑫貝西公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP 技術(shù)

1.2.1.1 DNA 提取 （1）用大口徑一次性吸管，從痰盒中吸取60μl 痰液加入榮研化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)的核酸提取儀或純化試劑盒中的含有提取液的加熱管中；（2）顛倒混勻加熱管3～4 次后放入恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀（LF-10） 的加熱模塊中，90℃加熱5min，對(duì)分枝桿菌進(jìn)行裂解和滅活；（3）從加熱器中取出加熱管，冷卻2min；（4）將加熱管放入吸附管中，用力搖動(dòng)使粉末與液體完全混合；（5）將注射帽放在吸附管的接口處，旋緊固定；（6）滴加約30μl 液體到反應(yīng)管中。

1.2.1.2 LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增 將榮研化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑盒中的反應(yīng)管放置到恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增儀（LF-10）的反應(yīng)模塊中，67℃反應(yīng)40min。

1.2.1.3 觀察結(jié)果 將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到熒光檢測(cè)器中，通過LED 燈觀察反應(yīng)管中有無熒光并記錄結(jié)果，有熒光反應(yīng)者為陽性，反之為陰性。

1.2.2 涂片抗酸染色 對(duì)同份痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行涂片抗酸染色，鏡檢按照《痰涂片鏡檢實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行操作。

1.2.3 改良羅氏培養(yǎng) 將痰標(biāo)本用乙酰半胱氨酸-NaOH 溶液液化15～20min，取液化好的痰標(biāo)本200μl 接種于改良羅氏培養(yǎng)基管中，每份標(biāo)本接種2 支培養(yǎng)管，于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。 若長出可見的典型菌落者判定為陽性，可疑菌落用涂片抗酸染色法進(jìn)行鑒定，接種8 周仍未見菌落生長者則判定為陰性。

1.2.4 菌種鑒定 用對(duì)硝基苯甲酸（PNB）/ 噻吩-2-羧酸肼（TCH）培養(yǎng)基鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。

1.3 臨床診斷 以中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[8]作為臨床診斷依據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 LAMP 法與涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)果的比較用配對(duì)χ2檢驗(yàn)。 LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性分析采用Kappa 指數(shù)法，Kappa 指數(shù)值越大，說明其吻合程度越高，Kappa 指數(shù)介于0.4～0.7 之間，提示吻合程度一般；Kappa 指數(shù)大于0.7，說明吻合性強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 三種方法的陽性檢出率 140 份痰標(biāo)本中涂片抗酸染色法、LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法的陽性檢出率分別是25. 71%（36/140）、43.57%（61/140）和41.43%（58/140）。 LAMP 法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果=19.36，查χ20.05，1=3.84，故P＜0.05）。 三種方法檢測(cè)結(jié)果的比較,見表1。

表1 三種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 菌種鑒定結(jié)果 經(jīng)菌種鑒定，改良羅氏培養(yǎng)陽性的58 份痰標(biāo)本中有57 份為結(jié)核分枝桿菌，1 份為非結(jié)核分枝桿菌。

2.3 LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的比較將LAMP 法與改良羅氏培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，兩法檢測(cè)結(jié)果的一致性κ=0.752，說明LAMP法在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方面與改良羅氏培養(yǎng)法有較好的吻合性。 兩法檢測(cè)結(jié)果的比較,見表2。

表2 LAMP 法和改良羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討論

現(xiàn)階段，涂片抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法仍然是大多數(shù)結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室主要的病原學(xué)檢測(cè)方法，但因檢出率、檢測(cè)時(shí)限等局限，這些方法已經(jīng)不能夠滿足臨床診療的需求。 隨著近年來對(duì)結(jié)核分枝桿菌全基因組的解析，一些通過檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA 來達(dá)到對(duì)結(jié)核病進(jìn)行快速診斷的技術(shù)也隨之應(yīng)運(yùn)而生[9]，其中，LAMP 法作為一種快速的分子檢測(cè)方法具有重要的意義[10]。

涂片抗酸染色法雖然具有操作簡(jiǎn)單、 快速得出結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，但只有當(dāng)痰標(biāo)本中的細(xì)菌含量達(dá)到5000～10000 條/ml 時(shí),才能被涂片抗酸染色法檢出[11]，故靈敏度較低。 在本研究結(jié)果中，LAMP 法的陽性檢出率明顯高于涂片抗酸染色法。 有研究[12,13]顯示，LAMP 法在診斷結(jié)核病方面的表現(xiàn)優(yōu)于涂片抗酸染色法，這與本研究一致。

將改良羅氏培養(yǎng)的結(jié)果作為判斷金標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合臨床診斷及患者使用抗結(jié)核藥物的反應(yīng)性綜合判斷，LAMP 法的敏感性為87.93%（51 ／ 58），特異性為87.80%（72 ／ 82）。 LAMP 法的靶序列均為結(jié)核分枝桿菌的特異性序列，因此無法識(shí)別痰標(biāo)本中的非結(jié)核分枝桿菌。 隨著我國NTM 的臨床分離率的逐漸上升，這些用LAMP 法無法檢測(cè)到的非結(jié)核分枝桿菌使得其敏感性稍有降低[14]。

本研究中有10 份標(biāo)本LAMP 法檢測(cè)為陽性而改良羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為陰性。 其原因可能為培養(yǎng)法只能對(duì)活菌進(jìn)行培養(yǎng)，而LAMP 法對(duì)沒有活性的菌株也能進(jìn)行擴(kuò)增[15]，所以會(huì)造成LAMP法檢測(cè)陽性而培養(yǎng)法為陰性的現(xiàn)象。 因此對(duì)陽性標(biāo)本的判斷還應(yīng)結(jié)合臨床診斷及患者使用抗結(jié)核藥物的反應(yīng)性。 140 份標(biāo)本中有7 份LAMP 法檢測(cè)結(jié)果陰性，而改良羅氏培養(yǎng)法的結(jié)果為陽性，除去1 例為非結(jié)核分枝桿菌外，可能存在的主要原因是兩種方法所用的是同一個(gè)病人的不同份標(biāo)本。 有些病人因痰量少，會(huì)留兩到三份痰（菌量不均質(zhì)），若使用同一份標(biāo)本進(jìn)行三種方法的比較，同一性應(yīng)該會(huì)好一些。

有研究表明，LAMP 法在血痰標(biāo)本中的陽性檢出率會(huì)低于涂片抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法，原因可能為血液成分中含有血紅蛋白等物質(zhì)，能夠抑制PCR 反應(yīng)，故造成陽性檢出率的降低[16]。 本研究中共有6 份血痰標(biāo)本，其中有1 份涂片抗酸染色法與羅氏培養(yǎng)法均為陽性結(jié)果，而LAMP 法檢測(cè)為陰性結(jié)果，但因血痰樣本數(shù)量太少，無法判別是否存在差異。

本次研究所收集的標(biāo)本中有一部分是臨床高度懷疑為肺結(jié)核患者的痰液，但是三種檢測(cè)方法的結(jié)果均為陰性，因此用三種方法檢測(cè)均為陰性的病人也不能完全排除肺結(jié)核的可能，導(dǎo)致陰性結(jié)果的原因與痰標(biāo)本的質(zhì)量、 取樣時(shí)間以及排菌量等因素有關(guān)。

綜上所述，LAMP 法檢測(cè)痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌具有靈敏性高、特異性強(qiáng)，不需要昂貴的儀器設(shè)備、操作簡(jiǎn)單安全、耗時(shí)較少等諸多優(yōu)勢(shì)，在肺結(jié)核的快速診斷中有很大的應(yīng)用價(jià)值。