胡俊 楊盼盼 袁忠 談榮珍 張楚焌 張斌 沈云峰

1.南昌市洪都中醫(yī)院骨傷七科，江西 南昌 330008 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，江西 南昌 330006

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)為絕經(jīng)后婦女常見的代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為主要特征，因此嚴(yán)重影響患者的健康及生活治療[1]。據(jù)我國最新的流行病學(xué)調(diào)查，在50歲以上的人群中有19.2 %的人患有骨質(zhì)疏松癥，而在65歲以上的人群中，此患病率更是高達(dá)32.0 %[2]。作為抗骨質(zhì)疏松常用手段，雙膦酸鹽類藥物常伴隨不良反應(yīng)，如增加患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)或下頜壞死等[3-4]。因此，尋找更加安全可靠的治療藥物吸引了越來越多的學(xué)者關(guān)注，而中藥因其簡、便、驗(yàn)、廉的特性，在世界上受到越來越多的關(guān)注[5]，其優(yōu)異療效也被越來越多的研究所證實(shí)[6]。

黃芪中主要含有皂苷、黃酮、多糖類等活性成分，除優(yōu)異的抗動(dòng)脈硬化、抗細(xì)胞衰老作用之外，其提高性激素水平、調(diào)控骨代謝的作用也被逐漸被人們熟知[7]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪水提液可有效促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的骨形成，同時(shí)抑制骨量丟失[8]。而現(xiàn)階段，關(guān)于黃芪多糖(astragalus polysaccharides，AP)對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的潛在作用機(jī)制尚無深入的認(rèn)識(shí)。因此本研究將分析探討不同濃度AP對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖及成骨分化的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1成骨細(xì)胞：MC3T3-E1細(xì)胞購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫，第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2材料與試劑 ：黃芪多糖(純度>98 %)從成都德思特生物技術(shù)有限公司購買；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、0.25 %胰蛋白酶從美國Gibco公司購買；β甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、MTT試劑盒購買于美國Sigma公司；RIPA裂解液、ALP染色試劑盒、免疫熒光染色試劑盒、ECL曝光液從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購買；茜素紅染色液從經(jīng)賽業(yè)生物科技有限公司購買；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于日本Takara公司；Runx2、β-catenin、Osteocalcin抗體購自Santa Cruz 公司；β-actin、鼠二抗、兔二抗購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀購自美國Bio-Rad 公司；倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將含有10 %胎牛血清、1 %青鏈霉素的α-MEM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制后，用于后續(xù)的MC3T3-E1細(xì)胞系培養(yǎng)。細(xì)胞板均放置于37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。在細(xì)胞生長、融合至80 %～90 %時(shí)，使用胰蛋白酶消化及分瓶，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖：以每孔2 000個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱中生長24 h后，加入不同濃度的AP(0、5、10 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。使用MTT法在干預(yù)后的1、3、5、7 d檢測細(xì)胞活力。在每培養(yǎng)孔加入10 μL MTT試劑后，放置培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，然后在酶標(biāo)儀(570 nm波長)處測定每孔的吸光值。

1.2.3ALP及茜素紅染色：10-8mol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油磷酸鈉和50 μmol/L 抗壞血酸配制成成骨誘導(dǎo)液。MC3T3-E1細(xì)胞以5×104/孔的密度水平鋪板于24孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)液中。細(xì)胞按不同濃度的AP(0、5、10 μmol/L)干預(yù)而分組，每3天換液1次，14 d后進(jìn)行ALP及茜素紅染色。ALP染色過程如下：棄置培養(yǎng)基后，細(xì)胞在裂解液作用下裂解，后續(xù)染色流程根據(jù)ALP試劑盒說明書實(shí)施。茜素紅染色過程如下：棄置舊培養(yǎng)液后，細(xì)胞經(jīng)PBS反復(fù)清洗3次，然后加入4 %多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后PBS沖洗固定液3遍后，取300 μL茜素紅染液于每孔細(xì)胞，室溫下靜置10 min后PBS沖洗染液3次，最后使用顯微鏡觀察每組染色情況。

1.2.4Real-time PCR檢測相關(guān)mRNA：以1×108/孔的密度種植于6孔板中，干預(yù)措施同1.2.3。細(xì)胞干預(yù)14 d后，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書實(shí)施細(xì)胞總RNA提取，使用無RNA酶水溶解后測定濃度。擴(kuò)增cDNA反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，一共40個(gè)循環(huán)。然后從PCR儀中獲取Ct值采用2-△△Ct 法，以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、骨鈣素(osteocalcin)、I型膠原蛋白(collagen I)的mRNA表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5Western Blot檢測相關(guān)蛋白：以2×105/孔的密度種植于6孔板中，分組、干預(yù)方式同上，14 d后使用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，配置好10 %SDS-PAGE分離膠與5 %濃縮膠后，每組取20 μL樣本進(jìn)行后續(xù)的電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉步驟。Runx2(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、osteocalcin(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜；室溫下孵育二抗(1∶2 000)2 h，TBST洗滌后ECL曝光。條帶表達(dá)情況使用Image J 軟件分析。

1.2.6免疫熒光測定β-catenin熒光強(qiáng)度：MC3T3-E1細(xì)胞以2×104/片的密度鋪于爬片，接受AP干預(yù)作用14 d后，在室溫下使用4 %的多聚甲醛室溫固定MC3T3-E115 min，接著用0.1 % Triton X破膜20 min。使用血清封閉20 min后，每孔加入β-catenin一抗(1∶200)放置于4 ℃孵育過夜；第二天使用熒光二抗(1∶150)室溫孵育2 h，然后加入DAPI避光孵育2 min，在暗光條件下使用熒光顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同AP對(duì)MC3T3-E1增殖影響

MC3T3-E1細(xì)胞增殖隨著AP干預(yù)時(shí)間增加呈逐步上升趨勢，并與AP濃度呈正相關(guān)關(guān)系。與其他濃度比較，10 μmol/L AP在各時(shí)間點(diǎn)促細(xì)胞增殖效果更加明顯，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而干預(yù)1、5 d后5 μmol/L的AP促增殖效果與對(duì)照組對(duì)比的差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

注：與0 μmol/L組同期對(duì)比，#*P<0.05。圖1 不同濃度AP對(duì)MC3T3-E1增殖影響Fig.1 Effects of AP at different concentrations on the proliferation of MC3T3-E1

2.2 不同濃度AP的促成骨分化效果觀察

ALP染色結(jié)果顯示AP干預(yù)14 d后，細(xì)胞的ALP染色陽性率明顯高于對(duì)照組(0 μmol/L)，且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系，10 μmol/L AP的促成骨作用更佳。ARS染色結(jié)果與ALP染色結(jié)果相符合，10 μmol/L AP可有效提高染色陽性率。見圖2。

圖2 干預(yù)14 d后不同濃度AP的促成骨作用觀察Fig.2 Effects of AP at different concentrations on the osteogenic differentiation of MC3T3-E1

2.3 不同濃度AP對(duì)成骨相關(guān)mRNA表達(dá)影響

不同濃度AP干預(yù)14 d后，與對(duì)照組相比，5 μmol/L AP可有效提高Runx2、osteocalcin、collagen I mRNA的表達(dá)(P<0.05)；而10 μmol/L AP促進(jìn)上述mRNA表達(dá)效果更加明顯(P<0.01)，同時(shí)還可以促進(jìn)β-catenin mRNA表達(dá) (P<0.01)。見圖3。

圖3 干預(yù)14 d后不同濃度AP對(duì)成骨分化標(biāo)志物的調(diào)控作用觀察Fig.3 Effects of AP at different concentrations on osteogenic differentiation-related mRNA of MC3T3-E1 cells

2.4 不同濃度AP對(duì)成骨相關(guān)蛋白表達(dá)影響

結(jié)果顯示5 μmol/L AP的促進(jìn)β-catenin、Osteocalcin、Runx2蛋白表達(dá)作用與對(duì)照組比較，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而10 μmol/L AP則可促進(jìn)β-catenin(1.024±0.056)、osteocalcin(1.498±0.025)、Runx2(0.873±0.038)蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖4。

圖4 干預(yù)14 d后不同濃度AP對(duì)成骨分化相關(guān)蛋白的調(diào)控作用觀察Fig.4 Effects of AP at different concentrations on osteogenic differentiation-related proteins of MC3T3-E1 cells

2.5 10 μmol/L AP對(duì)β-catenin蛋白核移位的影響

與對(duì)照組(0 μmol/L AP)比較，10 μmol/L AP干預(yù)細(xì)胞14 d后，可有效促進(jìn)β-catenin蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)。見圖5。

圖5 10 μmol/L AP對(duì)β-catenin蛋白核移位的影響(100×)Fig.5 Effects of 10μM AP on the nuclear translocation of β-catenin protein(100×)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥可因年齡增長、藥物使用、體內(nèi)激素水平改變等因素而誘發(fā)，背后機(jī)制與骨形成與骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破有關(guān)[9-10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療可有效改善骨質(zhì)疏松引起的骨量丟失，其治療機(jī)制可能與上調(diào)骨形成、下調(diào)骨吸收過程有關(guān)[6,11]。Shen等[12]經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷可激活BMP2-Wnt/β-catenin信號(hào)通路，以及誘導(dǎo)TAZ表達(dá)以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，因此有抑制骨質(zhì)疏松小鼠骨量丟失的作用。Ornstrup等[13-14]通過給予患者口服白藜蘆醇治療16周后，發(fā)現(xiàn)治療組患者的腰椎骨密度、血ALP水平均明顯提高，其中機(jī)制與可能與上調(diào)了促骨形成的SIRT1蛋白有關(guān)。

黃芪雖為常用的補(bǔ)氣中藥，但其抗骨質(zhì)疏松作用也逐漸受到關(guān)注、應(yīng)用，并取得了令人滿意的療效[15]。成鵬等[16]發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松大鼠中，黃芪甲苷可明顯提高β-catenin以及Wnt2蛋白的表達(dá)量，并下調(diào)FoxO3a蛋白的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激引起的骨量丟失。黃芪注射液靜滴、中藥黃芪口服可有效提高患者骨密度、改善骨代謝[17-18]。高糖環(huán)境對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖以及成骨分化有負(fù)向調(diào)控作用，但AP逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境的不利影響[19]。

本研究結(jié)果表明，早期成骨標(biāo)志物(ALP、Runx2)[20]，以及鈣沉積標(biāo)志物(Collagen I)[21]均可被AP上調(diào)表達(dá)，并與AP濃度呈正相關(guān)關(guān)系，該部分結(jié)果與ALP、茜素紅染色結(jié)果一致，因此表明AP可以促進(jìn) MC3T3-E1的成骨分化和礦化。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也從蛋白表達(dá)層面驗(yàn)證了這一趨勢。此外，我們還發(fā)現(xiàn)AP明顯促進(jìn)了β-catenin蛋白的表達(dá)以及核易位。Wnt以及BMP均為調(diào)控細(xì)胞成骨分化的重要通路信號(hào)，前者可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨祖細(xì)胞分化[22]，而后者則可進(jìn)一步促進(jìn)祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[23]。而上述兩條成骨分化關(guān)鍵通路對(duì)β-catenin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以及其蛋白翻譯、核易位過程均有促進(jìn)作用，最終下游的促細(xì)胞增殖、成骨的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平因此明顯增高[24]。所以，我們認(rèn)為AP促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、成骨分化，可能與這些機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活可能為AP促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖以及成骨分化的作用機(jī)制之一，但是本研究目前僅停留在細(xì)胞水平，缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持，因此研究結(jié)果存在一定的局限性，后續(xù)將會(huì)完善體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。