單婷玉，施雯，王翌婷，曹孜怡，汪保華，方輝

玉米鹽脅迫相關(guān)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測(cè)

單婷玉，施雯，王翌婷，曹孜怡，汪保華，方輝

南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方平原玉米科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，南通 226019

鹽脅迫是影響玉米產(chǎn)量的重要因素，為探究玉米鹽脅迫響應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)，本研究以150份遺傳背景豐富的玉米自交系為材料，結(jié)合34,342個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，利用混合線性模型對(duì)玉米兩個(gè)鹽脅迫相關(guān)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明：共鑒定8個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)與鹽脅迫相關(guān)性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中3個(gè)位點(diǎn)與枯萎度顯著關(guān)聯(lián)，分布在4號(hào)和9號(hào)染色體上，5個(gè)SNP位點(diǎn)與株高變化率顯著關(guān)聯(lián)，分布在1、2、3和6號(hào)染色體上。結(jié)合鹽脅迫下基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)和功能注釋，篩選到11個(gè)候選基因，利用qRT-PCR驗(yàn)證其中7個(gè)基因在鹽脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)。本研究結(jié)果為玉米耐鹽機(jī)理的解析奠定了基礎(chǔ)，為玉米耐鹽種質(zhì)的培育提供新的靶基因。

玉米；鹽脅迫；混合線性模型；全基因組關(guān)聯(lián)分析

土壤鹽堿是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的一個(gè)重要問(wèn)題，鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)危害嚴(yán)重。植物體內(nèi)高濃度的鹽會(huì)造成滲透壓失衡，植物根系很難吸收水分，并且高濃度的鹽會(huì)造成植物離子中毒[1,2]。玉米(L.)具有高產(chǎn)、易管理、用途廣泛等特性，深受人們喜愛(ài)，目前無(wú)論從種植面積還是產(chǎn)量，均高于水稻(L.)和小麥(L.)，位于第一位。未來(lái)，玉米產(chǎn)量仍需進(jìn)一步提升才能保障我國(guó)的糧食安全。然而，玉米是一種鹽敏作物，很容易受到鹽脅迫的影響，導(dǎo)致產(chǎn)量降低[3,4]。因此，在注重玉米產(chǎn)量持續(xù)提高的同時(shí)，也應(yīng)關(guān)注抗逆玉米的培育。

早期研究表明，不同的玉米自交系在鹽脅迫下展現(xiàn)出不同的鹽脅迫反應(yīng)[5]，但對(duì)玉米鹽脅迫響應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)研究仍然較少。QTL (quantitative trait loci)定位是一種經(jīng)典的研究數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)的方法，植物中多種復(fù)雜性狀都采用該方法進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的解析，包括多種作物的耐鹽性QTL定位[6～10]。例如，水稻中最早被克隆的QTL是[11]，其編碼HKT(high-affinity K+transporter)類型的蛋白，在鹽脅迫下能維持Na+/K+的體內(nèi)平衡。在玉米中，Cui等[12]用一個(gè)包含161個(gè)家系的重組自交系群體結(jié)合3000個(gè)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide poly-morphism, SNP)驗(yàn)證了8個(gè)鹽脅迫響應(yīng)QTL。最近，Zhang等[13]利用Zheng58和Chang7-2組配的重組自交系群體成功克隆了基因，研究表明的功能缺失能增加葉片中Na+的積累，提高對(duì)鹽離子的敏感性，進(jìn)一步證明基因?qū)}脅迫的正向調(diào)控作用。

另外，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide asso-ciation mapping, GWAS)也是解析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)的常用方法。Luo等[5]利用關(guān)聯(lián)群體鑒定到57個(gè)位點(diǎn)與玉米鹽脅迫響應(yīng)顯著關(guān)聯(lián)，篩選了49個(gè)候選基因，其中44%的基因與脅迫響應(yīng)相關(guān)，同時(shí)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證了和兩個(gè)基因調(diào)控玉米的鹽脅迫響應(yīng)功能。除此之外，通過(guò)GWAS方法和基因也被相繼克隆[14,15]，分別編碼HAK家族的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Ca+結(jié)合蛋白。綜上所述，作為影響玉米產(chǎn)量的重要脅迫因素，無(wú)論在QTL還是基因水平，針對(duì)玉米耐鹽性的研究還相對(duì)較少，仍然需要克隆更多的基因，從而更深入的了解玉米鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制，輔助培育耐鹽玉米品種。

本研究基于一個(gè)包含150個(gè)自交系的關(guān)聯(lián)群體，利用混合線性模型，剖析玉米鹽脅迫響應(yīng)的遺傳結(jié)構(gòu)，挖掘玉米鹽脅迫相關(guān)的候選基因，為玉米耐鹽種質(zhì)的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與表型鑒定

本實(shí)驗(yàn)所用關(guān)聯(lián)群體共包含150份玉米自交系，主要是一些EX-PVP材料，或者是一些重要的公共自交系。這些自交系單行種植、自交授粉后，在成熟期收獲，自然晾曬后保存種子用于表型鑒定。

每個(gè)自交系選15粒種子，置于100 mL三角瓶中，加入適量10%的H2O2淹沒(méi)種子，不停地?fù)u晃三角瓶，使種子充分消毒。10 min后將瓶中H2O2倒掉，用大量清水沖洗干凈。種子消毒后在28℃的暗環(huán)境中培養(yǎng)兩天以促進(jìn)種子萌發(fā)，種子萌發(fā)后將其置于發(fā)芽紙上列成一排，卷起后豎著放置于裝有適量水的塑料盒中，放置于人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)。光照周期為白天12 h，溫度28℃/20℃，相對(duì)濕度75%。待幼苗長(zhǎng)至二葉期，去除胚乳，轉(zhuǎn)移至霍格蘭全營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至三葉期，隨后設(shè)置對(duì)照組和處理組，對(duì)照組持續(xù)用霍格蘭全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，處理組用200 mmol/L的氯化鈉溶液處理，處理11 d后對(duì)兩組幼苗的株高、枯萎度、鮮重和干重的表型進(jìn)行鑒定，每個(gè)自交系測(cè)量4～6株。株高/干重/鮮重變化率=(對(duì)照–處理)/對(duì)照×100%?？菸潭确譃?個(gè)等級(jí)：I級(jí)，幼苗生長(zhǎng)正常，無(wú)明顯的鹽害癥狀；II級(jí)，幼苗生長(zhǎng)受到輕微抑制，種子尖端枯萎；III級(jí)，1～2片葉片呈黃色或褪綠；IV級(jí)，幼苗生長(zhǎng)被顯著抑制，只有心綠；V級(jí)，幼苗完全死亡[16]。

1.2 基因型鑒定

利用美國(guó)Illumina公司開(kāi)發(fā)的MaizeSNP50 BeadChip芯片[17]對(duì)所有家系的基因型進(jìn)行鑒定。該芯片包含56,110個(gè)SNP標(biāo)記，涵蓋19,350個(gè)玉米基因。利用plink1.5軟件[18]分析每個(gè)標(biāo)記的缺失率、雜合率和最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)。MAF≥0.05，缺失率和雜合率<20%的SNP標(biāo)記被保留，最終有34,342個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

1.3 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系和鄰接樹(shù)構(gòu)建

群體結(jié)構(gòu)是在Linux系統(tǒng)下利用Admixture1.3軟件[19]完成，設(shè)置亞群數(shù)量=2～10，計(jì)算交叉驗(yàn)證誤差(cross-validation error, CV error)，較好的值的選擇能夠產(chǎn)生較低的CV error。親緣關(guān)系系數(shù)是使用Tassel5.0軟件中Centered_IBS算法[20]計(jì)算得出。鄰接樹(shù)的構(gòu)建，首先是利用Tassel5.0軟件計(jì)算成對(duì)SNP標(biāo)記之間的狀態(tài)同源(identical by state, IBS)，隨后在Mega7.0軟件中使用極大似然法計(jì)算[21]。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel5.0軟件的混合線性模型(mixed linear model, MLM)[22]，同時(shí)控制群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，對(duì)兩個(gè)耐鹽性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。所用SNP標(biāo)記的MAF≥0.05，閾值設(shè)置為<1.0×10–4 [5,15]。其統(tǒng)計(jì)模型為：

y =β+α+υ+μ+e

其中，y為表型觀察值；β為標(biāo)記和群體結(jié)構(gòu)以外的未知固定效應(yīng)值；α為標(biāo)記的效應(yīng)值；υ為群體結(jié)構(gòu)的效應(yīng)值；μ為多基因遺傳背景的效應(yīng)值；e為殘差；為群體結(jié)構(gòu)的矩陣；、、分別為y與β、υ和μ相關(guān)的矩陣。

1.5 上位性互作分析

每個(gè)位點(diǎn)最顯著的SNP標(biāo)記被用于上位性互作分析。雙尾方差分析用于估計(jì)成對(duì)加性-加性的上位性互作[23,24]，閾值設(shè)置為<0.05。上位性互作效應(yīng)是通過(guò)比較包含所有單基因座效應(yīng)的完整模型的殘差與簡(jiǎn)化模型的雙位點(diǎn)相互作用效應(yīng)得出的。

1.6 候選基因預(yù)測(cè)及qRT-PCR驗(yàn)證

參考Li等[25]方法，在顯著位點(diǎn)前后50 kb窗口內(nèi)查找候選基因。隨后在MaizeGDB網(wǎng)站(https:// www.maizegdb.org)搜索玉米鹽脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)[26]，獲得這些基因鹽脅迫下的基因表達(dá)情況，結(jié)合基因的功能注釋，篩選候選基因。

LH196是一個(gè)來(lái)自美國(guó)的商業(yè)自交系，耐鹽性較好。對(duì)其進(jìn)行鹽處理，方法與關(guān)聯(lián)群體的處理方法一致，用200 mmol/L的氯化鈉溶液處理長(zhǎng)勢(shì)一致的二葉期LH196幼苗，取處理后0 h和12 h的葉片，用RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。利用2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的表達(dá)量。玉米基因作為內(nèi)參對(duì)照，文中所有基因引物序列詳見(jiàn)附表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫性狀的表型數(shù)據(jù)分析

150份玉米自交系的鹽脅迫表型數(shù)據(jù)來(lái)自文獻(xiàn)[16]。4個(gè)鹽脅迫相關(guān)表型中，枯萎度和株高變化率呈現(xiàn)出正態(tài)分布的趨勢(shì)，變異廣泛(附圖1，附表2)。其中，枯萎度被劃分為5個(gè)等級(jí)展現(xiàn)出豐富的變異，而鮮重和干重變化率呈現(xiàn)明顯的偏分離(附圖1，附表2)，不適合利用混合線性模型進(jìn)行分析。因此，后續(xù)分析中將鮮重和干重變化率去除。

2.2 群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系

為了探究150份玉米自交系之間的遺傳關(guān)系，利用Admixture 軟件的交叉驗(yàn)證程序(cross-valida-tion procedure)，結(jié)合34,342個(gè)SNP對(duì)這些自交系進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。每一個(gè)給定的值(假定的亞群的數(shù)量)計(jì)算出的交叉驗(yàn)證誤差見(jiàn)圖1A。=2時(shí)展現(xiàn)了最高的交叉驗(yàn)證誤差，雖然=7時(shí)的交叉驗(yàn)證誤差最低(0.88)，但將該關(guān)聯(lián)群體分成7個(gè)亞群并不符合當(dāng)前育種群體的實(shí)際情況。當(dāng)=3時(shí)，交叉驗(yàn)證誤差發(fā)生急劇的下降，下降0.066，而=4～6時(shí)，下降程度緩慢，平均下降0.011，結(jié)合一個(gè)被廣泛應(yīng)用到復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)解析中的關(guān)聯(lián)群體對(duì)群體結(jié)構(gòu)的劃分[25,27]，最終將這150份玉米自交系組成的關(guān)聯(lián)群體劃分為3個(gè)亞群(圖1B)，分別為硬桿群體(stiff stick, SS)、熱帶亞熱帶群體(tropical/sub-tropical, TST)和非硬桿群體(non-stiff stick, NSS)。=2時(shí)反應(yīng)了初始的亞群分化，將以B73為代表的SS群體分化出，=3時(shí)，緊跟SS群體又分化出新的亞群，即TST群體。第3個(gè)亞群為NSS群體，包括SS群體之外的多數(shù)溫帶材料。綜上所述，這個(gè)玉米關(guān)聯(lián)群體被劃分成3個(gè)亞群，其中SS群體包含46個(gè)自交系，NSS群體包含47個(gè)自交系，TST群體包含29個(gè)自交系。除此之外，還有28個(gè)自交系被劃分成混合群體(Mixed亞群)，因?yàn)檫@些自交系每個(gè)亞群的概率值都低于0.6 (附表3)。

鄰接進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建也展示了與群體結(jié)構(gòu)相似的結(jié)果，只存在微小的差異(圖2A)。進(jìn)化樹(shù)分成了3個(gè)分支，分別是SS、NSS和TST亞群，而28個(gè)來(lái)自Mixed亞群的自交系分布在整個(gè)進(jìn)化樹(shù)中。最小的分支包含36個(gè)自交系，包括全部29個(gè)TST亞群的自交系，1個(gè)NSS亞群的自交系和6個(gè)Mixed亞群的自交系。第二個(gè)分支包含45個(gè)自交系，包括39個(gè)NSS亞群的自交系和6個(gè)Mixed亞群的自交系。最大的分支由69個(gè)自交系組成，包括SS亞群的全部46個(gè)自交系，7個(gè)NSS亞群的自交系和16個(gè)Mixed亞群的自交系。

同樣，主成分分析(principal component analysis, PCA)可以明顯的將150份玉米自交系分成SS、NSS和TST三個(gè)亞群，而混合的亞群分布在三者中間(圖2B)，前兩個(gè)主成分能夠清晰的區(qū)分這幾個(gè)亞群。其中，第一個(gè)主成分能夠解釋21.69%的遺傳變異，反映了SS和NSS或TST群體的分化；第二個(gè)主成分可以解釋3.89%的遺傳變異，反應(yīng)了NSS和TST的分化。

圖1 150份玉米自交系的群體結(jié)構(gòu)分析

圖2 150個(gè)玉米自交系的進(jìn)化分析

除此之外，從親緣關(guān)系的結(jié)果(表1)可以看出，28.13%的親緣關(guān)系系數(shù)小于0.1，表明這些家系之間幾乎沒(méi)有親緣關(guān)系。54.47%的親緣關(guān)系系數(shù)分布于0～0.2之間，表明大部分家系之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。30.63%的親緣關(guān)系系數(shù)分布在0.2～0.4，展現(xiàn)了較弱的親緣關(guān)系。另外，還有13.39%的親緣關(guān)系系數(shù)分布在0.4～1.0之間，表明了小部分的自交系之間親緣關(guān)系較近。剩余1.5%的親緣關(guān)系系數(shù)大于1，表明極少數(shù)個(gè)體間相似性較高?？偟膩?lái)說(shuō)，150份自交系之間，極少數(shù)個(gè)體之間展現(xiàn)了較高的相似性，大部分個(gè)體間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)甚至沒(méi)有。

2.3 混合線性模型分析

利用混合線性模型(MLM)對(duì)150份玉米自交系的兩個(gè)鹽脅迫性狀(枯萎度和株高變化率)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖3：A，B)。枯萎度性狀只檢測(cè)到1個(gè)顯著的位點(diǎn)，位于9號(hào)染色體上。株高變化率檢測(cè)到8個(gè)顯著的SNP，分別位于1、2、3和6號(hào)染色體上。根據(jù)這些顯著SNP間的連鎖不平衡程度將位于相同LD區(qū)域的SNP合并，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)性狀分別鑒定到1個(gè)和5個(gè)顯著的獨(dú)立位點(diǎn)。將這些獨(dú)立的顯著位點(diǎn)作為協(xié)變量進(jìn)行條件分析時(shí)，枯萎度性狀檢測(cè)到兩個(gè)新的位點(diǎn)，均位于4號(hào)染色體上(圖3：C，D)。綜上所述，枯萎度性狀共檢測(cè)到3個(gè)顯著的獨(dú)立位點(diǎn)，株高變化率檢測(cè)到5個(gè)顯著的獨(dú)立位點(diǎn)。利用一般線性模型估算這些位點(diǎn)解釋的表型變異，發(fā)現(xiàn)與枯萎度關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)可以解釋25.69%的表型變異，與株高變化率關(guān)聯(lián)的5個(gè)位點(diǎn)可以解釋34.92%的表型變異。除此之外，還對(duì)兩個(gè)性狀的顯著位點(diǎn)進(jìn)行上位性互作分析，發(fā)現(xiàn)在株高變化率這一性狀中，鑒定到4對(duì)上位性互作，包括SYNGENTA5755與SYN1142、PHM13742.5和PZE-106065133之間互作，以及SYN1142與PHM13742.5之間互作，這些互作共可以解釋5.24%的表型變異。因此，綜合加性效應(yīng)和上位性效應(yīng)，株高變化率性狀中，5個(gè)顯著性位點(diǎn)共可解釋40.16%的表型變異(表2)。

表1 親緣關(guān)系系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

圖3 基于混合線性模型兩個(gè)鹽脅迫性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4 候選基因分析

結(jié)合鹽脅迫下基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)和功能注釋，在8個(gè)顯著位點(diǎn)下鑒定到11個(gè)候選基因(表3，附表4)，對(duì)這些基因進(jìn)行GO富集分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因編碼酶或編碼具有酶活性的蛋白：編碼CASP-like蛋白，具有脫氫酶活性；編碼包含泛素類結(jié)構(gòu)域的蛋白(Ubiquitin-like domain-containing protein)，具有ATP酶活性以及與分子伴侶結(jié)合的能力；編碼5?脫氧核苷酸酶(5?-deoxynucleotidase)；編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)移到絲氨酸或蘇氨酸殘基。兩個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄因子活性，其中，編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(Calmodulin-binding protein 60G)，具有結(jié)合DNA的轉(zhuǎn)錄因子活性；編碼MYB類型的轉(zhuǎn)錄因子(MYB family transcrip-tion factor)，可以與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)。一個(gè)基因編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)，可以轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)離子、單糖、聚糖等多種物質(zhì)。除此之外，還有4個(gè)基因編碼蛋白，包括編碼一個(gè)有缺陷的類泛素化蛋白(defective in cullin neddylation protein, DCN1-like protein 4)，能夠與泛素類蛋白結(jié)合酶結(jié)合；編碼一個(gè)包含DUF1336結(jié)構(gòu)域的蛋白，能夠增強(qiáng)疾病抗性，具有防御或免疫功能，另外有兩個(gè)基因和編碼未知功能的蛋白。

表2上位性互作分析結(jié)果

表3 兩個(gè)玉米耐鹽性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖4 鹽脅迫候選基因的GO富集分析

2.5 鹽脅迫下候選基因的表達(dá)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證這些候選基因是否對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)，利用qRT-PCR驗(yàn)證候選基因在鹽脅迫0 h和12 h的玉米葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示7個(gè)候選基因鹽脅迫下表現(xiàn)出表達(dá)差異，其中3個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著的差異(圖5，<0.05)，4個(gè)基因的表達(dá)量呈現(xiàn)極顯著的差異(<0.01)，而且這7個(gè)基因在鹽脅迫下表達(dá)量均顯著上調(diào)。其中，表達(dá)差異最大的是基因，鹽脅迫12 h后其表達(dá)量升高了將近2倍(=0.0079)。該基因編碼MYB類型的轉(zhuǎn)錄因子，可能在玉米抵抗鹽脅迫中扮演重要角色。

3 討論

本研究基于一個(gè)包含150份自交系的玉米關(guān)聯(lián)群體，結(jié)合34,342個(gè)SNP標(biāo)記，利用混合線性模型的方法，對(duì)兩個(gè)鹽脅迫相關(guān)表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定到8個(gè)顯著的獨(dú)立位點(diǎn)，同時(shí)篩選到11個(gè)候選基因。此外，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了7個(gè)候選基因在鹽脅迫下差異表達(dá)，推測(cè)這些基因可能在玉米抵御鹽脅迫中發(fā)揮作用。

圖5 鹽脅迫下候選基因的表達(dá)驗(yàn)證

3.1 一般線性模型與混合線性模型的結(jié)果比較

關(guān)聯(lián)分析是剖析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的重要手段，能夠充分利用歷史重組事件，極大提高定位精度[28]。一般線性模型和混合線性模型是關(guān)聯(lián)分析常用的兩個(gè)統(tǒng)計(jì)模型，因?yàn)殛P(guān)聯(lián)分析容易受到群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的影響[22,27]，而混合線性模型同時(shí)控制群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，能夠更好的控制假陽(yáng)性的現(xiàn)象，因此，應(yīng)用更加廣泛。

Xie等[16]基于同一個(gè)關(guān)聯(lián)群體，利用一般線性模型對(duì)4個(gè)耐鹽性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定到7個(gè)位點(diǎn)與鹽脅迫性狀顯著關(guān)聯(lián)，這些位點(diǎn)分布在1、3及6號(hào)染色體上，其中4個(gè)位點(diǎn)與本研究的結(jié)果共定位。而基于混合線性模型的關(guān)聯(lián)分析鑒定到4個(gè)新的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分布在2、4和9號(hào)染色體上(表4)?；谶@4個(gè)新的位點(diǎn)篩選到5個(gè)候選基因，其中3個(gè)基因在受到鹽脅迫后均顯著上調(diào)。這些基因的鑒定，為玉米響應(yīng)鹽脅迫機(jī)理的解析和耐鹽種質(zhì)的培育奠定基礎(chǔ)。

3.2 玉米耐鹽候選基因分析

基因在表達(dá)水平上調(diào)控很多重要的生物學(xué)過(guò)程，轉(zhuǎn)錄因子在這一過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[29,30]，因此它們有望成為改良作物復(fù)雜數(shù)量性狀的優(yōu)良候選基因。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族龐大，功能多樣，普遍存在于真核生物中[31]。許多MYB基因已被證明參與植物的脅迫響應(yīng)，例如鹽脅迫和干旱脅迫。在擬南芥中異位過(guò)表達(dá)小麥的基因可以顯著增強(qiáng)對(duì)干旱和鹽的脅迫[32]，進(jìn)一步研究表明，該基因能夠促進(jìn)滲透壓平衡重建和活性氧(ROS)清除能力。過(guò)表達(dá)小麥的另一個(gè)MYB基因——也能顯著提高擬南芥的耐鹽性[33]。同樣，玉米和基因?qū)}脅迫有響應(yīng)[34,35]。除了作物外，在多個(gè)木本植物中也有關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子耐鹽脅迫的報(bào)道[36,37]。因此，MYB轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫響應(yīng)中具有重要作用。本研究鑒定到一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，qRT-PCR結(jié)果表明該基因在鹽脅迫時(shí)具有最大程度的表達(dá)上調(diào)響應(yīng)，該基因還未被克隆，很可能在玉米鹽脅迫響應(yīng)中行使功能，是耐鹽種質(zhì)改良的重要候選基因。除此之外，還有6個(gè)候選基因在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)不同程度地上調(diào)表達(dá)，可能以直接或間接的方式參與玉米的鹽脅迫響應(yīng)。

3.3 與其他鹽脅迫關(guān)聯(lián)分析的比較

玉米中一個(gè)應(yīng)用及其廣泛的關(guān)聯(lián)群體，包含508份自交系，已在玉米農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀[38]、籽粒油份含量[25]、抗病[39]、玉米苗期抗旱[40,41]和鹽脅迫相關(guān)性狀[5,14,15,42]中被成功應(yīng)用，顯示了關(guān)聯(lián)分析在解析復(fù)雜數(shù)量性狀、挖掘相關(guān)基因上的優(yōu)勢(shì)。在利用該關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行鹽脅迫相關(guān)性狀的研究中，采用了3種不同的表型收集方式，分別為鹽處理后莖葉中NA+/K+的含量[14,15]、存活率[5]和株高、根長(zhǎng)、干重、鮮重等性狀[42]，鑒定了多個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，并克隆了幾個(gè)調(diào)控鹽脅迫響應(yīng)的基因，如、、和等。這些研究都用了超過(guò)100萬(wàn)個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，覆蓋了基因組中絕大多數(shù)的基因，對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)基因進(jìn)行挖掘，分別鑒定到67～149個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)，其中，解釋的表型變異(explained phenotypic variation, PVE)超過(guò)15%的主效位點(diǎn)數(shù)極少，平均PVE低于10%，暗示了鹽脅迫性狀復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)。此外，有關(guān)鹽脅迫相關(guān)研究中所鑒定到的候選基因均不相同，表明不同性狀的遺傳結(jié)構(gòu)可能差異較大。本研究所用的關(guān)聯(lián)群體包含150份自交系，所用標(biāo)記數(shù)為34,342個(gè)，采用的統(tǒng)計(jì)方法與文獻(xiàn)[5,14,15,42]中相同(都為MLM)。盡管在群體大小和標(biāo)記數(shù)量上有差異，但本研究也定位到8個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)，平均可以解釋14.13%的表型變異，這可能與群體的背景差異有關(guān)。同時(shí)，篩選并初步驗(yàn)證了7個(gè)新的基因在鹽脅迫時(shí)會(huì)上調(diào)表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫相關(guān)性狀遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，并為耐鹽種質(zhì)的選育提供新的靶基因。

表4 兩種關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計(jì)模型結(jié)果的比較

附錄：

附加材料詳見(jiàn)文章電子版www.chinagene.cn。

附表1 qRT-PCR引物序列

附表2 150份自交系的分群情況總結(jié)

附表3 鹽脅迫相關(guān)性狀的表型結(jié)果

續(xù)附表3

續(xù)附表3

續(xù)附表3

附表4 顯著SNP位點(diǎn)前后50k區(qū)間內(nèi)的所有基因信息

附圖1 關(guān)聯(lián)群體鹽脅迫相關(guān)性狀的表型分布

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Genome-wide association study and candidate gene prediction of salt tolerance related traits in maize

Tingyu Shan, Wen Shi, Yiting Wang, Ziyi Cao, Baohua Wang, Hui Fang

Salt stress is an important factor that affects maize yield. In order to explore the genetic basis of salt tolerance in maize, a genome-wide association study (GWAS) using the mixed liner model was conducted on 150 maize inbred lines with rich genetic background and 34,342 polymorphism SNP markers. A total of 8 independent loci were identified that significantly associated with salt-tolerance traits, among which 3 loci were significantly associated with withering degree on chromosomes 4 and 9; and the remaining 5 loci were significantly associated with plant height change rate on chromosomes 1, 2, 3 and 6. Eleven candidate genes were identified according to the gene expression data under salt stress; and functional annotations verified 7 of them to be significantly up-regulated under salt stress by qRT-PCR. These findings lay a foundation for understanding the mechanism(s) of maize salt tolerance and provide new target genes for the breeding of maize salt tolerance germplasm.

maize; salt tolerance; mixed liner model; genome-wide association study

2021-08-13;

2021-10-02

南通市科技項(xiàng)目(編號(hào)：MS22020033)和南通大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目(編號(hào)：135420609055)資助[Supported by the Science and Technology Project of Nantong City, China (No. MS22020033)] and Talent Introduction Project of Nantong University (No. 135420609055)]

單婷玉，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：玉米鹽脅迫響應(yīng)研究。E-mail: shan_0822@126.com

方輝，博士，講師，研究方向：植物復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳解析。E-mail: fanghui8912@126.com

10.16288/j.yczz.21-298

2021/12/08 5:07:32

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20211207.1156.002.html

(責(zé)任編委: 宋任濤)