肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的人類惡性腫瘤細(xì)胞之一，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管最近對肝癌的分子基礎(chǔ)和新的化療方法的認(rèn)識有了進(jìn)展，但是僅略微降低了死亡率

。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一類長度超過200 nt，沒有或有蛋白質(zhì)編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本。LncRNA通過在不同水平上調(diào)控基因表達(dá)來發(fā)揮作用，包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄（或轉(zhuǎn)錄后）和翻譯調(diào)控

。已經(jīng)證實(shí)LncRNA參與了機(jī)體的發(fā)育、分化、凋亡、自噬、炎癥和癌癥等生理或病理過程

。最近，越來越多的lncRNA被報(bào)道在肝癌的癌變和發(fā)展中發(fā)揮重要作用

。HULC是第一個(gè)在人類肝癌組織中特異性過表達(dá)的LncRNA

。然而，迄今為止，HULC是否能夠調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的自噬尚不清楚。同時(shí)，HULC對化療試劑的反應(yīng)亦不清楚。本文通過比較對照組 （NOR 組），基因過表達(dá)組（O-HULC組），基因抑制組（S-HULC組）肝癌Hep G2細(xì)胞的自噬，凋亡，侵襲遷移情況，評價(jià)HULC對肝癌Hep G2細(xì)胞的細(xì)胞自噬和化療耐藥的影響機(jī)制。以圖尋找關(guān)鍵作用通路及作用靶點(diǎn)，為日后肝癌的治療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組 選取美國ATCC細(xì)胞庫來源的Hep G2細(xì)胞。細(xì)胞分為3組，NOR組、O-HULC組和S-HULC組。NOR組不做處理，正常培養(yǎng)，O-HULC組轉(zhuǎn)染HULC基因，S-HULC組抑制HULC基因后培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HULC基因過表達(dá)肝癌細(xì)胞Hep G2 在感受態(tài)的細(xì)胞中加入質(zhì)粒和連接產(chǎn)物，在冰上靜置后于45 ℃下迅速水浴，之后再次置于冰上，在含有抗生素的培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜后按照說明書提取質(zhì)粒并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA表達(dá)，包括純度和表達(dá)量。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將生長狀態(tài)較好的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含有質(zhì)粒的無血清培養(yǎng)基，后加入轉(zhuǎn)染試劑，然后加入到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔10 min搖晃一次，6～8 h后更換培養(yǎng)基。目的基因擴(kuò)增，提取出RNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到cDNA后加入引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后用限制性內(nèi)切酶酶切，而后siRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.2 肝癌Hep G2細(xì)胞侵襲和遷移量檢測 ①細(xì)胞侵襲能力檢測：將細(xì)胞加入到Transwell的上室中，加入4 μmol/L的奧沙利鉑溶液（美國Sigma公司）之后用伊紅染料將穿過基質(zhì)膠包裹的下室的肝癌細(xì)胞進(jìn)行染色。然后顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。②細(xì)胞遷移能力檢測：將加入奧沙利鉑溶液的細(xì)胞加入到Transwell的上室中，然后顯微鏡下對下室的肝癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)每組平行6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用χ

分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，

＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 RT-PCR 法測定基因表達(dá)量 使用QiagenOneStep RT-PCR試劑盒（美國Qiagen公司，批號：210210）完成qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。根據(jù)說明書要求，采用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqManmiRNA分析完成總RNA的聚腺苷酸化和逆轉(zhuǎn)錄過程。β-actin的表達(dá)用作內(nèi)部對照。被測基因的相對表達(dá)利用2

方法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測試。每種試劑的量如下：5 μL 2X qPCR Mix，1 μL引物工作溶液（2.5 μM），引物序列見表1，1 μL模板，2.8 μL ddH2O和0.2 μL Rox染料。

2.5 各組肝癌細(xì)胞COX-2 和LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量 與S-HULC 組相比，NOR 組和O-HULC 組 的COX-2及LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量升高，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表6和圖2。

2.2.1 城市建設(shè)占用部分耕地面積，導(dǎo)致耕地面積有所減少35.3%，城鎮(zhèn)用地、農(nóng)村居民點(diǎn)及其他建筑用地的面積有所增加。

2 結(jié)果

癌癥細(xì)胞的典型特點(diǎn)是增殖迅速，侵襲遷移能力強(qiáng)大，所以侵襲遷移能力是評判癌癥細(xì)胞活力的一項(xiàng)重要表觀指標(biāo)。有報(bào)道顯示，癌癥模型小鼠的癌癥程度越嚴(yán)重，其癌癥細(xì)胞的遷移侵襲能力越強(qiáng)

。研究表明，lncRNA-HULC可以減弱HCC化療藥物如索拉非尼、順鉑、5-氟尿嘧啶（5-fu）等，可降低化療敏感性和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致癌細(xì)胞存活

。本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用化療藥物作用細(xì)胞后，癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，侵襲和遷移，但是HULC一旦被抑制，侵襲遷移能力降低，凋亡率高于O-HULC組，提示HULC影響癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

發(fā)《尋人啟事》尋找女兒，對于由于時(shí)間的流逝情緒已稍稍平緩的張秋來說，是有些殘酷和痛苦的，然而，張秋的這種痛苦也同時(shí)會激起犯罪分子的快感，犯罪分子很可能會跳出來再往張秋痛苦的心里撒把鹽。

2.4 各組肝癌細(xì)胞USP22 和SIRT1 蛋白表達(dá)量 與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組的USP22及SIRT1蛋白表達(dá)量升高，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表5和圖1。

本文所述土箱產(chǎn)繭應(yīng)選擇遠(yuǎn)離道路的場所，產(chǎn)卵繭期應(yīng)保持安靜，避免土壤震動(dòng)，否則正在產(chǎn)卵繭的水蛭會受驚而逃走，造成空繭。首先挖一個(gè)深度25cm的矩形淺坑，將網(wǎng)箱鋪蓋在坑上，用越冬分化土（松軟）填滿。接著向網(wǎng)箱中加水，使土濕度保持在30%左右。投放密度為200-300只每平米，投放完成后用透氣紗布將網(wǎng)箱扎起防止水蛭逃離，并蓋上水草或樹枝等進(jìn)行遮光。在坑四周挖一條排水溝，防止暴雨天氣雨水將網(wǎng)箱浸透，在下雨天氣要及時(shí)疏通溢水口。投放后第二日打開網(wǎng)箱檢查水蛭是否都已入土產(chǎn)繭，洞口內(nèi)有白色泡沫即為水蛭產(chǎn)繭。整個(gè)產(chǎn)繭過程持續(xù)約12-14天，土壤溫度為20℃左右，每條水蛭平均能產(chǎn)繭3-4個(gè)左右。

2.3 各組肝癌Hep G2細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲能力 與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組肝癌Hep G2細(xì)胞遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量顯著增加，其中O-HULC組顯著高于NOR組（

＜0.05），見表4。

1.2.4 Western Blot法測定蛋白含量 ①提取蛋白：利用超聲組織破碎儀破碎細(xì)胞[破碎條件為4 次/（管·300 W）]，細(xì)胞破碎后4 ℃或冰上放置30 min，將破碎后的細(xì)胞進(jìn)行4 ℃離心，12 000 g離心30 min，收集上清液，即為蛋白抽提液。②蛋白定量：使用BCA法測定蛋白濃度。③凝膠電泳：取待測標(biāo)本15 μL進(jìn)行上樣，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析，至目的分子量出現(xiàn)。④濕法轉(zhuǎn)膜：采用濕法將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至Immun-blot PVDF膜上，加入濃度為50 g/L的脫脂奶粉在20 ℃的條件下封閉震蕩處理3 h，加入以下抗體[小鼠抗人USP22單克隆抗體（1∶400）、兔抗人和SIRT1（1∶400）多克隆抗體]，4 ℃孵育過夜。使用經(jīng)過辣根酶標(biāo)記的IgG（1∶1 000），在溫度為37 ℃的條件下孵育2 h。⑤發(fā)光顯影和圖像分析。

2.2 各組肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡率 各組添加化療藥物后整體呈現(xiàn)凋亡趨勢，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡率降低，其中O-HULC組低于NOR組（

＜0.05），見表3。

3 討論

LncRNA作為一種新型的RNA，由于參與多種細(xì)胞過程和在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮重要作用而受到廣泛關(guān)注。在HCC中首次發(fā)現(xiàn)的lncRNA-HULC已被證實(shí)參與包括腫瘤異常生長在內(nèi)的多個(gè)病理過程

。然而，目前相應(yīng)的機(jī)制還不是很清楚。

2.1 各組肝癌Hep G2細(xì)胞自噬情況 各組的肝癌Hep G2細(xì)胞自噬情況隨藥物添加時(shí)間延長而增加，與S-HULC組相比，O-HULC組和NOR組肝癌Hep G2細(xì)胞自噬情況顯著增加，其中O-HULC組高于NOR組（

＜0.05），見表2。

越來越多的證據(jù)表明，自噬的保護(hù)作用是導(dǎo)致癌細(xì)胞耐藥的重要原因

。自噬是一種保守的分解代謝過程，當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激條件下或營養(yǎng)缺乏時(shí)，負(fù)責(zé)清除和降解過量或不必要的蛋白質(zhì)，從而應(yīng)對饑餓或細(xì)胞壓力（如化療藥物）

。因此，更好地了解參與保護(hù)性自噬的分子進(jìn)程，并在化療過程中干預(yù)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)，有助于研究實(shí)現(xiàn)肝癌患者干預(yù)治療。已證實(shí)長鏈非編碼RNA與細(xì)胞自噬相關(guān)

。如研究發(fā)現(xiàn)MTOR激動(dòng)劑（3BDO）可通過下調(diào)LncRNA-FLJ11812促進(jìn)MIR4459對ATG13的抑制作用，抑制細(xì)胞自噬

。LncRNA APF可通過抑制miR-188-3p的水平和活性從而上調(diào)ATG7的水平進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HULC的過表達(dá)可以有效上調(diào)肝癌細(xì)胞的自噬百分比。但是機(jī)制尚不明確，為此，我們將選擇蛋白實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證。

余熱利用方式可分為熱交換式和吸收式。其中熱交換式是通過利用余熱的焓，將其能量交換出來，轉(zhuǎn)化為蒸汽或熱水，主要設(shè)備有余熱鍋爐、板式換熱器等；吸收式是通過利用余熱的，綜合考慮其熱量及品質(zhì)，將低品位的能量轉(zhuǎn)化到另一介質(zhì)中存在，主要設(shè)備有吸收式制冷、吸收式熱泵等。

三是做大水利投融資平臺。省政府成立了省水利發(fā)展投資有限公司，注冊資本金50億元，主要由省財(cái)政注資，采取多元投資方式，省水利廳管理為主，通過市場融資，解決湖南省水利建設(shè)投入不足的問題。各市縣水利投融資平臺通過財(cái)政注入資金、金融機(jī)構(gòu)貸款、土地儲備等方式，融資90億元。

USP22是去泛素酶（DUBs）成員

，SIRT1 通 過調(diào)控許多自噬關(guān)鍵成分，如自噬相關(guān)蛋白（Atg）5、Atg7、Atg8、海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白1（Beclin1）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O 亞家族1（FoxO1）等誘導(dǎo)自噬

。COX-2可催化花生四烯酸生成前列腺素，介導(dǎo)多種生理和病理過程

。研究表明，COX-2在結(jié)直腸、前列腺、乳腺、胃、肺和肝臟等多種人類器官中均有上調(diào)

。SIRT1與COX-2是USP22的直接底物，可通過USP22介導(dǎo)去泛素化

。本研究發(fā)現(xiàn)與S-HULC組相比，NOR組和O-HULC組的USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量升高，其中O-HULC組高于NOR組，說明在HCC細(xì)胞中，隨著HULC 被抑制，USP22、SIRT1、COX-2 及LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)量降低。說明HULC可降低肝癌Hep G2細(xì)胞對化療試劑的敏感性，從而觸發(fā)了肝癌Hep G2 細(xì)胞的保護(hù)性自噬，可能與信號通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有關(guān)，其降低了肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

綜上所述，LncRNA-HULC可以穩(wěn)定SIRT1調(diào)控細(xì)胞自噬降低細(xì)胞對化療藥物的敏感性，可能與信號通路“HULC-USP22-SIRT1/COX-2-LCⅡ”有關(guān)，此通路可能是開發(fā)肝癌化療新增敏策略的新靶點(diǎn)。

[1] LUBEL J S，ROBERTS S K，HOWELL J，et al.Current issues in the prevalence，diagnosis and management of hepatocellular carcinoma in Australia[J].Internal Medicine Journal，2021，51（2）：181-188.

[2] BAI X，NI J，BERETOV J，et al.Cancer stem cell in breast cancer therapeutic resistance[J].Cancer Treatment Reviews，2018（69）：152-163.

[3] TAM C，WONG J H，TSUI S，et al.LncRNAs with miRNAs in regulation of gastric，liver，and colorectal cancers：updates in recent years [J].Applied Microbiology and Biotechnology，2019，103（11）：4649-4677.

[4] HUANG F，CHEN H，ZHENG F，et al.LncRNA BLACAT1 is involved in chemoresistance of non-small cell lung cancer cells by regulating autophagy[J].International Journal of Oncology，2018，54（1）：339-347.

[5] 盧夢曉，胡岳，姜建帥，等.長鏈非編碼RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相互作用關(guān)系的研究現(xiàn)狀[J].中國保健營養(yǎng)，2021，31（7）：19-20.

[6] SOUDEH GHAFOURIARD，ESMAEILI M，TAHERI M，et al.Highly upregulated in liver cancer（HULC）：An update on its role in carcinogenesis [J].Journal of Cellular Physiology，2020，235（24）：9071-9079.

[7] 劉熙稱，劉廣明，秦俊杰.lncRNA-HULC在肝細(xì)胞癌中的作用[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2020，29（6）：7-11.

[8] LIAO L，LIU C，XIE X，et al.Betulinic acid induces apoptosis and impairs migration and invasion in a mouse model of ovarian cancer[J].Journal of Food Biochemistry，2020，44（11）：e13278.

[9] 朱李茹，封建立，劉曉吉，等.長鏈非編碼RNA HULC 通過下調(diào)miR29的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌生長的機(jī)制[J].中華腫瘤雜志，2019，41（9）：659-666.

[10] 楊超波，童欣，李冠武.自噬與腫瘤EGFR 抑制劑耐藥的研究進(jìn)展[J].汕頭大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，34（2）：71-80.

[11] 向雨晨，彭鵬，文君，等.自噬在癌癥治療中的雙面性及自噬誘導(dǎo)劑的治療進(jìn)展[J].湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，39（5）：92-97.

[12] QIANG CAI，SHOUHUA WANG，LONGYANG JIN，et al.Long non-coding RNA GBCDRlnc1 induces chemoresistance of gallbladder cancer cells by activating autophagy[J].Molecular cancer，2019，18（1）：e82.

[13] DI G E，LEI H A N，SHU Y A，et al.HuangIdentification of a novel MTOR activator and discovery of a competing endogenous RNA regulating autophagy in vascular endothelial cells[J].Autophagy，2014，10（6）：957-971.

[14] X WANG，CHENG M L，GONG Y，et al.LncRNA DANCR promotes ATG7 expression to accelerate hepatocellular carcinoma cell proliferation and autophagy by sponging miR-222-3p[J].European review for medical and pharmacological sciences，2020，24（17）：8778-8787.

[15] 程中玉，謝嘉豪，蔣耀萱，等.去泛素化酶與伴侶分子互作的病理生理及研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2019，50（3）：167-174.

[16] DOUGLAS S.Grunwald，Neil Michael Otto，Ji-Man Park，et al.G ABARAPs and LC3s have opposite roles in regulating ULK1 for autophagy induction[J].Autophagy，2020，16（4）：600-614.

[17] XUE S，MAO F ，HU D，et al . Acetylation of BmAtg8 inhibits starvation-induced autophagy initiation[J].Molecular and Cellular Biochemistry，2019，457（1-2）：73-81.

[18] 孔利心，任彪，程磊.環(huán)氧合酶2/前列腺素E2 通路調(diào)控口腔腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2020，47（4）：431-438.

[19] YALCIN FAKI , AYSE E R . Different Chemical Structures and Physiological/Pathological Roles of Cyclooxygenases [J].Rambam Maimonides Med J，2020，12（1）：e0003.

[20] DENG J S，JIANG W P，CHEN C C，et al.Cordyceps cicadae Mycelia Ameliorate Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury by Suppressing the TLR4/NF-kappaB/MAPK and Activating the HO-1/Nrf2 and Sirt-1/AMPK Pathways in Mice[J].Oxid Med Cell Longev，2020（6）：1-17.

[21] LIM W，KANG C.Avenanthramide C suppresses hypoxia-induced cyclooxygenase-2 expression through sirtuin1 activation in non-small-cell lung cancer cells[J].Anim Cells Syst （Seoul），2020，24（2）：79-83.

[22] WANG C，GAO Y，ZHANG Z，et al.Safflower yellow alleviates osteoarthritis and prevents inflammation by inhibiting PGE2 release and regulating NF-kappaB/SIRT1/AMPK signaling pathways[J].Phytomedicine，2020（78）：e153305.

[23] WEN X，LING S，WU W，et al.Ubiquitin-Specific Protease 22/Silent Information Regulator 1 Axis Plays a Pivotal Role in the Prognosis and 5-Fluorouracil Resistance in Hepatocellular Carcinoma[J].Digestive Diseases and Sciences，2020，65（4）：1064-1073.

[24] OLA A HARB，RANDA MOHAMED KAF，HEBA F，et al.TahaClinical， pathological and prognostic implications of USP22，SIRT1 and E-cadherin expression in papillary thyroid cancer （PTC） and adjacent non-neoplastic tissue [J].Surgical and Experimental Pathology，2019，2（1）：e22.