劉 君，李玲珊，趙文鵬，袁思棋，2

(1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644004；2.江南大學(xué)-瀘州老窖集團(tuán)有限責(zé)任公司博士后科研工作站，四川瀘州 646000)

目前，中國市場(chǎng)上知名白酒和高品質(zhì)白酒都是采用傳統(tǒng)大曲法釀造。大曲當(dāng)中包含各種各樣的微生物，例如霉菌、酵母、細(xì)菌等，它是一種多細(xì)菌混合的（酶）制劑，不同的發(fā)酵環(huán)境可以使不同的菌株成為優(yōu)勢(shì)菌[1]，從而改變酒體成分，造成其香味差別。白酒中目前已發(fā)現(xiàn)的四大主要酯類是乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯[2-3]。

產(chǎn)酯酵母主要屬于產(chǎn)膜酵母或假絲酵母，其中大多數(shù)為異形漢遜酵母，少數(shù)為小圓形酵母，能產(chǎn)生以酯香為主體的香味物質(zhì)。產(chǎn)酯酵母不是微生物學(xué)上的分類名稱，它是一類能夠代謝產(chǎn)生酯類物質(zhì)的酵母菌總稱。其所產(chǎn)生的酯隨菌種、培養(yǎng)條件及生產(chǎn)工藝的不同而存在差異[4]。在生產(chǎn)白酒時(shí)，可以利用產(chǎn)酯酵母提高酒的主體香物質(zhì)含量，同時(shí)亦可對(duì)乙酸甲酯、辛酸乙酯等次要香味物質(zhì)的產(chǎn)量產(chǎn)生影響。本文先從某知名酒廠大曲中篩選目標(biāo)酵母，以其為菌種進(jìn)行發(fā)酵，然后通過對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中酯的含量進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而篩選出1 株產(chǎn)酯最高的酵母進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酯條件優(yōu)化，最后根據(jù)響應(yīng)面得出最優(yōu)發(fā)酵條件，旨在為中國白酒傳統(tǒng)釀造工藝菌種庫保存1株中高溫大曲高產(chǎn)酯酵母。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：川南某三家知名濃香型酒廠大曲。

試劑及耗材：冰乙酸、95%乙醇（分析純）、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、可溶性淀粉、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、氯化鈣。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁70 mL，蒸餾水1000 mL，氯霉素0.1 g，pH值調(diào)至7。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：麥芽汁70 mL，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL，氯霉素0.1 g，pH值調(diào)至7。

儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱、數(shù)顯酸度計(jì)、立式自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋、培養(yǎng)皿、酒精燈、移液槍、酒精棉、接種環(huán)、高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、酸式滴定管、鐵架臺(tái)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒曲中酵母的分離與純化

酒曲的富集培養(yǎng)：選取外形完整、顏色正常、質(zhì)地均勻的大曲，研碎成粉末后稱取5 g 樣品加入到20 mL 麥芽汁培養(yǎng)基中，然后在溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

平板分離：將富集培養(yǎng)物稀釋成10-1～10-7的梯度懸液。每個(gè)稀釋濃度分別吸取稀釋液0.1 mL分別涂布到3 個(gè)麥芽汁固體平板中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

酵母菌的篩選與純化：選擇平板上生長(zhǎng)良好的酵母菌接種于麥芽汁固體培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，再次選取形態(tài)不同的單菌落劃線接種并傳代2 次，經(jīng)鏡檢確定為單菌落后，選取長(zhǎng)勢(shì)較好菌種，接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，在溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min 下培養(yǎng)24 h，吸取1 mL 菌液混合1 mL 無菌甘油于-20 ℃保藏。

1.2.2 酵母菌的鑒定

酵母菌的菌落特征：菌落奶油狀，乳白色，黏稠，邊緣平滑，表面平坦，反光，細(xì)胞橢圓形。挑取菌落制片：在載玻片上滴上一滴水然后挑取少量菌混合均勻并干燥固定，并用孔雀綠染色10 min，再用95%乙醇脫色20 s后用水沖洗干凈，再用品紅復(fù)染5 min并水洗干燥鏡檢[5-6]。

1.2.3 膜發(fā)酵篩選實(shí)驗(yàn)

配制麥芽汁培養(yǎng)基500 mL 并加入葡萄糖5 g、蛋白胨2.5 g、氯化鈣0.25 g、乙醇2.5 mL、乙酸0.5 mL得到發(fā)酵用培養(yǎng)基，并分裝為50 mL每瓶滅菌待用。將上一步得到的不同類型的菌液分別吸取1.5 mL加入到冷卻后的50 mL 麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min下發(fā)酵3 d。

1.2.4 酯含量的測(cè)定

總酯的測(cè)定：取發(fā)酵液35.0 mL，用0.1 mol/L的NaOH 標(biāo)液中和。加0.1 mol/L 的NaOH 標(biāo)液25.0 mL 進(jìn)行皂化，加蓋置于暗處反應(yīng)24 h，然后用0.1 mol/L 的H2SO4溶液滴定，記錄消耗的硫酸體積。另外使用空白三角瓶的樣液作為對(duì)照[7-9]?？傰ビ?jì)算公式如下：

X=(C1×25-Y×C2×2)×0.088×1000/35

式中：X——總酯含量，g/L；

C1——?dú)溲趸c濃度，mol/L；

C2——硫酸濃度，mol/L；

Y——H2SO4滴定消耗體積，mL。

1.2.5 產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)

分別以碳源種類（可溶性淀粉、半乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖）10 g/L，氮源種類（酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨）5 g/L，無機(jī)鹽種類（硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、氯化鈣）0.5 g/L，乙酸添加量（0%、0.5%、1%、1.5%、2%），乙醇添加量（3 %、4 %、5 %、6 %、7 %），發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、轉(zhuǎn)速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、200 r/min）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、接種量（1 %、2 %、3 %、4 %、5 %）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，由于試驗(yàn)設(shè)備的精度以及試驗(yàn)人員自身因素的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過SPSS 對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，以碳源、氮源、無機(jī)鹽3 個(gè)影響最大的因素為試驗(yàn)因素，因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化因素與水平

1.2.6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

配制麥芽汁培養(yǎng)基，先加入乙酸0.5 %、乙醇5 %、接種菌液3 %，并分別按照可溶性淀粉添加量5 g/L、10 g/L、15 g/L，蛋白胨添加量1 g/L、3 g/L、5 g/L、磷酸二氫鉀添加量0.1 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L在溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 下發(fā)酵3 d，取菌液40 mL 于50 mL EP 管中，在8000 r/min 的條件下離心3 min 后取上清液35 mL 于100 mL 三角燒瓶中，并加入25 mL 的0.1 mol/L 氫氧化鈉在暗處反應(yīng)24 h，然后用0.05 mol/L 的硫酸進(jìn)行滴定直到pH7 左右，記錄消耗的硫酸體積并根據(jù)公式計(jì)算得出發(fā)酵液酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 碳源種類對(duì)產(chǎn)酯量的影響

篩選菌株不同碳源產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可溶性淀粉對(duì)產(chǎn)酯量的影響最大，葡萄糖次之，半乳糖的影響最小，各種類碳源對(duì)產(chǎn)酯量的影響情況見圖1。

圖1 碳源種類對(duì)產(chǎn)酯量的影響

對(duì)碳源種類中可溶性淀粉濃度進(jìn)行優(yōu)化之后，產(chǎn)酯量出現(xiàn)先增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，可溶性淀粉添加濃度為10 g/L 時(shí)酯含量最高，其他優(yōu)化濃度對(duì)酯含量影響見圖2。

圖2 可溶性淀粉添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.2 氮源種類對(duì)產(chǎn)酯量的影響

所篩菌株不同氮源產(chǎn)酯量檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白胨對(duì)產(chǎn)酯量的影響最大，硝酸鈉次之，硫酸銨影響最小，圖3 是實(shí)驗(yàn)選定氮源對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)酯量影響詳細(xì)情況。

圖3 氮源種類對(duì)產(chǎn)酯量的影響

蛋白胨添加量在3 g/L 時(shí)酯含量最高。整體呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定之后有一些下降趨勢(shì)可能是由于有些酯類物質(zhì)揮發(fā)所致。具體參見圖4。

圖4 蛋白胨對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.3 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酯量的影響

無機(jī)鹽對(duì)所篩選菌株產(chǎn)酯量的影響不大，除磷酸二氫鉀和硫酸鋅相對(duì)其他無機(jī)鹽有一定影響外，其他無機(jī)鹽的產(chǎn)酯量均達(dá)到2.0 g/L（圖5）。

磷酸二氫鉀添加量在0.5 g/L時(shí)酯含量最高，但整體相差不大。具體參見磷酸二氫鉀對(duì)產(chǎn)酯量的影響見圖6。

圖6 磷酸二氫鉀對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.4 乙酸添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

隨著乙酸添加量的增加，所篩產(chǎn)酯酵母菌株產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先上升后基本趨于平穩(wěn)，當(dāng)乙酸添加量為0.5 %時(shí)產(chǎn)酯量達(dá)到最高，穩(wěn)定之后有些許下降的趨勢(shì)可能是部分酯類消耗揮發(fā)所致見圖7。

圖7 乙酸添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.5 乙醇添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

乙醇添加量為5%時(shí)產(chǎn)酯量到達(dá)峰值，分析原因應(yīng)是隨著發(fā)酵的深入，發(fā)酵本身就會(huì)產(chǎn)生乙醇，過量的乙醇對(duì)產(chǎn)酯酵母的產(chǎn)酯性能有了一定的抑制作用，乙酸乙酯的生成受阻，乙醇添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響詳見圖8。

圖8 乙醇添加量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酯量的影響

隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)產(chǎn)酯量達(dá)到最高。原因應(yīng)是當(dāng)溫度過低或過高時(shí)，酵母菌胞內(nèi)酶活力均會(huì)降低，酯化能力較弱，酯的累積量自然降低不少，不利于產(chǎn)酯，且溫度的升高會(huì)加速酯類物質(zhì)的水解及揮發(fā)，發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酯量的具體影響情況見圖9。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酯量的影響及誤差線使用

2.1.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯量的影響

發(fā)酵時(shí)間為3 d 時(shí)產(chǎn)酯量可到達(dá)高峰值，隨著發(fā)酵時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，產(chǎn)酯量呈逐漸下降的趨勢(shì)，可能原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)累積產(chǎn)生的酯開始揮發(fā)，具體影響見圖10。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酯量的影響

隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的不斷增加，產(chǎn)酯量呈現(xiàn)先升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)產(chǎn)酯量達(dá)到最高。搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酯量的影響情況見圖11。

圖11 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.1.9 接種量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

當(dāng)接種量在2%時(shí)酯含量即能達(dá)到3.0 g/mL以上，再增加菌株接種量其產(chǎn)酯量的變化不再明顯見圖12。

圖12 接種量對(duì)產(chǎn)酯量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，并獲得酯含量（Y）對(duì)可溶性淀粉濃度、蛋白胨濃度、磷酸二氫鉀濃度的二次多項(xiàng)回歸方程：酯含量=3.55-0.11 A-1.250E-004 B-6.375E-003 C-0.050 A B+0.012 A C+0.000 B C-0.41 A2-0.37 B2-0.64 C2利用自變量同編碼變量的變換公式（Xi=(xi-x0)/Δ，Δ 為自變量步長(zhǎng)，Xi 為自變量編碼值，xi 為自變量實(shí)際值，x0 為自變量在中心處實(shí)際值）將全變量編碼水平的二次回歸方程轉(zhuǎn)換為全變量非編碼水平的二次回歸方程：酯含量=-0.25985+0.31897A+0.610298B+9.40662C-5.02500E-003AB+0.012250AC+1.38778E +0.016BC-0.016446A2-0.093350B2-15.93500C2

表2 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的酯含量記錄表

進(jìn)一步對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3 可知，該模型極顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.2115＞0.05（不顯著），說明該回歸模型可靠，可用于該三因素的優(yōu)化。

表3 方差分析結(jié)果

可溶性淀粉濃度與磷酸二氫鉀濃度的3D 響應(yīng)面模型可以看出模型圖幾乎成橢圓形，說明可溶性淀粉與磷酸二氫鉀對(duì)酯含量均有很好的影響力，且圖像坡度較陡，表明兩者對(duì)酵母產(chǎn)酯的交互作用影響較大。橢圓中心點(diǎn)基本落于中心位點(diǎn)，說明可溶性淀粉濃度與磷酸二氫鉀濃度對(duì)酵母產(chǎn)酯的影響效應(yīng)基本相同。蛋白胨濃度與磷酸二氫鉀濃度的3D 響應(yīng)面模型可以看出模型圖幾乎成橢圓形，說明蛋白胨與磷酸二氫鉀對(duì)酯含量影響力較好，且圖像坡度較陡，表明兩者對(duì)酵母產(chǎn)酯的交互作用影響較大。橢圓中心點(diǎn)基本落于中心位點(diǎn)，說明蛋白胨濃度與磷酸二氫鉀濃度對(duì)酵母產(chǎn)酯的影響效應(yīng)基本相同?？扇苄缘矸蹪舛扰c蛋白胨濃度的3D 響應(yīng)面模型可以看出模型圖偏向于圓形，說明可溶性淀粉與蛋白胨對(duì)酯含量的影響效應(yīng)不顯著，圖像坡度不明顯，這表明兩者對(duì)酵母產(chǎn)酯的交互作用并無十分顯著影響，坡度整體偏向于可溶性淀粉，可以判斷出可溶性淀粉濃度變化對(duì)酵母產(chǎn)酯的影響大于蛋白胨濃度對(duì)酵母產(chǎn)酯的影響。

圖13 可溶性淀粉濃度、蛋白胨濃度、磷酸二氫鉀濃度三因素交互作用對(duì)產(chǎn)酯量的影響

表4 響應(yīng)面模擬最佳發(fā)酵條件表

據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化給出最優(yōu)模擬條件為：可溶性淀粉添加量9.35 g/L、蛋白胨添加量3.02 g/L、磷酸二氫鉀添加量0.30 g/L時(shí)估計(jì)可獲得最大酯含量為3.56 g/L。

3 結(jié)論

以川南知名酒廠大曲中酵母為試驗(yàn)對(duì)象，分別檢測(cè)了碳源、氮源、無機(jī)鹽、乙酸、乙酸、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量等因素對(duì)其發(fā)酵代謝性能的影響，采取單菌株單因素與響應(yīng)面相結(jié)合發(fā)酵試驗(yàn)方案，優(yōu)化其代謝產(chǎn)酯條件，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵的影響最為顯著。進(jìn)一步對(duì)碳源、氮源、無機(jī)鹽中影響最為顯著的物質(zhì)再次進(jìn)行梯度優(yōu)化并進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果顯示，當(dāng)可溶性淀粉添加量為9.35 g/L、蛋白胨添加量為3.02 g/L、磷酸二氫鉀添加量為0.3 g/L時(shí)，該篩選分離所得菌株具備最大產(chǎn)酯能力為3.56 g/L。