董立明，楊 帆，邢珍娟，李蔥蔥，閆 偉，龍麗坤，李飛武

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化迅猛發(fā)展[1]。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2018年全球26 個(gè)國(guó)家種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積達(dá)1.917億 公頃[2]。雖然轉(zhuǎn)基因作物在品種抗性、營(yíng)養(yǎng)改良等方面表現(xiàn)優(yōu)良，但其安全性問(wèn)題引起了公眾的廣泛關(guān)注[3-4]。為此世界上許多國(guó)家和地區(qū)相繼建立了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度，對(duì)其進(jìn)行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)作為監(jiān)管的手段已成為研究的重點(diǎn)[5]。

目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)主要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)開(kāi)展[6]。如普通PCR法[7]、多重PCR法[8-9]、實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime polymerase chain reaction，real-time PCR）法[10-11]、數(shù)字PCR法[12-14]等，同時(shí)也有一些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)、重組酶聚合酶擴(kuò)增[15-16]等。隨著商品化種植的轉(zhuǎn)基因作物品系逐年增多，傳統(tǒng)的單重PCR方法越來(lái)越難以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要，研制精準(zhǔn)、快速、高通量的檢測(cè)方法已成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[17]。多重real-time PCR是將多對(duì)引物和不同熒光標(biāo)記的TaqMan探針?lè)湃胍粋€(gè)反應(yīng)體系中，一次性檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的方法，不僅能節(jié)省樣品和試劑，同時(shí)也能大大縮短檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)一管多檢的高效率。此方法在微生物和病毒的檢測(cè)中已廣泛應(yīng)用[18-21]，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方面，也有一些報(bào)道，Wang Fengjun等[22]建立了能同時(shí)檢測(cè)Rbcl、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTII四個(gè)基因的4 重real-time PCR方法；Niu Chenqi等[23]利用多重real-time PCR結(jié)合數(shù)字PCR建立了同時(shí)檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、NPTII、PAT及Adh1的5 重real-time PCR檢測(cè)方法；Cottenet等[24]開(kāi)發(fā)了同時(shí)檢測(cè)6種外源基因和6種轉(zhuǎn)化事件的2 個(gè)多重real-time PCR檢測(cè)方法；Dong Liming等[25]建立了同時(shí)檢測(cè)內(nèi)源基因Lectin和7種轉(zhuǎn)基因大豆的2 個(gè)多重real-time PCR方法。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)信息，目前已知的轉(zhuǎn)基因作物中70%以上使用了CaMV35S啟動(dòng)子，60%以上使用了NOS終止子，至少含有兩者之一的轉(zhuǎn)基因作物種類占全部轉(zhuǎn)基因作物的85%以上[26]。此外，通過(guò)對(duì)已知轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體的序列分析發(fā)現(xiàn)，Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是轉(zhuǎn)基因水稻中應(yīng)用最廣泛的目的基因。因此，選擇這4種基因元件作為轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測(cè)的靶標(biāo)對(duì)象，具有很好的代表性。本研究以轉(zhuǎn)基因水稻KF6號(hào)為材料，建立水稻中的CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因及SPS基因的5 重real-time PCR方法。該方法將5 個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行不同的熒光標(biāo)記，根據(jù)不同熒光通道的擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確識(shí)別測(cè)試樣品中的轉(zhuǎn)基因成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用材料見(jiàn)表1，以轉(zhuǎn)基因水稻KF6號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因水稻為陰性對(duì)照，其他轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花、油菜等材料用于特異性、適用性測(cè)試，以上樣品均由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

表1 用于測(cè)試的轉(zhuǎn)基因樣品匯總Table 1 Genetically modified crop samples tested in this study

植物基因組提取試劑盒 德國(guó)Qiagen公司；HR qPCR Master Mix 上海輝睿生物科技有限公司；檢測(cè)引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化。

1.2 儀器與設(shè)備

ND8000紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；5424高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品基因組DNA提取

將所有樣品研磨成粉末，按照Qiagen試劑盒使用說(shuō)明書，提取全部實(shí)驗(yàn)樣品的基因組DNA，用分光光度計(jì)測(cè)量DNA的質(zhì)量和濃度，用1×TE溶液將樣品DNA稀釋至25 ng/μL，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物篩選

通過(guò)查詢網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)、國(guó)內(nèi)外專利、科技論文等方式，獲得已報(bào)道的CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT及SPS基因real-time PCR檢測(cè)方法的引物序列，經(jīng)引物配對(duì)篩選，確定本研究所需的引物和探針信息（表2）。用滅菌超純水將引物和探針干粉溶解至20 μmol/L，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 5重real-time PCR體系引物/探針信息Table 2 Information about primers used for pentaplex real-time PCR system

1.3.3 5重real-time PCR體系反應(yīng)條件優(yōu)化

針對(duì)5 重real-time PCR體系的引物/探針終濃度、退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)等重要影響因素，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。第1步，采用real-time PCR國(guó)標(biāo)方法中通用的退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)，對(duì)反應(yīng)體系中各靶標(biāo)的引物/探針終濃度進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)靶標(biāo)的正反引物用量相等，探針用量為引物的一半。第2步，使用篩選出的引物/探針終濃度，采用正交試驗(yàn)的方式，對(duì)退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終篩選出5 重real-time PCR的最佳反應(yīng)條件。

表3 5重real-time PCR條件優(yōu)化Table 3 Optimization of reaction conditions for pentaplex real-time PCR system

1.3.4 5重real-time PCR和單一real-time PCR擴(kuò)增體系及程序

5 重real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，引物和探針預(yù)混液5.625 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

單一real-time PCR體系：HR qPCR Master Mix 12.5 μL，正反引物各0.5 μL，探針0.25 μL，DNA模板2.0 μL，加超純水至25 μL。

5 重real-time PCR和單一real-time PCR的擴(kuò)增程序：第1階段95 ℃變性5 min；第2階段95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)；在第2階段的退火延伸（60 ℃）時(shí)段收集熒光信號(hào)。

1.3.5 5重real-time PCR體系特異性驗(yàn)證

以7種常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻的基因組DNA為模板，進(jìn)行5 重real-time PCR體系的擴(kuò)增，每個(gè)樣品3 個(gè)平行，驗(yàn)證5 重real-time PCR檢測(cè)體系的特異性。

1.3.6 5重real-time PCR體系靈敏度測(cè)試

用0.1×TE稀釋陽(yáng)性對(duì)照樣品的DNA，制備一系列濃度梯度的靈敏度測(cè)試樣品，進(jìn)行5 重real-time PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3 個(gè)平行，確定5 重real-time PCR體系的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 重real-time PCR條件的優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)在同一管中同時(shí)檢測(cè)5 個(gè)靶標(biāo)，調(diào)整反應(yīng)體系和反應(yīng)程序是關(guān)鍵。以10 ng的轉(zhuǎn)基因水稻KF6號(hào)基因組DNA為模板，分別對(duì)5 重real-time PCR體系中的引物/探針終濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)的設(shè)置處理（表3）進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示：在引物/探針終濃度測(cè)試中，當(dāng)5 重real-time PCR體系中SPS基因、CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因的引物終濃度為0.4、0.3、0.4、0.3、0.4 μmol/L時(shí)，5 個(gè)靶標(biāo)均能獲得典型擴(kuò)增曲線，且曲線的熒光值最接近和Ct值差異最小；在退火溫度與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的正交試驗(yàn)中，當(dāng)退火溫度為60 ℃，擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)時(shí)，各靶標(biāo)均能獲得最佳的擴(kuò)增結(jié)果（圖1）。依據(jù)以上測(cè)試結(jié)果，確定了1.3.4節(jié)5 重real-time PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

圖1 5重real-time PCR檢測(cè)體系的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curves of pentaplex real-time PCR system

2.2 5 重real-time PCR體系的特異性驗(yàn)證結(jié)果

為實(shí)現(xiàn)水稻中轉(zhuǎn)基因成分的篩查，選擇轉(zhuǎn)基因水稻KF6號(hào)、KF2號(hào)、TT51-1、M12、KMD、TIC-19、T2A-1以及非轉(zhuǎn)基因水稻等樣品，測(cè)試5 重real-time PCR體系的特異性。如表4所示，非轉(zhuǎn)基因水稻樣品僅獲得SPS基因的典型擴(kuò)增曲線，無(wú)其他靶標(biāo)擴(kuò)增；其他轉(zhuǎn)基因水稻樣品不但擴(kuò)增到SPS基因，還獲得了各自包含相應(yīng)靶標(biāo)的擴(kuò)增曲線。所有測(cè)試樣品的擴(kuò)增結(jié)果與材料本身所包含的篩選元件和目的基因一致[32]，無(wú)假陰性結(jié)果和非特異性擴(kuò)增的情況出現(xiàn)，表明建立的5 重real-time PCR體系可特異性用于包含以上5種元件的轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)，可對(duì)目前已知的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行高效篩查。

表4 5重real-time PCR特異性驗(yàn)證Table 4 Specificity validation of pentaplex real-time PCR system

2.3 5 重real-time PCR體系的靈敏度測(cè)試結(jié)果

將KF6號(hào)的DNA進(jìn)行一系列梯度稀釋，獲得每種靶標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、20%、4%、0.8%、0.16%、0.032%、0.016%、0.008%的8 個(gè)DNA樣品，開(kāi)展靈敏度測(cè)試。如圖2所示，當(dāng)靶標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%～0.032%時(shí)，所有5 個(gè)靶標(biāo)均能擴(kuò)增到典型擴(kuò)增曲線（Ct值在23.82～37.93之間），且依據(jù)以上稀釋濃度建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很好的線性關(guān)系（斜率范圍－3.162～－3.356，相關(guān)系數(shù)R2范圍0.997～0.999，擴(kuò)增效率范圍98.3%～106.1%）；當(dāng)靶標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.016%及以下時(shí)，雖CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT四個(gè)靶標(biāo)能夠穩(wěn)定擴(kuò)增，但SPS基因擴(kuò)增不穩(wěn)定，經(jīng)常存在平行實(shí)驗(yàn)不能穩(wěn)定擴(kuò)增的情況。表明本方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.032%。

圖2 5重real-time PCR檢測(cè)體系的靈敏度測(cè)試Fig.2 Sensitivity testing of pentaplex real-time PCR system

2.4 5 重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測(cè)能力比較

用單一real-time PCR擴(kuò)增上述濃度梯度的稀釋樣品，驗(yàn)證5 重real-time PCR體系的檢測(cè)靈敏度水平。結(jié)果見(jiàn)圖3，CaMV35S啟動(dòng)子在單一real-time PCR與5 重realtime PCR中的擴(kuò)增效率分別為105.1%和103.6%，R2均為0.999（圖3A）；NOS終止子的擴(kuò)增效率分別為98.4%和100.7%，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999（圖3B）；Cry1Ab/Ac的擴(kuò)增效率分別為106.1%和105.2%，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999（圖3C）；HPT的擴(kuò)增效率分別為101.9%和98.3%，相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.997（圖3D），SPS的擴(kuò)增效率分別為102.8%和106.5%，相關(guān)系數(shù)分別為0.996和0.999（圖3E），說(shuō)明從擴(kuò)增效率和R2等方面比較，在100%～0.032%的靶標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，單一real-time PCR與5 重real-time PCR無(wú)明顯差別，兩種方法具有同等的穩(wěn)定性和檢測(cè)能力。表明本研究建立的5 重real-time PCR方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于水稻中轉(zhuǎn)基因成分的高靈敏度檢測(cè)。

圖3 5重real-time PCR與單一real-time PCR的檢測(cè)能力比較Fig.3 Comparison of detection performance between pentaplex real-time PCR and single real-time PCR

2.5 5 重real-time PCR體系在其他轉(zhuǎn)基因作物篩查中的應(yīng)用

在5 個(gè)篩選靶標(biāo)中，SPS作為內(nèi)源基因僅存在于水稻樣品中，其他4 個(gè)靶標(biāo)CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac、HPT被廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、棉花、油菜等轉(zhuǎn)基因作物中。因此本研究選擇30種常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因原材料，驗(yàn)證5 重real-time PCR體系在其他轉(zhuǎn)基因作物篩查中的適用性。如表5所示，測(cè)試樣品的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期基本吻合，僅在MON810、Bt176玉米中未檢測(cè)出預(yù)期的Cry1Ab基因，這可能是因?yàn)楸狙芯克捎玫腃ry1Ab/Ac基因引物序列與上述2 個(gè)樣品的Cry1Ab基因相應(yīng)序列存在多個(gè)堿基不匹配?？傮w而言，利用本研究建立的5 重real-time PCR體系，可從30種測(cè)試轉(zhuǎn)基因材料中檢測(cè)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，表明此方法不僅適用于水稻中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，也可對(duì)其他轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行篩查。

表5 5重real-time PCR適用性測(cè)試Table 5 Applicability of pentaplex real-time PCR system

3 討論與結(jié)論

CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cry1Ab/Ac基因、HPT基因是當(dāng)前商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因作物中最常見(jiàn)的外源基因，也是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分子檢測(cè)最常用的篩查元件。在日常檢測(cè)工作中，一般采用先篩查常見(jiàn)外源元件，然后再鑒定轉(zhuǎn)化事件的方式，確定待檢樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及含有的轉(zhuǎn)基因身份。為了提高檢測(cè)通量和效率，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用多重PCR策略，以實(shí)現(xiàn)在同一管中一次檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。其中，多重real-time PCR以操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)時(shí)間短、可有效避免氣溶膠污染等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。在實(shí)際應(yīng)用中，不同靶標(biāo)的引物/探針濃度配比、退火溫度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)都會(huì)對(duì)多重real-time PCR擴(kuò)增效果產(chǎn)生影響。針對(duì)上述影響因素，本實(shí)驗(yàn)均設(shè)置多個(gè)處理，進(jìn)行大量的篩選，最終建立了5 重real-time PCR方法。

與前期已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因水稻多重real-time PCR檢測(cè)方法相比，本研究的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)分析國(guó)內(nèi)外已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因元件，選擇其中最常見(jiàn)的4種及水稻內(nèi)源基因，建立了5 重real-time PCR體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)常見(jiàn)基因水稻的全覆蓋篩選檢測(cè)。Gu Shaobin等[33]建立的轉(zhuǎn)基因水稻多重real-time PCR方法以CaMV35S啟動(dòng)子和水稻內(nèi)標(biāo)基因SPS為標(biāo)靶，對(duì)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量檢測(cè)。張明哲等[1]建立的復(fù)合PCR熒光檢測(cè)方法是經(jīng)復(fù)合PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)4種轉(zhuǎn)基因水稻品系的檢測(cè)。而本研究建立的方法是為了快速測(cè)定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)不同。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的實(shí)際工作中，將本研究的篩選方法與轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法結(jié)合使用，則即可實(shí)現(xiàn)篩選檢測(cè)，又能實(shí)現(xiàn)身份鑒定。

本研究建立的5 重real-time PCR特異性好，靈敏度可達(dá)單一real-time PCR水平，并且具有很好的適用性，能對(duì)國(guó)內(nèi)外已批準(zhǔn)的常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行初步篩查檢測(cè)，還可對(duì)常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花和油菜進(jìn)行篩查。此方法的研發(fā)，為轉(zhuǎn)基因水稻監(jiān)管和篩查提供了一種高效的技術(shù)手段。