黃婧 蘇金 周鵬 張強(qiáng) 張敏

(江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，南京，211153) (南京林業(yè)大學(xué)) (江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院) (南京林業(yè)大學(xué)) (江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院)

近年來(lái)，彩葉樹(shù)種因其獨(dú)特的葉色在園林綠化中備受重視，彩葉樹(shù)種成為綠化發(fā)展的新趨勢(shì)，目前許多研究人員爭(zhēng)相引進(jìn)和培育各種彩葉植物。植物的色彩是由葉片內(nèi)色素的種類、含量及其分布決定的[1-2]，光照作為重要的環(huán)境因子影響植物色素合成及相關(guān)酶的活性，從而影響葉片呈色。遮蔭可明顯改變植株的光照強(qiáng)度，植物在遮蔭環(huán)境下，形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上都會(huì)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性。

高等植物葉綠素合成是由許多酶參與的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程[3]，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生突變都可能影響葉綠素的合成，從而引起葉色的變化。首先是通過(guò)谷氨酸合成δ-氨基乙酰丙酸，再由δ-氨基乙酰丙酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟懮卦蝗缓?分子的膽色素原聚合成為1分子線性的四吡咯分子羥甲基膽色烷，最后異構(gòu)化形成環(huán)狀的尿卟啉原Ⅲ，這是葉綠素各前體物質(zhì)中最先具有卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)的分子。形成卟啉環(huán)骨架后，糞卟啉原Ⅲ會(huì)氧化成原卟啉Ⅸ，接著再形成鎂-原卟啉Ⅸ和原葉綠素酸酯(最后一個(gè)前體物質(zhì))。在此過(guò)程中，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、尿卟啉原III(Urogen III)、糞卟啉原III(Coprogen II)、原卟啉IX(ProtoIX)、鎂-原卟啉(Mg-Proto)和原葉綠素酸酯(Pchlide)是其重要合成前體物[4]。谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR)是δ-氨基乙酰丙酸合成的關(guān)鍵酶，催化δ-氨基乙酰丙酸向尿卟啉原Ⅲ的轉(zhuǎn)化；而催化δ-氨基乙酰丙酸生成膽色素原的δ-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)；以及催化羥甲基膽素重排環(huán)、合成天然四吡咯化合物的尿卟啉原III合酶(UmgenIIIs)，是植物葉綠素合成途徑的關(guān)鍵酶[5]。同時(shí)，高等植物體內(nèi)合成的葉綠素可通過(guò)脫植基、脫鎂等一系列反應(yīng)而降解。在葉綠素降解過(guò)程中，催化葉綠素脫去植醇的葉綠素酶(Chlorophyllase)、脫鎂螯合酶(MDCase)也是高等植物葉綠素降解過(guò)程的關(guān)鍵酶[6-7]。

彩葉冬青黃金枸骨(Ilexxattenuata‘Sunny Foster’)屬于光照敏感型葉色突變體，是冬青品種選育中重要的種質(zhì)資源。冬青葉色受光照強(qiáng)度影響，在全光或強(qiáng)光條件下，葉片呈現(xiàn)黃色，在弱光環(huán)境下葉片的色彩淡化，如建筑物的遮擋，園林植物相互間的遮擋，出現(xiàn)色彩變淺、葉片復(fù)綠的現(xiàn)象，降低觀賞價(jià)值，這已成為園林施工中的難題，但目前關(guān)于彩葉樹(shù)種葉片復(fù)綠研究較少。為了研究黃金構(gòu)骨葉片受光照強(qiáng)度調(diào)控機(jī)制，通過(guò)人工遮蔭的方法，使黃金枸骨葉片從黃色變?yōu)榫G色，對(duì)此過(guò)程中葉綠素合成主要中間產(chǎn)物的含量和關(guān)鍵酶活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤，描繪葉綠素生物合成代謝特征，尋找葉片變色過(guò)程中葉綠素合成的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為黃金枸骨在園林綠化中的應(yīng)用提供技術(shù)支持，也為冬青葉色改良提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)在江蘇省南京市江寧區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚。試驗(yàn)時(shí)間為2018年9—10月份。選擇生長(zhǎng)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生黃金枸骨苗木，移栽至塑料容器中，每盆1株，共30盆，進(jìn)行常規(guī)管理。利用黑色遮蔭網(wǎng)進(jìn)行四面遮蔭處理，經(jīng)測(cè)定，遮蔭前后光照強(qiáng)度分別為1 500、150 μmol·m-2·s-1。6個(gè)采樣時(shí)間分別為：遮陰前(全黃)、遮陰6、15、22、29、36 d。每個(gè)時(shí)期進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3株黃金枸骨進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 各生理指標(biāo)測(cè)定方法

葉綠素的質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定：葉綠素的質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定參照Aron[8]的方法測(cè)定。取0.1 g葉片，加入體積分?jǐn)?shù)為80%丙酮2～3 mL，磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL棕色容量瓶中，再加80%的丙酮水溶液定容至10 mL，避光浸提。將色素提取液倒入比色杯內(nèi)。以80%丙酮為對(duì)照，在波長(zhǎng)645、663和440 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

葉綠素前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度測(cè)定：δ-氨基乙酰丙酸(ALA)的質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定參照Dei[9]的方法。ALA的質(zhì)量摩爾濃度以535 nm的摩爾消光系數(shù)7.2×104mol-1·cm-1計(jì)算。

膽色素原(PBG)的質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定參照徐培洲等[10]的方法。膽色素原的質(zhì)量摩爾濃度以535 nm的摩爾消光系數(shù)6.1×104mol-1·cm-1計(jì)算。

尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)和糞卟啉原Ⅲ(Coprogen Ⅲ)的質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定參照Bogorad[10]的方法，Urogen Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度以405.5 nm的摩爾消光系數(shù)5.48×105mol-1·cm-1計(jì)算，Coprogen Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度以399.5 nm的摩爾消光系數(shù)4.89×105mol-1·cm-1計(jì)算。

葉綠素代謝關(guān)鍵酶活性測(cè)定：谷氨酰-tRNA還原酶活性、δ-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)活性、尿卟啉原Ⅲ合酶(Uroporphyrinogen III synthase)活性、葉綠素酶和脫鎂螯合酶活性檢測(cè)，采用對(duì)應(yīng)的ELISA試劑盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)測(cè)定或統(tǒng)計(jì)的各指標(biāo)采用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素合成前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度變化

由表1、表2可知，黃金構(gòu)骨葉片變綠過(guò)程中，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著增加。葉綠素合成初期的前體物質(zhì)δ-氨基乙酰丙酸和膽色素原的質(zhì)量摩爾濃度顯著減少(P<0.05)。δ-氨基乙酰丙酸的質(zhì)量摩爾濃度從0.11 μmol·g-1減少到0.89 μmol·g-1，降幅為46.24%，其中0～15 d下降最顯著。膽色素原的質(zhì)量摩爾濃度從0.35 μmol·g-1減少到3.55 μmol·g-1，降幅為38.77%。

表1 葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 mg·g-1

表2 葉綠素合成前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度 μmol·g-1

葉綠素合成過(guò)程中，位于膽色素原下游的前體物質(zhì)尿卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度顯著升高(P<0.05)，從0.36 μmol·g-1升高到0.72 μmol·g-1，增幅為100.46%，遮陰第6 d后增幅顯著。糞卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度也顯著升高(P<0.05)，從0.62 μmol·g-1升高到1.25 μmol·g-1，增幅為100.27%，遮陰第6、22、36 d增幅最顯著。

尿卟啉原Ⅲ下游的原卟啉IX、鎂-原卟啉和原葉綠素酸酯這3個(gè)前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度都顯著升高(P<0.05)。原卟啉IX的質(zhì)量摩爾濃度從0.63 μmol·g-1升高到1.11 μmol·g-1，增幅為76.85%，鎂-原卟啉的質(zhì)量摩爾濃度從0.77 μmol·g-1升高到1.29 μmol·g-1，增幅為67.63%，原葉綠素酸酯的質(zhì)量摩爾濃度從0.23 μmol·g-1升高到0.65 μmol·g-1，增幅達(dá)185.57%。

2.2 葉綠素代謝關(guān)鍵酶活性的變化

由表3可知，葉綠素合成關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和δ-氨基乙酰丙酸脫水酶的活性隨著葉片變綠顯著下降(P<0.05)，谷氨酰-tRNA還原酶活性從3 712.302 U/g下降到3 033.036 U/g，降幅為18.3%；δ-氨基乙酰丙酸脫水酶的活性從3 988.89 U/g下降到2 599.89 U/g，降幅為34.82%。而葉綠素合成關(guān)鍵酶尿卟啉原Ⅲ合酶的活性隨著葉片變綠顯著上升(P<0.05)，從3 441.48 U/g上升到4 192.55 U/g，增幅為21.82%，從遮陰第6 d開(kāi)始顯著上升。

表3 葉綠素代謝關(guān)鍵酶活性 U·g-1

葉綠素降解關(guān)鍵酶葉綠素酶和脫鎂螯合酶的活性都隨著葉片變色而下降。葉綠素酶的活性從147.781 U/g下降到140.200 U/g，主要在29～36 d時(shí)顯著下降(P<0.05)，降幅為5.13%，其他時(shí)期無(wú)顯著差異。脫鎂螯合酶的活性隨著葉片變綠顯著下降(P<0.05)，從263.003 U/g下降到231.531 U/g，降幅為11.97%，遮陰第6 d開(kāi)始顯著降低。

3 討論

本文研究了黃金枸骨葉片復(fù)綠期的葉綠素代謝調(diào)控特征，發(fā)現(xiàn)隨著葉色復(fù)綠，葉綠素合成關(guān)鍵酶活性升高，葉綠素合成前體物質(zhì)含量顯著增加，葉綠素的積累起始于尿卟啉原Ⅲ的增加，起始時(shí)間為遮蔭后6～15 d；同時(shí)葉綠素降解酶活性降低，促進(jìn)葉綠素的積累，最終實(shí)現(xiàn)了葉片在遮蔭條件下葉綠素含量升高，葉片由黃轉(zhuǎn)綠。

本研究對(duì)葉綠素合成通路中重要的前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度分析發(fā)現(xiàn)，葉綠素合成通路上游的物質(zhì)δ-氨基乙酰丙酸和膽色素原的質(zhì)量摩爾濃度顯著減少，而其后生成的尿卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，并且尿卟啉原Ⅲ之后，前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度都顯著升高，說(shuō)明遮蔭引起的葉綠素積累可能起始于尿卟啉原Ⅲ的增加。

對(duì)葉綠素合成關(guān)鍵酶活性變化分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酰-tRNA還原酶和δ-氨基乙酰丙酸脫水酶的活性隨著葉片變綠顯著下降，尿卟啉原Ⅲ合酶活性顯著上升，導(dǎo)致尿卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，是引起葉綠素積累的關(guān)鍵。δ-氨基乙酰丙酸合成的關(guān)鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR)活性顯著降低，是由于GluTR編碼基因的轉(zhuǎn)錄受光的調(diào)控，遮蔭后導(dǎo)致GIuTR酶活性的降低，這與Ilag et al.[13]的研究結(jié)果一致。Ilag et al.[13]研究發(fā)現(xiàn)GluTR編碼基因的轉(zhuǎn)錄受光的調(diào)控，遮蔭后光照強(qiáng)度的降低導(dǎo)致GIuTR酶活性的降低，最終使δ-氨基乙酰丙酸的質(zhì)量摩爾濃度降低，在其他植物遮蔭處理時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象[14]。催化δ-氨基乙酰丙酸轉(zhuǎn)化為膽色素原的δ-氨基乙酰丙酸脫水酶活性顯著降低，是由于其底物δ-氨基乙酰丙酸的質(zhì)量摩爾濃度減少，從而引起膽色素原的質(zhì)量摩爾濃度呈下降趨勢(shì)。而尿卟啉原Ⅲ合酶活性顯著上升，是引起葉綠素積累的關(guān)鍵步驟，也說(shuō)明尿卟啉原Ⅲ合酶受底物的質(zhì)量摩爾濃度的影響較小，與俞金健等[15]的研究結(jié)果一致。Wang et al.[16]研究發(fā)現(xiàn)紫薇葉綠素缺失突變體在低光照條件下，糞卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，尿卟啉原Ⅲ合酶活性在6～15 d顯著上升，與本研究結(jié)果一致。

對(duì)葉綠素降解相關(guān)酶活性變化研究發(fā)現(xiàn)，葉片變色過(guò)程中脫鎂螯合酶活性降低導(dǎo)致合成的葉綠素停留在植物體內(nèi)，促進(jìn)葉綠素的積累。脫鎂螯合酶在遮蔭前期(6～15 d)活性就顯著降低，葉綠素酶到遮蔭末期(29～36 d)活性下降，說(shuō)明這兩個(gè)降解通路對(duì)光照的敏感度不一樣。同樣說(shuō)明葉綠素的積累一是由于葉綠素合成中間途徑酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致前體物質(zhì)的積累，二是葉綠素降解酶活性的下降，降低葉綠素的降解。

通過(guò)動(dòng)態(tài)追蹤葉色復(fù)綠期的葉綠素合成前體物質(zhì)的質(zhì)量摩爾濃度和代謝酶活性發(fā)現(xiàn)，葉綠素積累的關(guān)鍵物質(zhì)——尿卟啉原Ⅲ的質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，葉綠素積累的關(guān)鍵酶——尿卟啉原Ⅲ合酶活性的顯著升高，葉綠素合成和積累的關(guān)鍵時(shí)期——遮蔭后6～15 d，此時(shí)葉綠素合成相關(guān)酶活性開(kāi)始顯著升高，葉綠素降解酶活性顯著降低，葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著增加。本研究結(jié)果初步分析了黃金枸骨葉綠素合成代謝受光照調(diào)控的特征，為冬青葉色改良提供新的思路，也為其栽培生產(chǎn)和園林綠化應(yīng)用提供技術(shù)支持。