代楊艷，韓宇琴，廖兵武，廖 晶，黃惠華

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

非酶糖基化反應(yīng)又稱美拉德反應(yīng)，是一種廣泛存在于食品生產(chǎn)過程中的褐變反應(yīng)。還原糖與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)通過非酶反應(yīng)結(jié)合形成不可逆的非酶晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）[1]。雖然美拉德反應(yīng)的發(fā)生對于一些食品品質(zhì)有正面作用（例如有助于面包的色澤、香氣風(fēng)味等的形成），但是在食品加工過程中的美拉德反應(yīng)往往涉及高溫處理（如烘焙、烹飪、乳制品和飲料生產(chǎn)等），會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的損耗和有害成分的產(chǎn)生；同時(shí)有研究表明，AGEs在人體中的積累與許多慢性退行性疾病如糖尿病[2]和腎臟疾病[3]的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系，此外AGEs也是導(dǎo)致腫瘤形成和病變的原因之一[4]。研究者發(fā)現(xiàn)通過減少中間產(chǎn)物的生成，阻隔氧化過程以及阻斷晚期糖基化終產(chǎn)物受體可以抑制AGEs的生物合成。但是人工合成的抑制劑氨基胍（amino guanidine，AG）對人體具有一定的毒副作用，因此，尋找高效低毒的天然抑制劑成為研究熱點(diǎn)。

我國是茶葉生產(chǎn)大國，茶葉資源十分豐富，茶葉中多酚類物質(zhì)含量依茶葉種類不同而有差別，約占茶葉干基質(zhì)量的18%～30%左右，其中兒茶素是茶多酚（tea polyphenols，TP）的主要成分，約占茶葉中多酚總量的70%～80%[5]。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)茶多酚具有顯著的抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抑菌抗炎[8]、降血脂[9]、防治心腦血管疾病[10]、提高免疫能力[11-12]、預(yù)防和治療糖尿病[13]等活性功能。此外，研究表明類黃酮[14]、酚酸[15]、芪類[16]對非酶糖基化具有抑制活性。多酚類化合物的生物學(xué)功能主要取決于其溶解性和穩(wěn)定性，TP可溶于水，但在水中易受光或氧化等因素降解并發(fā)生褐變[17]。對TP進(jìn)行化學(xué)改性，將親水性取代基修飾到表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等兒茶素的分子結(jié)構(gòu)中，從而改變TP的物理化學(xué)性質(zhì)，增強(qiáng)溶解性和穩(wěn)定性并延緩其氧化，同時(shí)能夠保留或增強(qiáng)TP的功能活性。Moon等[18]采用酶催化法合成3 種表沒食子兒茶素沒食子酸苷，結(jié)果表明3 種表沒食子兒茶素沒食子酸苷的抗氧化能力略有下降，但其水溶性大幅提高，同時(shí)光穩(wěn)定性和抗褐變能力也得到提升。馬來酸酐（maleic anhydride，MA）是目前世界上僅次于苯酐和醋酐的第三大酸酐原料，由于其含有共軛馬來?；?，水解后具有很強(qiáng)的親水性，化學(xué)性質(zhì)非常活潑，易發(fā)生酰胺化反應(yīng)和酯化反應(yīng)，因此可以用于某些天然成分的改性?；诖耍狙芯坎捎肕A對TP進(jìn)行化學(xué)改性，探究改性TP的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及抗糖化能力，以期為改性TP作為非酶糖基化抑制劑在食品領(lǐng)域提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TP、EGCG、兒茶素（catechin，C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、咖啡因（caffeine，CAF）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；MA天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox） 美國Sigma公司；喹喔啉、2-甲基喹喔啉、2-(2,3,4-三羥基丁基)-喹喔啉標(biāo)準(zhǔn)品北京百靈威公司；乙腈（色譜純） 永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；賴氨酸（lysine，Lys）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）、AG、吡啶、重水（D2O）、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國DIONEX公司；Synergy LX多功能微孔板檢測儀 美國BioTek儀器有限公司；AVANCE 400MHz液體超導(dǎo)核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀、VERTEX-33傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；SHA-B恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；HH-4恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；PHS-25 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬來酸酐改性茶多酚的制備

馬來酸酐改性茶多酚（maleic anhydride modified tea polyphenols，MA-TP）的制備根據(jù)白艷等[19]的方法并加以改動。準(zhǔn)確稱取TP樣品0.875 g于50 mL乙酸乙酯中，加入0.786 g MA和0.5 mL吡啶，置于50 ℃恒溫水浴搖床反應(yīng)6 h。所得樣液通過低溫旋蒸后冷凍干燥，得到MA-TP粉末。按照相同的方法制備MA改性EGCG（maleic anhydride modified EGCG，MA-EGCG）粉末。

1.3.2 結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 茶多酚組分鑒定

根據(jù)胡湘蜀[20]、Liang[21]等的方法并適當(dāng)改動鑒定TP組分。采用HPLC鑒定TP樣品主要成分，準(zhǔn)確稱取0.1 g TP樣品溶于乙腈中，用棕色容量瓶定容至100 mL，制備得到1 mg/mL的TP溶液，用0.22 μm濾膜過濾。色譜條件：色譜柱：Eclipse XDS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，B相為乙腈，流動相使用前用0.45 μm濾膜過濾；梯度洗脫程序：0～5 min，95%～80%流動相A，25～40 min，80%～50%流動相A，40～45 min，50%～90%流動相A，45～50 min，90%～95%流動相A；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測器檢測波長280 nm。

1.3.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

取少量干燥TP、MA-TP和TP/MA（1∶1，m/m）物理混合樣品，與適量KBr粉末均勻混合，壓片制樣，放置在FTIR儀中進(jìn)行檢測。測定條件：分辨率4 cm－1，掃描范圍4 000～400 cm－1。

1.3.2.3 核磁共振分析

將適量的EGCG和MA-EGCG溶解于重水（D2O）中（終質(zhì)量濃度40 mg/mL），采用400 MHz掃描，測定各化合物的1H-NMR和13C-NMR。

1.3.3 抗氧化活性測定

根據(jù)Re等[22]的方法適當(dāng)改動。將7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光室溫放置16 h，配制成ABTS陽離子自由基溶液，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將ABTS陽離子自由基溶液稀釋直至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。吸取適量樣品（TP、MA-TP），加入ABTS陽離子自由基溶液3 mL混合使其終質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100 μg/mL，室溫下避光反應(yīng)4 min，在734 nm波長處測定吸光度A樣品。以VC作為陽性對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按式（1）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。通過線性擬合方法計(jì)算各組樣品的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L）繪制Trolox濃度-ABTS陽離子自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各樣品ABTS陽離子自由基清除能力，結(jié)果以每克樣品清除ABTS陽離子自由基相當(dāng)于Trolox的物質(zhì)的量表示，單位為mmol/g。

式中：A樣品為樣品+ABTS陽離子自由基溶液的吸光度；A對照為樣品+PBS的吸光度；A空白為PBS+ABTS陽離子自由基溶液的吸光度。

1.3.4 非酶糖基化模擬體系的構(gòu)建

根據(jù)Ajandouz等[23]的方法適當(dāng)改動構(gòu)建非酶糖基化模擬體系。用0.2 mol/L pH 7.4 PBS分別配制0.05 mol/L賴氨酸溶液和0.05 mol/L果糖溶液，用PBS配制質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的TP、MA-TP樣品溶液，以AG為陽性對照。按照表1建立4個(gè)非酶糖基化模擬體系，分別為樣品抑制體系Fs、不含果糖對照體系Fa、完全糖基化對照體系Fb、不加樣品和不含果糖對照體系Fc。各組反應(yīng)液在90 ℃油浴中反應(yīng)5 h，分別于反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4、5 h時(shí)迅速取出各組反應(yīng)液并進(jìn)行冰水浴冷卻，置于－20 ℃冰箱保存待測。

表1 非酶糖基化模擬體系構(gòu)成Table 1 Composition of simulated non-enzymatic glycosylation systems

1.3.5 非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)物分析

取1 mL不同加熱反應(yīng)時(shí)間的各糖基化模擬體系反應(yīng)液，用0.2 mol/L pH 7.4 PBS稀釋10 倍后，分別于294、420 nm波長處測吸光度，空白對照為PBS。通過吸光度反映體系中非酶糖基化產(chǎn)物生成情況，比較不同樣品對非酶糖基化反應(yīng)的抑制能力。

1.3.6 二羰基化合物抑制率的測定

二羰基化合物濃度的測定根據(jù)Kocadagh等的方法[24]適當(dāng)改動。配制一系列的喹喔啉、2-甲基喹喔啉和2-(2,3,4-三羥基丁基)-喹喔啉的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 mmol/L），過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC分析，獲得計(jì)算乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）、3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。用0.2 mol/L pH 7.4 PBS配制0.05 mmol/L的OPD溶液，取1 mL 1.3.4節(jié)不同加熱反應(yīng)時(shí)間的各組糖基化反應(yīng)液樣品，加入300 μL OPD溶液，在60 ℃水浴中衍生30 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱：Eclipse XDS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，B相為甲醇，流動相使用前用0.45 μm濾膜過濾；梯度洗脫條件：0～10 min，A相70%～40%；10～12 min，A相40%～70%；A相70%持續(xù)3 min，運(yùn)行總時(shí)間為15 min；進(jìn)樣量：5 μL；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測器檢測波長315 nm。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算二羰基化合物濃度；按式（2）計(jì)算各二羰基化合物抑制率。

式中：As為樣品+Lys+Fru體系中各二羰基化合物峰面積；Aa為樣品+Lys體系中各二羰基化合物峰面積；Ab為Lys+Fru體系中各二羰基化合物峰面積；Ac為只含Lys體系各二羰基化合物峰面積。

1.3.7 戊糖素抑制率的測定

根據(jù)Awasthi等[25]的方法適當(dāng)改動測定戊糖素含量。取1 mL 1.3.4節(jié)不同加熱反應(yīng)時(shí)間的各組糖基化反應(yīng)液，用PBS稀釋30 倍。于激發(fā)電壓600 V、激發(fā)波長335 nm、發(fā)射波長382 nm條件下測定反應(yīng)液熒光強(qiáng)度，空白對照為PBS，以熒光強(qiáng)度表征戊糖素含量。按式（3）計(jì)算戊糖素抑制率。

式中：Fst和Fs0為樣品+Lys+Fru體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fat和Fa0為樣品+Lys體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fbt和Fb0為Lys+Fru體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fct和Fc0為只含Lys體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 熒光性AGEs抑制率的測定

根據(jù)Awasthi等[25]的方法適當(dāng)改動。取1 mL 1.3.4節(jié)不同加熱反應(yīng)時(shí)間的各組糖基化反應(yīng)液，用PBS稀釋30 倍。于激發(fā)電壓600 V、激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm條件下測定熒光強(qiáng)度，空白對照為PBS，以熒光強(qiáng)度表征熒光性AGEs含量。按式（4）計(jì)算熒光性AGEs抑制率。

式中：Fst和Fs0為樣品+Lys+Fru體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fat和Fa0為樣品+Lys體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fbt和Fb0為Lys+Fru體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度；Fct和Fc0為只含Lys體系分別在t時(shí)刻和0時(shí)刻的熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 組平行，3 次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)采用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)，分析差異顯著性，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 茶多酚組分分析結(jié)果

由圖1可知，TP各組分得到很好的分離，主要成分為EGCG、ECG、C、EC、EGC等兒茶素單體以及CAF。與兒茶素單體及CAF標(biāo)準(zhǔn)品圖譜對比，得到TP樣品各組分的相對含量分別為EGCG 66.20%、ECG 22.06%、EC 3.91%、EGC 2.31%、CAF 1.16%、C 0.44%。

圖1 5 種兒茶素單體和CAF標(biāo)準(zhǔn)品（A）與TP樣品（B）的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard solution of five catechin monomers and CAF (A) and TP sample (B)

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

TP、MA-TP和TP/MA物理混合樣品的FTIR圖如圖2所示。3 444 cm－1處吸收峰是苯環(huán)上Ar—OH的伸縮振動所引起；1 692 cm－1處吸收峰是羰基C=O伸縮振動所引起；1 613、1 519、1 453 cm－1處吸收峰是苯環(huán)面內(nèi)C=C骨架振動所引起；1 340 cm－1處吸收峰是苯環(huán)上O—H的面內(nèi)彎曲振動所引起；1 236 cm－1處吸收峰是C—O—C的反對稱伸縮振動所引起；1 033 cm－1處吸收峰是C—O—C對稱伸縮振動所引起；969 cm－1處吸收峰是C=C的反式伸縮振動所引起[26-28]。

圖2 TP、MA-TP、TP/MA物理混合的FTIR圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of TP, MA-TP and TP/MA physical mixture

C—O—C的反對稱吸收峰和對稱吸收峰通常分別出現(xiàn)在1 270～1 230 cm－1和1 050～1 000 cm－1處，MA-TP在1 236 cm－1和1 033 cm－1處吸收峰強(qiáng)度均強(qiáng)于TP和TP/MA，在1 694 cm－1處具有羰基C=O伸縮振動的強(qiáng)吸收峰，表明改性后的產(chǎn)物屬于一種酯類物質(zhì)[29]；同時(shí)，MA-TP在970 cm－1處吸收峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于TP，可能是MA結(jié)構(gòu)中原有的C=C結(jié)合到TP分子中所引起[30]；另一方面，在TP/MA中發(fā)現(xiàn)了1 848 cm－1處和1 776 cm－1處的吸收峰，分別為MA重復(fù)單元中C=O的對稱和反對稱伸縮振動吸收峰[31]，而在MA-TP圖譜中沒有出現(xiàn)，說明MA已基本上參與了反應(yīng)且無殘留。

2.1.3 核磁共振光譜分析結(jié)果

由于TP是一種混合物，不易對其進(jìn)行核磁共振光譜分析，同時(shí)上述液相分析結(jié)果表明EGCG是TP樣品中含量最高的兒茶素，所以通過相同的改性方法對EGCG進(jìn)行改性得到MA-EGCG粉末，并對EGCG和MA-EGCG進(jìn)行核磁共振光譜分析來檢測MA改性對EGCG以及TP結(jié)構(gòu)的影響。由圖3A1、B1中1H-NMR圖譜可知，MA-EGCG各質(zhì)子峰的化學(xué)位移與EGCG相近，但與EGCG相比，MA-EGCG 8位C上化學(xué)位移δ=5.92的質(zhì)子峰[32]消失，同時(shí)在化學(xué)位移δ=6.17、δ=7.83、δ=8.37、δ=8.55處新增了較強(qiáng)的質(zhì)子峰，表明MA改性可能取代了8位C上的H，并根據(jù)新增質(zhì)子峰推測可能發(fā)生了多取代反應(yīng)，后續(xù)將通過質(zhì)譜進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)鑒定。由圖3A2、B2中13C-NMR圖譜可知，MA-EGCG的化學(xué)位移與EGCG相近，新增了δ=127.30、δ=133.60、δ=138.13、δ=170.55處4個(gè)較強(qiáng)的峰，可能為MA結(jié)構(gòu)中C=C、酯鍵中碳的化學(xué)位移[33]。同樣，在MA-TP的1H-NMR和13C-NMR的圖譜中，也有相應(yīng)的化學(xué)位移出現(xiàn)（文中未給出圖）。

圖3 EGCG和MA-EGCG的1H-NMR和13C-NMR圖Fig. 3 1H-nuclear magnetic resonance (NMR) and 13C-NMR spectra of EGCG and MA-EGCG

2.2 茶多酚改性前后抗氧化活性比較

如圖4所示，在質(zhì)量濃度為20～100 μg/mL范圍內(nèi)，TP和MA-TP比VC具有更高的ABTS陽離子自由基清除率，說明TP和MA-TP均具有良好的抗氧化活性。但是當(dāng)質(zhì)量濃度低于100 μg/mL時(shí)，MA-TP的ABTS陽離子自由基清除率顯著低于TP（P＜0.05），這可能是由于MA化學(xué)改性使TP分子結(jié)構(gòu)上的部分活性羥基被取代，從而導(dǎo)致抗氧化活性下降。經(jīng)計(jì)算，TP、MA-TP和VC ABTS陽離子自由基清除率的IC50分別為（22.19±0.15）、（43.49±1.06）、（76.98±0.10）μg/mL；而這3 種樣品的半抑制濃度下ABTS陽離子自由基清除能力分別為（15.86±0.11）、（8.09±0.03）、（4.57±0.01）mmol/g。表明在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，3 種物質(zhì)對ABTS陽離子自由基清除能力的順序由高到低為TP＞MA-TP＞VC。

圖4 TP、MA-TP和VC對ABTS陽離子自由基的清除作用Fig. 4 ABTS cation radical scavenging activity of TP, MA-TP and VC

2.3 改性茶多酚對非酶糖基化產(chǎn)物的影響

非酶糖基化產(chǎn)物在294 nm波長處的吸光度是反映體系中前體物質(zhì)形成情況的特征指標(biāo)[23]，因此本實(shí)驗(yàn)測定了不同加熱時(shí)間下的不同反應(yīng)組別（Lys+Fru完全糖基化組、AG+Lys+Fru陽性對照組、TP+Lys+Fru及MTP+Lys+Fru抑制組）在294 nm波長處的吸光度，結(jié)果如圖5A所示，各組別吸光度都隨著加熱反應(yīng)時(shí)間的延長而明顯上升，這與Kim等[34]對葡萄糖-甘氨酸/二甘氨酸/三甘氨酸體系進(jìn)行熱處理的研究結(jié)果一致。但在相同加熱反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，各組A294nm由低到高依次為MA-TP+Lys+Fru＜TP+Lys+Fru＜AG+Lys+Fru＜Lys+Fru。結(jié)果表明，隨著加熱反應(yīng)時(shí)間的延長，大量前體物質(zhì)生成；同時(shí)，MA-TP和TP具有優(yōu)于陽性對照的前體物質(zhì)抑制效果，并且MA改性提高了TP對前體物質(zhì)的抑制能力，MA-TP對中間產(chǎn)物的較強(qiáng)抑制效果可能是其結(jié)構(gòu)對前體物質(zhì)的捕獲能力增強(qiáng)所致。

非酶糖基化反應(yīng)的高級階段會生成棕色物質(zhì)，通常以其在420 nm波長處的吸光度來反映非酶糖基化程度[35]。由圖5B可知，不同反應(yīng)組A420nm隨著加熱反應(yīng)時(shí)間的延長明顯增大，而在相同加熱時(shí)間下，各組A420nm由低到高依次為MA-TP+Lys+Fru＜TP+Lys+Fru＜AG+Lys+Fru＜Lys+Fru。上述結(jié)果表明，隨著加熱時(shí)間的延長，棕色物質(zhì)快速生成并積累，與上述前體物質(zhì)有相似的增長趨勢，Benjakul等[36]的研究也發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中生成的前體物質(zhì)促進(jìn)了焦糖化反應(yīng)的發(fā)生；同時(shí)通過與陽性對照AG相比，MA-TP和TP具有更好的抑制效果，且MA改性提高了TP對棕色物質(zhì)的抑制能力。

圖5 果糖-賴氨酸模擬體系中得到的非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)物在294 nm（A）、420 nm（B）波長處的吸光度隨加熱時(shí)間的變化Fig. 5 Changes in absorbance at 294 nm (A) and 420 nm (B) of the non-enzymatic glycosylated products derived from aqueous fructoselysine model system as a function of heating time

2.4 茶多酚及其改性衍生物對二羰基化合物的抑制作用

在非酶糖基化反應(yīng)的中間階段，Amadori產(chǎn)物經(jīng)過一系列脫氫、氧化和重排反應(yīng)生成具有高度活性的衍生羰基化合物，其中GO、MGO和3-DG是人體內(nèi)AGEs的重要中間體[37]。圖6為3 種α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品及模擬體系反應(yīng)液經(jīng)過OPD衍生化后在315 nm波長處的HPLC圖，可以看出模擬體系反應(yīng)液中3 種α-二羰基化合物GO、MGO、3-DG得到了較好的分離。3 種α-二羰基化合物GO、MGO、3-DG的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=6.360 1x+0.015 5、y=8.555 7x+0.016 9、y=11.031 9x+0.001 2，決定系數(shù)R2均大于0.999 8，表明3 種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

圖6 3 種二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）和反應(yīng)體系樣液（B）的HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatograms of three α-dicarbonyl standards (A) and Maillard reaction solution (B)

圖7A為GO濃度隨加熱時(shí)間的變化，在加熱過程中GO濃度開始階段迅速升高，隨后下降，變化趨勢與黃啟瑞等[38]的研究結(jié)果相似，這可能是由于在反應(yīng)初期GO快速生成，進(jìn)入非酶糖基化反應(yīng)末期階段其被消耗。完全糖基化組和陽性對照組的GO濃度在加熱2 h達(dá)到最大，而TP和MA-TP抑制組在加熱3 h達(dá)到最大，這可能是由于TP和MA-TP具有捕獲GO的能力[39]，使反應(yīng)前期GO生成速度減慢，而隨著加熱時(shí)間的延長抑制劑被消耗，后期難以抑制GO的生成。在相同的加熱時(shí)間下，MA-TP抑制組中的GO濃度始終顯著低于TP抑制組（P＜0.05），抑制率最高為82.95%（0.5 h時(shí)），表明MA-TP對GO的抑制能力強(qiáng)于TP，說明經(jīng)過MA改性后，MA-TP的化學(xué)結(jié)構(gòu)更有利于對GO的捕獲。圖7B為MGO濃度隨加熱時(shí)間的變化，各組MGO濃度隨加熱時(shí)間的延長而增加，這與呂夢莎等[40]的研究結(jié)果相似，但在相同的加熱時(shí)間下，MA-TP、TP抑制組和陽性對照組中MGO濃度顯著低于完全糖基化處理組，表明MA-TP、TP和AG對MGO的生成均具有良好的抑制效果；同時(shí)MA-TP抑制組中MGO濃度始終顯著低于TP組（P＜0.05），抑制率最高為40.33%（3 h時(shí)），表明MA-TP對MGO的抑制能力也強(qiáng)于TP，同樣說明經(jīng)過MA改性后，MA-TP更有利于對MGO的捕獲；圖7C為3-DG濃度隨加熱時(shí)間的變化，各組3-DG濃度隨加熱時(shí)間的延長而增加，這與吳春劍[41]的結(jié)果相似。MA-TP、TP和AG對3-DG的生成同樣均具有良好的抑制效果。反應(yīng)前期MA-TP、TP抑制組中3-DG濃度相近，這可能是由于3-DG分子結(jié)構(gòu)大，經(jīng)過MA改性后的MA-TP的空間位阻大，不易與3-DG結(jié)合，MA-TP抑制率最高為45.01%（5 h時(shí)）。但在反應(yīng)中后期，MA-TP抑制組中3-DG濃度顯著低于TP（P＜0.05），這可能是由于經(jīng)過MA改性，TP熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，使得MA-TP在反應(yīng)中后期對3-DG的生成依舊具有良好的抑制能力。

圖7 果糖-賴氨酸反應(yīng)體系中GO（A）、MGO（B）、3-DG（C）濃度隨加熱時(shí)間的變化Fig. 7 Changes in the concentrations of GO (A), MGO (B), and 3-DG (C)in the fructose-lysine reaction system with heating time

2.5 茶多酚及其衍生物對戊糖素的抑制作用

戊糖素一般由戊糖和賴氨酸、精氨酸通過Amadori重排后繼續(xù)氧化交聯(lián)而產(chǎn)生，是一種具有交聯(lián)性和熒光特性的糖基化終產(chǎn)物，在其他糖類如果糖、葡萄糖與氨基酸的反應(yīng)中也可生成[42]，可通過熒光強(qiáng)度反映戊糖素的含量[25]。

由圖8可知，在反應(yīng)初期，MA-TP和TP處理組中的戊糖素含量增長速率較慢，隨著加熱時(shí)間的延長，各組別中戊糖素含量明顯增加。在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，MA-TP和TP處理組中戊糖素?zé)晒鈴?qiáng)度顯著低于完全糖基化組和陽性對照組（P＜0.05），表明MA-TP和TP對戊糖素的生成均具有較好的抑制能力，同時(shí)兩者對前期抑制效果較好，0.5 h時(shí)抑制率分別高達(dá)88.43%和84.81%，后期抑制效果可能因樣品部分消耗而有所下降。

圖8 果糖-賴氨酸反應(yīng)體系中戊糖素含量隨加熱時(shí)間的變化Fig. 8 Changes in the content of pentose in the fructose-lysine reaction system during heating

2.6 茶多酚及其改性衍生物對總體熒光性AGEs的抑制作用

AGEs主要是由蛋白質(zhì)或氨基酸的游離氨基與還原糖的羰基經(jīng)過縮合、氧化、重排、交聯(lián)等一系列反應(yīng)形成的一類不可逆終產(chǎn)物的總稱[43]。由于AGEs多具有自發(fā)熒光性，所以可通過測定各反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度反映其AGEs水平[44]。

由圖9A可知，0～1 h內(nèi)，F(xiàn)a對照體系MA-TP+Lys和TP+Lys中熒光強(qiáng)度逐漸提高，隨后處于穩(wěn)定狀態(tài)，而Fa對照體系A(chǔ)G+Lys和Lys中熒光強(qiáng)度曲線互相重合，并且在加熱過程中基本保持不變。MA-TP+Lys組中熒光強(qiáng)度顯著高于TP+Lys組（P＜0.05），表明經(jīng)過MA改性后，MA-TP更易與Lys結(jié)合。另一方面，從圖9B可以看出，在0～2 h內(nèi)，MA-TP和TP反應(yīng)體系中熒光性AGEs生成速率緩慢增加，隨后迅速增加，這可能是由于反應(yīng)前期MA-TP和TP與Lys結(jié)合，隨著反應(yīng)進(jìn)行抑制劑逐漸消耗而所導(dǎo)致。同時(shí)，比較各組熒光性AGEs的含量，由高到低依次為Lys+Fru＞AG+Lys+Fru＞TP+Lys+Fru＞MA-TP+Lys+Fru（P＜0.05），表明經(jīng)過MA改性，MA-TP對總體熒光性AGEs的生成具有更好的抑制能力，抑制率最高為95.4%（0.5 h時(shí)）。這可能是由于MA-TP更易與賴氨酸或Amadori產(chǎn)物結(jié)合，占據(jù)非酶糖基化的交聯(lián)位點(diǎn)，導(dǎo)致糖基化后期的交聯(lián)無法有效進(jìn)行，從而抑制了熒光性AGEs的形成。

圖9 Fa對照體系（A）與樣品抑制體系Fs（B）熒光性AGEs含量的變化Fig. 9 Changes in fluorescence intensity of control (A) and inhibition (B)systems during heating

3 結(jié) 論

通過MA-TP、TP和AG對Lys-Fru體系中各二羰基化合物（GO、MGO、3-DG）、戊糖素和總體熒光性AGEs抑制能力的實(shí)驗(yàn)，證明三者均可抑制糖基化反應(yīng)。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)MA-TP對非酶糖基化抑制作用優(yōu)于TP和AG，尤其在反應(yīng)中后期，說明經(jīng)過MA改性，可以有效提高TP的熱穩(wěn)定性，對抑制高溫下的糖基化反應(yīng)產(chǎn)生積極作用，提高TP的抗糖基化能力。同時(shí)，MA-TP易與氨基酸或Amadori產(chǎn)物結(jié)合，占據(jù)非酶糖基化的交聯(lián)位點(diǎn)，使糖基化后期的交聯(lián)無法有效進(jìn)行，進(jìn)而抑制了熒光性AGEs的生成。