陳千思，劉萍萍，李澤鋒，楊小寧，武明珠，鄭慶霞，周會(huì)娜

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

類受體激酶（Receptor-like kinase，RLK）是真核生物中保守的蛋白激酶，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑感受植物細(xì)胞膜外信號，并將信號傳遞到植物細(xì)胞核［1］，參與激活生長［2-3］、發(fā)育［4-5］、應(yīng)激反應(yīng)［6-8］和抗病［9-11］等過程。RLK 通常由氨基末端的膜定位信號、細(xì)胞外的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成［12］。對多種RLK 的功能研究表明，配體結(jié)合域在感知細(xì)胞外的刺激中起著重要作用，而胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域是通過磷酸化下游底物來實(shí)現(xiàn)對下游的調(diào)控［13］。在模式植物擬南芥中，多項(xiàng)研究表明，RLK 通過多種信號傳導(dǎo)途徑［14-16］參與調(diào)節(jié)不同類型的生物學(xué)過程［17-21］。其中，一類命名為花序分生組織類受體激酶（Inflorescence meristem receptor-like kinase，IMK），屬于LRR 類受體激酶［22］。擬南芥基因組中共有2個(gè)IMK 基因，分別為IMK2（AT3G51740）和IMK3（AT3G56100）。擬南芥中，IMK2 蛋白能與另外一種非典型的LRR 類受體激酶SCM 互作并參與根的上皮細(xì)胞排布；IMK3 主要在莖頂端和根尖表達(dá)，在胚中也能檢測到，編碼的蛋白質(zhì)具有體外激酶活性且能與MADS-box 蛋白AGL24 互作并使其磷酸化。

在煙草中，前期研究發(fā)現(xiàn)NtIMK 的表達(dá)與干旱響應(yīng)高度相關(guān)，暗示IMK 基因除了參與調(diào)控生長發(fā)育外，還可能參與了對逆境的響應(yīng)過程［23］。然而，煙草中IMK 蛋白家族的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本研究中利用生物信息學(xué)手段分析、鑒定了NtIMK 家族成員，研究了NtIMKs 在不同組織器官和不同激素處理前后的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探討NtIMK 在生長發(fā)育及逆境脅迫中的功能提供基礎(chǔ)，并為煙草重要性狀的分子調(diào)控機(jī)制研究提供潛在的理論參考和基因信息。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：栽培煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.）種植于國家煙草基因研究中心人工氣候室，溫度為26～28 ℃，相對濕度60%，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗［24］。

試劑：6-芐氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA，Lot No.B3408）、赤霉素（Gibberellin，GA，Lot No.48870）、3-吲哚乙酸（3-Indoleacetic acid，IAA，Lot No.I2886）、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA，Lot No.392707）、水楊酸（Salicylic acid，SA，Lot No.S7401）購于美國西格瑪奧德里奇公司；獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactones，GR24，Lot No.41012ES03）購于翌圣生物科技（上海）有限公司；MS Medium（Lot No.MS9043）購于北京密碼子生物科技有限公司；Agar（Lot No.A7921）購于美國西格瑪奧德里奇公司；植物RNA快速提取試劑盒（Lot No.RN3802）購于北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Lot No.04897030001）和qPCR試劑盒FastStart Essential DNA Green Master（Lot No.06924204001）購于瑞士羅氏公司。

儀器：Biometra Tone 96 PCR 儀器（德國Biometra 公司）；LightCycler96 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Lot No.05815916001，瑞士羅氏公司）；移液器（德國艾本德公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草IMK 家族基因的檢索和鑒定

在擬南芥種質(zhì)信息數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥IMK2 和IMK3 蛋白質(zhì)序列。在煙草基因組數(shù)據(jù)庫（ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/）普 通煙草K326 的蛋白質(zhì)序列中進(jìn)行同源搜索，獲得煙草品種K326 的IMK 蛋白質(zhì)的氨基酸序列。利用TBtools 軟 件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）比對獲得的NtIMK 蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

1.2.2 煙草IMK 基因亞家族的生物信息學(xué)分析

通過MUSCLE 軟件對獲得的煙草IMK 蛋白和2 個(gè)擬南芥IMK 蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對。通過MEGAX 軟件采用鄰接法生成IMK 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中，校驗(yàn)參數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000，其余均為默認(rèn)參數(shù)。通過MEME 在線網(wǎng)站（http://meme-suite.org/tools/meme）對IMK蛋白進(jìn)行保守基序分析。利用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并繪制基因結(jié)構(gòu)分布圖。通過TMHMM 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMFMM/）對NtIMK蛋白家族進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.3 不同組織的表達(dá)模式分析

在煙草生長到盛花期時(shí)，對第5 葉位葉片、葉芽、第10 葉位葉片、第15 葉位葉片、莖節(jié)、莖、側(cè)根、須根、花、花蕾這10 個(gè)不同部位組織分別進(jìn)行取樣。樣品剪下后，迅速液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。樣品經(jīng)液氮研磨成粉末，使用植物RNA 快速提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA 抽提和反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋至400 ng/μL。通過選取基因特異引物，利用qRT-PCR 方法，取1 μL cDNA 用于基因定量分析的模板，用煙草EF1α基因（GenBank ID：NM001326165）作為內(nèi)參，3 次技術(shù)重復(fù)。依照qRT-PCR 試劑盒（Lot No.06924 204001，瑞士羅氏公司）說明書上的操作步驟和反應(yīng)程序，在qRT-PCR 儀器上運(yùn)行PCR 程序和收集熒光信號。數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析，待測基因的相對表達(dá)量參照同一基因在第5 葉位葉片中的表達(dá)量。各個(gè)組織及處理獨(dú)立進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，每組生物學(xué)重復(fù)為獨(dú)立樣本并單獨(dú)提取RNA。

1.2.4 不同激素處理后的表達(dá)模式分析

煙草K326 種子用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡60 s，無菌水清洗2～3 次，然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉表面消毒15～20 min（晃蕩），無菌水洗3 遍，取出種子放在濾紙上晾干水分，將消毒的種子平鋪于MS 固體培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基pH=5.8，瓊脂濃度0.8%），進(jìn)行煙草無菌苗培養(yǎng)。待長出幼苗后，將幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)盒中繼續(xù)無菌培養(yǎng)，直到長到5 葉期時(shí)備用。挑取長勢一致的煙草無菌苗，用配好的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的6 種激素（6-BA、GA、GR24、IAA，meJA 和SA）［25-26］母液分別浸泡無菌苗3 h 和24 h，相應(yīng)的未處理葉片作為對照，剪下葉片后迅速液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。通過qRT-PCR 方法對6 個(gè)NtIMK 基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。RNA 提取、cDNA 的制備、qRT-PCR 體系及反應(yīng)程序同章節(jié)1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通煙草中NtIMK 基因鑒定

為了鑒定煙草中的IMK 基因，利用擬南芥已報(bào)道的2 個(gè)IMK 類型蛋白IMK2（AT3G56100.1）和IMK3（AT3G51740.1）的氨基酸序列在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中比對搜索煙草品種K326 的IMK 蛋白序列，得到6 個(gè)編碼IMK 蛋白的基因（表1）。氨基酸比對分析結(jié)果顯示，這6 個(gè)IMK 蛋白的氨基酸序列一致性在61%～97%之間。其中Nitab4.5_0011886g 0020.1 與Nitab4.5_0000230g0240.1，Nitab 4.5_00003 75g0060.1 與 Nitab4.5_0003402g0040.1，Nitab4.5_0002854g0020.1與Nitab4.5_0004167g0030.1 兩兩之間的序列一致性分別高達(dá)97%、92%和94%，暗示IMK 基因可能存在功能冗余。

表1 NtIMK 蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對Tab.1 Amino acid sequence alignment of NtIMK protein （%）

2.2 煙草IMK 基因亞家族的聚類、基因結(jié)構(gòu)和motif 分析

使用MUSCLE 軟件對6 個(gè)煙草IMK 蛋白和2個(gè)擬南芥IMK 蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對，在MEGAX 中通過鄰接法生成了IMK 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1A）。由圖1A 可見，6 個(gè)煙草IMK 蛋白可以分為2 類，其中2 個(gè)與擬南芥IMK3 距離較近（IMK3 類），4 個(gè)與擬南芥IMK2距離較近（IMK2 類）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，這6 個(gè)煙草IMKs基因均含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子，且外顯子長度較為一致，只有內(nèi)含子長度變異較大，進(jìn)一步暗示這些基因可能存在功能冗余（圖1A）。

利用MEME 軟件對這些IMK 蛋白的保守Motif 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1B 所示，共鑒定出12 個(gè)分布于IMK 蛋白上的保守Motif，所有IMK 蛋白均包含這12 個(gè)保守的Motif。其中不同類型IMK 蛋白的主要區(qū)別在于重復(fù)motif 12（GSIP motif）個(gè)數(shù)的差異。煙草IMK2 類蛋白均含有2 個(gè)重復(fù)的motif 12，而IMK3 類蛋白包含3 個(gè)重復(fù)的motif 12，暗示motif 12 在這2 類IMK 蛋白的功能分化過程中可能起著重要作用。進(jìn)一步分析每個(gè)motif中氨基酸的保守性（圖1C），結(jié)果表明motif 10、motif 11 和motif 12 富含Leu，表明煙草IMKs 屬于LRR 類受體激酶。

圖1 NtIMKs 的進(jìn)化樹（A）、保守基序分布（B）和氨基酸保守性（C）Fig.1 Phylogenetic analysis of NtIMKs (A),distributions of conserved motifs of NtIMKs (B) and amino acid conservation analysis of motifs (C)

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域和翻譯后修飾位點(diǎn)分析

通過TMHMM 軟件對NtIMK 蛋白家族進(jìn)行了跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示 Nitab4.5_0011886g0020.1 與Nitab4.5_0000230g0240.1 存 在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而其他4 個(gè)則可能存在3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，說明NtIMK 蛋白也可能是膜蛋白（圖2A）。此外，對煙草IMKs 的翻譯后修飾位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在擬南芥IMK2 鑒定出的11 個(gè)修飾位點(diǎn)中，僅2 個(gè)位點(diǎn)在煙草所有IMKs 蛋白中均存在且保守，包含一個(gè)N-glycosylation（天冬酰胺糖基化）和T-phosphorylation（蘇氨酸磷酸化）。類受體激酶通常通過自身磷酸化狀態(tài)的變化來行使功能，因此推斷這2 個(gè)位點(diǎn)可能在IMKs 蛋白發(fā)揮功能過程中起著重要作用，其中蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)可能是其激酶活性位點(diǎn)（圖2B）。

圖2 NtIMK 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域（A）和翻譯后修飾位點(diǎn)（B）分析Fig.2 Analysis of transmembrane domains (A) and modified sites after translation (B) in NtIMK proteins

2.4 不同組織表達(dá)模式分析

通過選取基因特異引物（表2），利用qRT-PCR的方法對這些基因在葉、莖、莖節(jié)、花、花蕾、側(cè)根和須根中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)IMKs 基因家族成員均在側(cè)根和花蕾中高表達(dá)，其中Nitab4.5_0002854g0020、Nitab4.5_0000375g0060 和Nitab4.5_0003402g0040 在花蕾表達(dá)最高，Nitab4.5_0004167g0030、Nitab4.5_0011 886g0020 和Nitab4.5_0000230g0240 則在側(cè)根中的表達(dá)高于其他組織。Nitab4.5_0011886g0020 和Nitab4.5_0000230g0240 除了在氨基酸序列高度相似外，在不同組織中表達(dá)模式相似，除了在花蕾、莖和側(cè)根中高表達(dá)外，在莖節(jié)、第10 葉位和第15葉位葉片中也高表達(dá)，暗示其除了具有花蕾和側(cè)根的發(fā)育功能外，可能還在葉和莖中發(fā)揮功能。另外一對高度同源的基因?qū)itab4.5_0000 375g0060 和Nitab4.5_0003402g0040 在不同組織中表達(dá)模式相似，均在側(cè)根中表達(dá)最高，在第15 葉位葉片中表達(dá)量最低。表達(dá)模式分析結(jié)果說明，不同的煙草IMKs成員表現(xiàn)出不同的組織特異性，并且氨基酸序列一致性高的基因其表達(dá)模式也較為相似。

表2 引物序列及用途Tab.2 Sequences of primers and their usage

圖3 NtIMKs 在不同組織的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of NtIMKs in different tissues

2.5 不同激素處理后的表達(dá)模式分析

煙草IMKs 基因家族成員對6 種激素（包括6-BA、GA、GR24、IAA、meJA 和SA）響應(yīng)的分析結(jié)果見圖4，與對照相比，GR24 和SA 處理后Nitab4.5_0011886g0020 的表達(dá)量顯著上調(diào)；GA、GR24 和IAA 處理后，Nitab4.5_0000230g0240 的 表達(dá)量顯著上調(diào)；GA 處理后，Nitab4.5_0000375g0060的表達(dá)量顯著上調(diào)，但在6-BA 和meJA 處理后該基因的表達(dá)量顯著下調(diào)；GA、IAA 和SA 處理后，Nitab4.5_0002854g0020 的表達(dá)量顯著上調(diào)；GA 和IAA 處理時(shí)，Nitab4.5_0003402g0040 的表達(dá)量顯著上調(diào)，但在6-BA 處理時(shí)，該基因的表達(dá)值顯著下調(diào)；GA、IAA 和SA 處理后，Nitab4.5_0004167g0030的表達(dá)量顯著上調(diào)。

圖4 不同激素處理后煙草IMKs 的表達(dá)模式Fig.4 Expression modes of NtIMKs treated by different hormones

3 討論

擬南芥中最大的RLKs 家族LRR RLK 大約有235 個(gè)成員，在發(fā)育、病原體抗性和激素感知中具有多種作用。研究表明，LRR RLKs 在與激素和非生物應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。ABA 是非生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，可以調(diào)節(jié)干旱、鹽和滲透脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)。擬南芥RPK1 基因（Receptor-like protein kinase 1 gene）突變體對ABA 不敏感，且干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)大幅下調(diào)。油菜素內(nèi)酯（BRs）是植物必需的多羥基化甾體類激素，對植物生長發(fā)育至關(guān)重要。被命名為第一個(gè)BR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的BRI1 基因（Brassinosteroid insensitive 1 gene）與其相關(guān)受體激酶BAK1 異源二聚化而參與BR 的感知和信號傳導(dǎo)。BAK1 相關(guān)受體激酶1（BARK1）的過表達(dá)促進(jìn)了根系的生長，表明BARK1 在BR 介導(dǎo)的根系發(fā)育中發(fā)揮作用［1］。BAK1/SERK3 受IAA 和鄰氨甲酰苯甲酸（NPA）調(diào)控，RLK902 受NPA 調(diào)控，但I(xiàn)MK2 和IMK3 不受激素調(diào)節(jié)，IMK2 受NPA 和甘露醇調(diào)節(jié)，IMK3 受鹽和甘露醇調(diào)節(jié)［27］。擬南芥中，IMK2 蛋白能與另外一種非典型的LRR 類受體激酶SCM 互作并參與根的上皮細(xì)胞排布；IMK3 主要在莖頂端和根尖表達(dá)，在胚中也能檢測到，編碼的蛋白質(zhì)具有體外激酶活性且能與MADS-box 蛋白AGL24 互作并使其磷酸化［28］。

利用序列分析、序列比對等生物信息學(xué)相關(guān)方法，從普通煙草基因組中鑒定出了6 個(gè)IMK 家族成員。這些煙草IMK 基因結(jié)構(gòu)和其編碼的蛋白質(zhì)序列均相對保守，主要分為2 類，一類與擬南芥IMK2 相近。激素處理后的基因表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，大多數(shù)煙草IMKs 能響應(yīng)不同的激素，其中4 個(gè)煙草IMKs 均被GA 和IAA 誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明Nitab4.5_0000230g0240、Nitab4.5_0002854g0020、Nitab4.5_0003402g0040 和 Nitab4.5_0004167g0030均可能參與了GA 和IAA 介導(dǎo)的調(diào)控反應(yīng)。Nitab4.5_0000375g0060還被6-BA和meJA抑制下調(diào)表達(dá)。組織表達(dá)模式分析結(jié)果說明，大部分的煙草IMKs 在側(cè)根和花蕾中呈現(xiàn)高表達(dá)，這與擬南芥中IMK2 和IMK3 較為相似，暗示煙草IMKs 基因可能在側(cè)根和花發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，不同的煙草IMKs 成員也表現(xiàn)出不同的組織特異性，同源基因?qū)itab4.5_0000375g0060 和Nitab4.5_00034 02g0040 在不同組織中表達(dá)模式相似，均在側(cè)根中表達(dá)量最高，在15 葉位煙葉中表達(dá)量最低，表明這些基因在煙草中可能存在功能冗余。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，不同類型的IMKs成員表現(xiàn)出不同的組織特異性，表明它們可能在煙草不同組織發(fā)育或逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。IMK 可能負(fù)調(diào)控GA 和IAA 激素介導(dǎo)的生理反應(yīng)，但這些煙草IMKs如何參與激素介導(dǎo)的生理反應(yīng)，還有待深入研究。

4 結(jié)論

在普通煙草基因組中共鑒定出6 個(gè)IMK 家族成員，鑒定出的IMKs 大多數(shù)可以響應(yīng)不同的激素。其 中，Nitab4.5_0000230g0240、Nitab4.5_0002854g 0020、Nitab4.5_0003402g0040 和Nitab4.5_0004167g 0030 均被GA 和IAA 誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明這4 個(gè)基因均可能參與了GA 和IAA 介導(dǎo)的調(diào)控反應(yīng)。此外，6 個(gè)IMKs 基因家族成員均在側(cè)根和花蕾中高表達(dá)，表明IMKs 基因可能在側(cè)根和花發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。