王 琦，楊慶利，吳 薇

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的一種低分子質(zhì)量的天然次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人和動(dòng)物具有很強(qiáng)的毒性，其毒性主要表現(xiàn)在肝、腎損害、致畸、致癌、致突變等方面[1-3]。在玉米、花生等常見(jiàn)農(nóng)作物種植、生長(zhǎng)、收獲、運(yùn)輸、存儲(chǔ)以及加工的各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能受到真菌毒素的污染，這不僅會(huì)降低作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。真菌毒素廣泛存在于世界范圍內(nèi)，已經(jīng)成為世界性關(guān)注問(wèn)題[6-8]。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）和伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）是兩種比較常見(jiàn)的真菌毒素，主要存在于玉米、花生以及小麥等農(nóng)作物及其產(chǎn)品中，尤其是水分含量高的環(huán)境中更容易產(chǎn)生。迄今為止，AFB1和FB1傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要有儀器檢測(cè)法和免疫檢測(cè)法。儀器檢測(cè)法主要有薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳等，免疫檢測(cè)法常用的是酶聯(lián)免疫吸附法和熒光免疫分析法[9-12]。這些檢測(cè)方法雖然在目前階段運(yùn)用比較成熟，但是由于存在樣品前處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、設(shè)備昂貴而造成檢測(cè)成本高、穩(wěn)定性差以及不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等缺點(diǎn)而面臨著巨大的挑戰(zhàn)。此外，食物和動(dòng)物飼料很有可能同時(shí)受到多種真菌毒素的污染。然而，單一的檢測(cè)模式并不能提供對(duì)食品的全面監(jiān)控。因此，有必要加強(qiáng)食品和飼料中真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)技術(shù)。此外，開(kāi)發(fā)一種新型、省時(shí)、低成本、靈敏的同時(shí)檢測(cè)真菌毒素的生物傳感器十分必要。

適配體（aptamer，APT）是通過(guò)體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從核酸隨機(jī)文庫(kù)中篩選出來(lái)的短寡核苷酸序列[13-16]。APT的堿基序列、核苷酸序列長(zhǎng)度和環(huán)境條件構(gòu)成了它獨(dú)特的三維立體結(jié)構(gòu)[17]，這使其擁有特殊的結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)靶標(biāo)具有較高的特異性和親和力。與抗體相比，APT具有可以大量體外合成、容易修飾、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。近幾年，基于APT的生物傳感器成為研究熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、食品危害物檢測(cè)等領(lǐng)域[18-19]。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的氧化產(chǎn)物，具有大量含氧官能團(tuán)，有很好的親水性和生物相容性。相比于其他猝滅劑，GO具有更優(yōu)越的熒光猝滅性能[20-21]，常常在熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中作為熒光受體?；贕O的熒光傳感器已廣泛應(yīng)用于金屬離子、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、病原體、真菌毒素、DNA等小分子的檢測(cè)[22-27]。此外，由于π-π堆積作用GO對(duì)單鏈DNA的吸附能力強(qiáng)于對(duì)雙鏈DNA和G-四聯(lián)體的吸附能力，這一特性為本研究的熒光開(kāi)關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)提供了理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一種基于GO為猝滅劑的熒光APT傳感器，熒光基團(tuán)作為熒光供體，GO作為熒光受體，成功用于食品中真菌毒素（AFB1和FB1）的同時(shí)熒光檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒 市購(gòu)。

GO 先鋒納米材料科技有限公司；甲醇（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有實(shí)驗(yàn)均采用超純水（18.25 MΩ·cm）；AFB1、FB1青島普瑞邦生物工程有限公司；AFB1適配體（APT1）和FB1適配體（APT2）的寡核苷酸序列參照文獻(xiàn)[28-29]獲得，熒光染料（Alexa Fluor 488和Cy3）修飾在DNA探針的5’端，APT由生工生物工程（上海）股份有限公司（中國(guó)）合成。APT1和APT2的寡核苷酸序列如表1所示。

表1 APT的寡核苷酸序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

F-2700熒光分光光度計(jì) 日本日立有限公司；SPM-9700型原子力顯微鏡 日本島津有限公司；Trobot聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reactio，PCR）儀德國(guó)Biometra公司；3K15離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；KH5200E超聲清洗儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光APT傳感器的構(gòu)建

在磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（含NaCl 136.89 mmol/L，KCl 2.67 mmol/L，Na2HPO48.1 mmol/L，KH2PO41.76 mmol/L，pH 7.4）中將APT的凍干粉稀釋至工作濃度（10 μmol/L），PCR處理后形成直鏈；將GO納米片超聲20 min，5 000 r/min離心10 min，除去沉淀，取上清液備用。然后，將30 μL GO納米片（250 μg/mL）分別與4 μL APT1&2在室溫下均勻混合5 min，形成GO-熒光APT傳感器。

1.3.2 AFB1和FB1檢測(cè)

將10 μL不同質(zhì)量濃度的AFB1和FB1滴入GO-適體混合溶液中，加入PBS使最終體積達(dá)到1 mL，使AFB1和FB1終質(zhì)量濃度為0、1、5、10、50、100、500 ng/mL。最終液體在一定溫度下孵育1 h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要在黑暗的環(huán)境下進(jìn)行。最后用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，工作條件為狹縫寬度5 nm，電壓700 V，APT1激發(fā)波長(zhǎng)499 nm，APT2激發(fā)波長(zhǎng)512 nm。將水浴中孵育后的樣品（GO、GO-APT1&2、GO-APT1&2-AFB1&FB1）8 500 r/min離心10 min以獲得GO納米片。然后用超純水將GO納米片稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度（5 μg/mL），超聲分散10 min，用原子力顯微鏡的相位模式掃描高度圖像。每個(gè)樣本平行掃描3 次。

1.3.3 溫度優(yōu)化

探究溫度（30、35、40、45 ℃和50 ℃）對(duì)熒光APT傳感器檢測(cè)效果的影響。每組實(shí)驗(yàn)除溫度不同外，其他操作均與1.3.2節(jié)相同。

1.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證基于GO的熒光APT傳感器的實(shí)用性，采用白酒樣品[30]進(jìn)行測(cè)試。首先，將1 mL白酒樣品用PBS稀釋20 倍，將溶液調(diào)至pH 7.4。然后，將已知質(zhì)量濃度的AFB1和FB1加入預(yù)處理樣品中。根據(jù)1.3.2節(jié)操作，用熒光傳感器對(duì)白酒樣品進(jìn)行靶標(biāo)的定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于GO的熒光APT傳感器實(shí)驗(yàn)原理

依賴(lài)于APT的識(shí)別能力、GO的熒光猝滅和ssDNA吸附能力，本研究構(gòu)建了基于GO的熒光APT傳感器。圖1顯示了基于開(kāi)啟式熒光APT傳感器同時(shí)檢測(cè)兩種真菌毒素（AFB1和FB1）的原理圖。由于GO表面含有含氧官能團(tuán)和共軛結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)氫鍵、π-π堆積作用將APT1和APT2吸附到GO表面。伴隨著GO與APT之間的距離被拉近，APT的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移原理會(huì)被GO猝滅，因此APT和GO組裝形成熒光APT傳感器。在溶液中沒(méi)有AFB1和FB1的情況下，真菌毒素同時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)的熒光處于關(guān)閉狀態(tài)。當(dāng)靶標(biāo)加入時(shí)，由于APT與靶標(biāo)的特異性高于GO-APT[31]，APT1、APT2更傾向于與它們的特定靶標(biāo)結(jié)合在一起，從GO表面游離出來(lái)，導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理被破壞，從而使APT1和APT2的熒光恢復(fù)。此時(shí)，真菌毒素同時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)處于熒光開(kāi)啟狀態(tài)。相應(yīng)地，隨著加入的靶標(biāo)濃度越來(lái)越大，熒光強(qiáng)度恢復(fù)值也隨之逐漸變大。

圖1 基于GO熒光的APT傳感器檢測(cè)AFB1和FB1的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of fluorescence aptasensor based on GO for detection of AFB1 and FB1

2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性

圖2A顯示了APT1&2、GO-APT1&2和GO-APT1&2-靶標(biāo)1&2的熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系。當(dāng)溶液中只有APT1&2時(shí)，熒光強(qiáng)度表示熒光基團(tuán)的熒光（圖2A藍(lán)色曲線）。當(dāng)熒光APT1&2與GO一起孵育時(shí)，熒光強(qiáng)度急劇下降（圖2A灰色曲線）。結(jié)果表明，由于GO的吸附作用產(chǎn)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，GO成功猝滅了APT1&2的熒光。當(dāng)靶標(biāo)出現(xiàn)在溶液中時(shí)，APT1&2和特異性靶標(biāo)間的高親和力使得APT優(yōu)先與特異性靶標(biāo)識(shí)別結(jié)合并從GO表面釋放，恢復(fù)APT1&2的顯著熒光信號(hào)（圖2A紅色曲線）。

用原子力顯微鏡測(cè)試原理設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。用原子力顯微鏡對(duì)GO的高度軌跡進(jìn)行掃描。如圖2B所示，GO片的平均高度約為（1.28±0.01）nm，這個(gè)結(jié)果與GO是單原子層的理論一致。GO-APT1&2復(fù)合物的高度為（2.19±0.007）nm，厚度的增加說(shuō)明APT1&2被成功地吸附在GO表面。當(dāng)GO-APT1&2復(fù)合物與靶標(biāo)孵育時(shí)，其厚度顯著降低至（1.65±0.025）nm。這一現(xiàn)象證實(shí)了適體從GO表面釋放出來(lái)，因?yàn)锳PT和靶標(biāo)的相互作用力大于GO和APT的相互作用力。以上兩種方法均證明了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的正確性。

圖2 APT傳感器檢測(cè)的熒光光譜圖（A）和原子力顯微鏡圖像（B）Fig.2 Fluorescence emission spectra (A) and AFM images (B) of aptasensor

2.3 實(shí)驗(yàn)溫度條件的優(yōu)化

在室溫下，向GO-APT中加入10 μL的AFB1和FB1（50 ng/mL）后熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯恢復(fù)。為提高加入靶標(biāo)后的熒光恢復(fù)效率，采取溫度優(yōu)化措施。隨著孵育溫度的升高，GO與APT的相互作用減弱，APT從GO表面上釋放出來(lái)。因此，提高溫度是增強(qiáng)熒光恢復(fù)的理想方法。同時(shí)，過(guò)高的溫度會(huì)破壞APT與靶標(biāo)之間的結(jié)合。如圖3所示，當(dāng)無(wú)AFB1和FB1時(shí)，熒光強(qiáng)度恢復(fù)通常隨溫度的升高而增加。這一現(xiàn)象證實(shí)了先前的理論，即高溫促進(jìn)了APT從GO表面的釋放。然而，在GO-APT1&2復(fù)合物中加入靶標(biāo)時(shí)，這種現(xiàn)象不同。添加AFB1和FB1時(shí)，熒光信號(hào)在45 ℃以下呈現(xiàn)有規(guī)律地增加，但當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度恢復(fù)減弱。因此，45 ℃是熒光強(qiáng)度恢復(fù)的臨界點(diǎn)。

圖3 AFB1（A）和FB1（B）檢測(cè)溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of detection temperatures for AFB1 (A) and FB1 (B)

2.4 APT傳感器靈敏性分析

為了證明開(kāi)啟式熒光APT傳感器的靈敏度，將不同質(zhì)量濃度（0、0.1、0.5、1、5、10、50、100 、500 ng/mL）的靶標(biāo)（AFB1和FB1）與GO-APT1&2復(fù)合物孵育。如圖4所示，隨著AFB1和FB1質(zhì)量濃度的增加，在340 nm左右GO-APT1混合溶液的熒光強(qiáng)度從30.23增加到340.21，在560 nm左右GO-APT2混合溶液的熒光強(qiáng)度從30.58增加到243.09。AFB1的回歸方程為y=82.516x＋99.599（x為lgCAFB1），R2=0.988 0（圖4A），檢出限為0.15 ng/mL。FB1的回歸方程為y=58.131x＋85.87（x為lgCFB1），R2=0.989 9，檢出限為0.12 ng/mL（圖4B）。該熒光APT傳感器可以實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1和FB1的靈敏性檢測(cè)（表2），并且具有較寬的檢測(cè)范圍。

圖4 熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)質(zhì)量濃度的關(guān)系Fig.4 Relationship between fluorescence intensity and target concentration

表2 本研究APT傳感器與其他方法的比較Table 2 Comparison of the aptasensor with other detection methods

2.5 APT傳感器特異性分析

利用其他可能的干擾真菌毒素，如玉米赤酶烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）和棒曲霉素（Patulin），進(jìn)一步檢查APT傳感器的特異性。分別向GO-APT1&2復(fù)合物中加入質(zhì)量濃度為10 ng/mL的AFB1、FB1、ZEN、OTA、AFM1和Patulin。如圖5所示，干擾真菌毒素的熒光恢復(fù)值無(wú)明顯增加，而AFB1和FB1的熒光恢復(fù)值明顯，其中，AFB1的熒光恢復(fù)值是其他干擾毒素的6 倍左右，而FB1的熒光恢復(fù)值是其他干擾毒素的4 倍左右。結(jié)果表明，該熒光APT傳感器對(duì)AFB1和FB1具有很高的特異性。

圖5 APT傳感器特異性評(píng)估Fig.5 Selectivity assessment of the aptasensor

2.6 白酒樣品的檢測(cè)結(jié)果

用熒光APT傳感器檢測(cè)具有3種不同質(zhì)量濃度AFB1和FB1的白酒樣品。利用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)際樣品的回收率進(jìn)行進(jìn)一步的可靠性評(píng)價(jià)。用上述方法測(cè)定AFB1和FB1的質(zhì)量濃度，并用線性方程計(jì)算。如表3所示，回收率AFB1為92.00%～100.81%，F(xiàn)B1為89.00%～99.50%。該方法可同時(shí)檢測(cè)真實(shí)食品樣品中的AFB1和FB1。

表3 白酒樣品中不同質(zhì)量濃度AFB1和FB1的檢測(cè)Table 3 Recoveries of AFB1 and FB1 from Chinese Baijiu samples at different spiked levels

3 結(jié) 論

利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，設(shè)計(jì)一種以GO為熒光猝滅劑的熒光APT傳感器用于食品中真菌毒素AFB1和FB1的同時(shí)檢測(cè)。在最佳檢測(cè)條件下，該熒光傳感器對(duì)AFB1檢測(cè)范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.15 ng/mL，對(duì)FB1檢測(cè)范圍為0.1～500 ng/mL，檢出限為0.12 ng/mL，并且APT傳感器對(duì)靶標(biāo)具有很高的特異性。在實(shí)際樣品的回收實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的回收率，AFB1回收率為92.00%～100.81%，F(xiàn)B1回收率為89.00%～99.50%。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建快速高效的AFB1和FB1同時(shí)檢測(cè)傳感平臺(tái)，為真菌毒素以及其他小分子靶標(biāo)的檢測(cè)提供了新的模型，適用于現(xiàn)場(chǎng)多重檢測(cè)，在食品和飼料安全監(jiān)測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。