沈旦楓，蘆鑫榮，鄒琳，王蕾，孔維溧，袁舒穎，陳妍雯，孫桂芹，陳力*

（1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2. 永道致遠(yuǎn)科學(xué)技術(shù)有限公司，上海 200120；3. 先思達(dá)生物科技有限公司，江蘇 南京 211800；4. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，浙江 杭州 310053）

1 引言

近年來，多種技術(shù)被用來分析糖蛋白和N-聚糖。早期研究主要依賴于凝集素結(jié)合方法[1]，它可以鑒定出現(xiàn)在蛋白[2]、細(xì)胞[3]和組織[4]上的特定表位。高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）[5-6]和 質(zhì) 譜（mass spectrometry，MS）[7-8]等技術(shù)拓展了糖組學(xué)研究領(lǐng)域。目前，反相色譜（reverse phase chromatography，PRC）[9-10]、親水相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）[11-12]、多孔石墨碳（porous graphitic carbon，PGC）[13]和毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）[14]等多項(xiàng)技術(shù)被報(bào)道用于聚糖特征的分析。

糖相關(guān)分子與疾病間的關(guān)聯(lián)，是一個開放的研究領(lǐng)域。本文對腫瘤、感染性疾病和遺傳病共23個糖相關(guān)分子[包括聚糖、糖蛋白、凝集素和糖蛋白甘露糖糖苷酶（glycoprotein mannosidase，gpM）等（見表1）]的研究進(jìn)展進(jìn)行了回顧和展望。

2 癌癥中的糖相關(guān)分子

癌癥是僅次于心血管疾病的第二大致死病因。近年來，雖然醫(yī)學(xué)技術(shù)和醫(yī)療手段突飛猛進(jìn)，但癌癥的早篩早診仍存在困難，又因癌癥預(yù)后不良，導(dǎo)致癌癥患者的存活率很低。常規(guī)診斷方法（包括超聲[15]、磁共振成像[16]和活檢[17]等）取決于腫瘤的表型特性，對于癌癥早期檢測效率不高。癌癥是一種多階段性疾?。╩ultistage disease），其發(fā)生和發(fā)展與一系列遺傳學(xué)（genetic）或表觀遺傳學(xué)的（epigenetic）變化有關(guān)。這些變化會干擾細(xì)胞信號通路，引發(fā)致瘤性轉(zhuǎn)化（tumorigenic transformation），導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。癌癥發(fā)生的過程中，人體會分泌高水平的生物標(biāo)志物分子[18]進(jìn)入尿液、血液、腫瘤組織或其他組織。因此，對癌癥標(biāo)志物分子有效的早期檢測為癌癥病人的篩查和診斷提供了可靠方法。該過程不僅可以幫助對癌癥病理性進(jìn)展進(jìn)行評估，還可以預(yù)測不同癌癥的預(yù)后，以及藥物治療的應(yīng)答情況。目前，一系列癌癥標(biāo)志物已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床診斷和預(yù)后，但是仍存在著假陽性或假陰性的問題，在特異性及敏感性方面也有待提高。這可能與病人間的分子不均一性以及患癌器官處于多個癌癥階段相關(guān)[19]，因此，尋找新的敏感性高、特異性強(qiáng)的單一標(biāo)志物分子具有重大意義[20]。

表 1 與腫瘤、感染性疾病和遺傳病相關(guān)的23種糖相關(guān)分子Table 1 23 Saccharide-related molecules in tumors, infections and genetic diseases

目前針對癌癥的人體聚糖變化和糖蛋白生物標(biāo)志物的探索相對較少[21]，但聚糖組成和結(jié)構(gòu)的變化是癌癥發(fā)生的常見特征，且參與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和黏附，因此糖組學(xué)的未來發(fā)展可以為腫瘤的診斷和治療提供重要信息[22-23]。由于糖基化將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性提高了幾個數(shù)量級，糖組學(xué)研究關(guān)注的將是高度動態(tài)的生物標(biāo)志物分子（highly dynamic biomarker），對癌癥的診斷、預(yù)后和治療具有評估參考價(jià)值。

2.1 肝癌相關(guān)血清糖蛋白和聚糖標(biāo)志物分子

2.1.1 糖相關(guān)分子1——α-甲胎血清蛋白 AFP是相對分子質(zhì)量為70 000的糖蛋白，主要由卵黃囊和胎兒肝臟產(chǎn)生。胎兒血清AFP在孕早期（first trimester）的末期，濃度最高可達(dá)到3h 106~ 5h 106μg · L-1[24]，足月（term）后降至1h 105~ 2h 106μg · L-1，并在出生后快速降低到成人參考值（0.5 ~ 15 μg · L-1）。母親血清中的AFP在孕期也會上升，并在妊娠30 ~ 32周達(dá)到頂峰（200 ~ 300 μg · L-1）。在某些病理狀態(tài)下，血清AFP表達(dá)水平升高，可以作為某些潛在疾病的指示物，如肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[25]、胰腺癌、胃腸道癌、睪丸生殖細(xì)胞癌及腦癌等[26]。盡管對特定癌癥類型的特異性較低，AFP仍然是目前最好的HCC血清標(biāo)志物。有研究報(bào)道，當(dāng)把血清中AFP濃度的臨界值設(shè)定為20 μg · L-1，其在HCC中的檢測敏感性為41% ~ 65%，特異性為80% ~ 94%。AFP濃度升高提示與HCC腫瘤增大相關(guān)，但在癌癥早期，其檢測敏感性較低。在另一項(xiàng)研究中，當(dāng)把AFP臨界值設(shè)定為10.9 μg · L-1，其在HCC早期階段檢測敏感性為66%[27]。

AFP只有一個N-糖基化位點(diǎn)，以雙天線型糖鏈修飾，在癌癥發(fā)展過程產(chǎn)生末端唾液酸化和核心巖藻糖基化修飾等變化[28]。巖藻糖基化水平升高提示與HCC發(fā)展有關(guān)[29]，可以被小扁豆凝集素（Lens culinaris lectin，LCA）檢測。由于在HCC早期，低水平的AFP作為標(biāo)志物特異性較差，因此AFP中能與LCA反應(yīng)的部分（即AFP-L3）與AFP的比例，成為新一代HCC檢測指標(biāo)[30-31]。AFP-L3/AFP比例臨界值為10%時(shí)，對于AFP血清濃度超過10 μg · L-1的病人，該檢測指標(biāo)在HCC發(fā)展全階段的檢測敏感性達(dá)到60%，特異性達(dá)到90%。美國FDA在2006年批準(zhǔn)AFP-L3作為患肝癌風(fēng)險(xiǎn)的檢測指標(biāo)[32]。隨著檢測AFP-L3方法學(xué)的進(jìn)步，目前科研人員已經(jīng)能夠在AFP濃度為2 μg · L-1條件下對樣本進(jìn)行診斷。

2.1.2 糖相關(guān)分子2——Mac-2結(jié)合蛋白糖基化異構(gòu)體 M2BPGi是由肝臟星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）表達(dá)的糖蛋白，在HSC和Kupffer細(xì)胞之間作為信使分子，促進(jìn)纖維化。M2BPGi帶有多分支型N-聚糖結(jié)構(gòu)，被唾液酸修飾。紫藤植物凝集素（wisteria floribunda agglutinin，WFA）能夠識別M2BPGi，推斷其N-聚糖或O-聚糖帶有乳糖胺單元。

自2013年起，M2BPGi作為一種新型的、非侵入性的、快速檢測的血清學(xué)糖標(biāo)志物，用于評估慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）和慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）病人的肝纖維化程度[33-34]。目前，多項(xiàng)研究對血清M2BPGi預(yù)測CHB病人患HCC風(fēng)險(xiǎn)的可靠性進(jìn)行了評估?；加蠬CC的病人其血清M2BPGi含量明顯高于未患有HCC的人群。當(dāng)設(shè)定血清M2BPGi臨界值為0.68 COI（cut-off index）時(shí)，對HCC病人診斷敏感性大于90%，特異性大于80%[35]。Jun等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測HCC的發(fā)生時(shí)M2BPGi是比AFP更有效的檢測指標(biāo)。

2.1.3 糖 相 關(guān) 分 子3——聚 糖A2G1(6)FB 聚糖A2G1(6)FB，是一種帶有核心巖藻糖和二等分N-乙酰氨基葡萄糖的雙天線N-聚糖結(jié)構(gòu)[37]。二分支GlcNAc結(jié)構(gòu)可以被植物血球凝集素（phytohaemagglutinin E4，PHA-E4）所識別結(jié)合。另外，Higashi等[37]對4例病人血清的研究結(jié)果提示，A2G1(6)FB存在于免疫球蛋白（Ig）重鏈上。由于A2G1(6)FB帶有一個核心巖藻糖修飾，因此該結(jié)構(gòu)可以被LCA識別。相對于非HCC患者，在HCV感染發(fā)展成HCC的患者中，血清A2G1(6)FB含量顯著提高。在早期HCC患者中，可以檢測到A2G1(6)FB結(jié)構(gòu)的存在。HCC患者血清中的A2G1(6)FB含量與AFP無相關(guān)性，因此同時(shí)使用A2G1(6)FB和AFP等傳統(tǒng)標(biāo)志物，可以提高HCC診斷的準(zhǔn)確性。

2.2 卵巢癌相關(guān)糖蛋白標(biāo)志物分子

2.2.1 糖相關(guān)分子4——MUC16 MUC16又被稱作癌癥抗原125（CA125），能夠被抗OVCA433卵巢癌細(xì)胞系單克隆抗體識別[38]。MUC16是目前已知最大的跨膜黏蛋白，相對分子質(zhì)量可達(dá)2 000 000[39]。MUC16由支氣管、子宮內(nèi)膜、卵巢和角膜等組織上皮細(xì)胞表達(dá)。MUC16可以保護(hù)細(xì)胞，其跨膜結(jié)構(gòu)的胞外域部分脫落后進(jìn)入血液。MUC16被用作診斷卵巢癌并監(jiān)測癌癥進(jìn)程的標(biāo)志物分子。然而有研究報(bào)道，在一些非婦科癌癥病人以及患有子宮內(nèi)膜異位癥等良性疾病的病人，甚至處于經(jīng)期和孕期的女性血清中也發(fā)現(xiàn)MUC16濃度升高。盡管存在著非特異性和不準(zhǔn)確性，目前仍然將MUC16濃度檢測與超聲聯(lián)合，作為診斷惡性卵巢腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)手段[40]。也有研究報(bào)道嘗試?yán)肕UC16糖型區(qū)分鑒別子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢癌，評價(jià)卵巢癌的臨床分期、細(xì)胞學(xué)分級和組織學(xué)類型[41-43]。卵巢癌病人MUC16上唾液酸化的Tn抗原（STn）富集，而子宮內(nèi)膜異位癥病人MUC16上STn含量遠(yuǎn)低于卵巢癌病人[41]。凝集素微矩陣試驗(yàn)檢測MUC16和MUC1聚糖結(jié)構(gòu)STn和Tn可以鑒別良性卵巢腫瘤與侵襲性上皮性卵巢/小管癌，特異性達(dá)到61.1 %，敏感性達(dá)到90%[42]，具有鑒別診斷卵巢癌的應(yīng)用前景。

2.2.2 糖相關(guān)分子5——人附睪蛋白4 HE4是相對分子質(zhì)量為23 000 ~ 27 000的糖蛋白，N末端帶有一段疏水性信號肽，第15號氨基酸為N-糖基化位點(diǎn)。在上皮性卵巢癌中，作為分泌型糖蛋白，HE4常常上調(diào)表達(dá)[44-46]。在良性婦科疾病以及低惡化潛能腫瘤條件下，HE4表達(dá)水平低于MUC16。在某些子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌中未檢測到MUC16的表達(dá)，但是卻能檢測到HE4的表達(dá)。2008年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了HE4酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（enzyme immunoassay，EIA）檢測試劑盒作為卵巢癌檢測的方法學(xué)手段，底物檢測濃度在15 ~ 900 pmol · L-1之間[47]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，以HE4作為卵巢癌檢測標(biāo)志物，其特異性顯著高于標(biāo)志物MUC16（93%vs78%）。此外，在早期卵巢癌鑒定中，HE4要優(yōu)于MUC16[48]。2011年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)將HE4和MUC16聯(lián)合使用的方法，即卵巢惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)算法（risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA），用于鑒定在出現(xiàn)卵巢附件腫塊女性患者中發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的可能性，ROMA測試檢測早期和晚期卵巢癌的能力均優(yōu)于單個生物標(biāo)志物[49-51]。盡管已經(jīng)明確HE4是糖基化修飾的蛋白，但糖組學(xué)對于HE4功能的調(diào)控目前仍不清楚，HE4糖型結(jié)構(gòu)對于卵巢癌診斷和預(yù)后的意義需要更深入的探索[52-53]。

2.3 乳腺癌相關(guān)糖蛋白標(biāo)志物分子

2.3.1 糖相關(guān)分子6——MUC1 MUC1又被稱為癌癥抗原15-3（CA15-3），是一種由多數(shù)腺上皮細(xì)胞表達(dá)的跨膜黏蛋白，帶有高度O-糖基化修飾。許多類型癌細(xì)胞的表面均發(fā)現(xiàn)有MUC1表達(dá)[54]，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌。脫落入血的MUC1可以被多種抗黏蛋白抗原的單克隆抗體檢測到，這些單克隆抗體可以識別MUC1分子的不同部位[55-57]。盡管將MUC1單獨(dú)作為標(biāo)志物進(jìn)行癌癥篩查缺乏特異性，但目前在乳腺癌的診斷中將MUC1和其他血清標(biāo)志物共同作為檢測指標(biāo)。

乳腺癌病人血清MUC1糖基化的變化提示癌癥早期診斷的可能。與健康組織中的MUC1相比，乳腺惡性腫瘤中MUC1的糖基化程度更高，帶有異常O-連接寡糖的MUC1肽片段從上皮細(xì)胞表面脫落并分泌到血清中。利用HPLC對進(jìn)入血清的O-聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)[58]，Core1型O-聚糖結(jié)構(gòu)占83%，Core2型O-聚糖結(jié)構(gòu)占17%，且大部分O-聚糖都帶有較高程度的唾液酸修飾。另外，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MUC1截短化的聚糖結(jié)構(gòu)帶有短的唾液酸側(cè)鏈修飾，包括Thomsen-Friedenreich抗原（T抗原）、Tn抗原，以及它們各自的被唾液酸修飾的衍生物——sTn和α-2，6-唾液酸化的T抗原。由于MUC1抗原在腫瘤組織大量表達(dá)且糖基化異常，因此腫瘤相關(guān)的糖肽和表位被認(rèn)為是腫瘤免疫治療和免疫診斷的具有吸引力的靶點(diǎn)，目前正在進(jìn)行深入研究[59-61]。

2.3.2 糖相關(guān)分子7——人表皮生長因子受體2 HER2又稱CD340，由基因ERBB2編碼。它是相對分子質(zhì)量為185 000的糖蛋白，包括3個結(jié)構(gòu)域：相對分子質(zhì)量為105 000的胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain，ECD）、跨膜親脂性片段，以及具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。ECD可以從HER2受體上經(jīng)切割脫落進(jìn)入血液[62]。HER2在20% ~ 30%的乳腺癌病人中高表達(dá)，引起侵襲性腫瘤類型的產(chǎn)生，導(dǎo)致生存率降低，可以作為單抗治療或其他療法的靶點(diǎn)。HER2 ECD與MUC1聯(lián)合檢測在乳腺癌早期階段鑒別高風(fēng)險(xiǎn)乳腺癌病人具有參考價(jià)值。這2個在較差無病生存期的獨(dú)立的指示物，可以用來鑒定哪些病人需要更積極療法和加強(qiáng)監(jiān)測。血清和腫瘤組織的HER2濃度具有相關(guān)性，另外血清HER2濃度也反映病人對化療的應(yīng)答。HER2 ECD含有多個潛在糖基化位點(diǎn)，但其聚糖結(jié)構(gòu)不明確，有待深入探索。

2.4 結(jié)直腸癌相關(guān)糖蛋白標(biāo)志物分子

2.4.1 糖相關(guān)分子8——癌胚抗原 CEA相對分子質(zhì)量為180 000，屬于免疫球蛋白超家族，是糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白，固定在細(xì)胞表面。正常情況下，CEA在胎兒發(fā)育期間，由胃腸道組織的黏膜細(xì)胞產(chǎn)生，在孕中期第19周濃度達(dá)到最高（80 ~ 100 μg · L-1），足月新生兒體內(nèi)降低（至50 μg · L-1）。妊娠期間，CEA在母體血清中不會升高，因?yàn)樗粫┻^胎盤，并且在健康的成年男女血清中僅以非常低的濃度存在（小于2.5 μg · L-1）。在重度吸煙人群中或在某些病理?xiàng)l件下，如結(jié)直腸癌、胃癌等，血清CEA濃度可以達(dá)到5 μg · L-1。因?yàn)镃EA的濃度升高要比其他臨床指標(biāo)早數(shù)月，所以CEA常被用作結(jié)直腸癌分期、監(jiān)測手術(shù)切除后結(jié)腸癌復(fù)發(fā)或擴(kuò)散的標(biāo)志物。

與野生型細(xì)胞株相比，在CD44雙敲低的結(jié)腸癌細(xì)胞系LS174T細(xì)胞中表達(dá)的CEA帶有高度的唾液酸和巖藻糖修飾，而且與選凝素（selectin）的親合力增加，提示這些糖型變化與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)。在CEA分子中，N-連接的寡糖相對分子質(zhì)量占其50%以上，這也進(jìn)一步提示糖基化修飾以及糖型變化對癌癥診斷具有一定的重要意義。

2.4.2 糖相關(guān)分子9——金屬蛋白酶組織抑制劑-1 TIMP-1是相對分子質(zhì)量為28 000左右的分泌型糖蛋白，其主要包括2個結(jié)構(gòu)域：N末端結(jié)構(gòu)域具有基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制活性，C末端結(jié)構(gòu)域和CD63相互作用，誘導(dǎo)β1整合素的構(gòu)象活化，激活MAPK信號通路。TIMP-1主要功能是作為MMP抑制劑，調(diào)控MMP的蛋白水解活性，促進(jìn)腫瘤生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1以非MMP依賴性的方式，調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖[63]。TIMP-1異常的β-1，6-N-乙酰氨基葡萄糖和多聚乳糖胺表達(dá)以及唾液酸修飾增多被報(bào)道與癌細(xì)胞侵襲和遷移有關(guān)[64]。

TIMP-1被認(rèn)為可以作為結(jié)直腸癌（CRC）的早期檢測指示物。Holten-Andersen等[65]研究發(fā)現(xiàn)，血清中當(dāng)設(shè)置特異性為98%時(shí)，使用TIMP-1鑒定結(jié)腸癌的敏感性為63%，鑒定直腸癌的敏感性為36%；當(dāng)設(shè)置特異性為95%時(shí)，使用TIMP-1鑒定結(jié)腸癌的敏感性為65%，鑒定直腸癌的敏感性為42%。

2.5 胰腺癌相關(guān)聚糖標(biāo)志物分子

2.5.1 糖相關(guān)分子10——癌癥抗原CA19-9 1979年，CA19-9首次被描述為被單克隆抗體NS-19-9識別的腫瘤抗原[66]，在血清中主要以唾液黏蛋白形式存在，是一種唾液酸化的Lea（sLea）血型物質(zhì)，在由內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來的多種上皮類惡性腫瘤中可見增高，以胰腺癌增高最為顯著，是胰腺癌最重要且應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物之一。因此，CA19-9主要同其他標(biāo)志物（如CEA）聯(lián)合使用進(jìn)行胰腺癌的檢測和管理[67]。在用其他方法獲得其他證據(jù)之前，CA19-9表達(dá)量增加是患胰腺癌最主要的標(biāo)志。CA19-9檢測最大的不利之處在于，sLea結(jié)構(gòu)并不是胰腺癌組織特異性表達(dá)的，另外在一些健康人體血清中也能檢測到低濃度CA19-9。目前，CA19-9除了作為胰腺癌的檢測標(biāo)志物外，還作為HCC和膽管癌的預(yù)后標(biāo)志物。HCC患者中CA19-9血清濃度超過100 U ·mL-1，提示總生存期較差；而在膽管癌患者中，血清CA19-9濃度超過150 U · mL-1，說明總體生存期較差。

2.5.2 糖相關(guān)分子11——唾液酸化的腫瘤相關(guān)抗原Brian B. Haab實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種新型胰腺癌檢測標(biāo)志物——sTRA[68-69]。在一項(xiàng)涉及38例病人的試驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)sTRA在胰腺臨近腫瘤組織中表達(dá)量升高。對CA19-9和sTRA雙重染色細(xì)胞數(shù)多的患者，手術(shù)后的腫瘤進(jìn)展時(shí)間更長。腫瘤進(jìn)展時(shí)間短（少于2年）的患者或雙染色細(xì)胞數(shù)少，或單染色細(xì)胞含量高。這種區(qū)分短腫瘤進(jìn)展時(shí)間和長腫瘤進(jìn)展時(shí)間的模式，敏感性為90%，特異性達(dá)到80%[70]。另外，相對于sTRA未升高患者，sTRA升高的癌癥病人更有可能對化療產(chǎn)生耐藥。因此對胰腺癌病人而言，sTRA的檢測可以幫助指導(dǎo)用藥。

2.6 前列腺癌相關(guān)糖蛋白標(biāo)志物分子

PSA又被稱作激肽釋放酶3（kallikrein-3，KLK3），已被廣泛用于篩選男性前列腺癌。PSA是激肽釋放酶家族成員，由前列腺上皮細(xì)胞和尿道旁腺分泌。它是相對分子質(zhì)量為28 400 的糖蛋白，帶有一個糖基化位點(diǎn)，根據(jù)是否被糖基化修飾可分為糖基化亞型多肽和非糖基化亞型多肽（gp28/p26、gp22/p20、gp18/p16和gp12/p10）[71]。

在一些前列腺疾病[如前列腺炎、前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、前列腺癌等]中，前列腺上皮破損會導(dǎo)致PSA擴(kuò)散進(jìn)入上皮周圍組織，引起循環(huán)系統(tǒng)中PSA濃度上升。健康男性血清PSA維持較低濃度（40歲之前低于2.5 μg · L-1，70歲以后為6.5 μg · L-1左右），濃度高于4 μg · L-1提示前列腺癌或前列腺增生。血清PSA篩查結(jié)合直腸指檢（digital rectal exam，DRE）和前列腺活檢標(biāo)本的Gleason分級已被FDA批準(zhǔn)用于前列腺癌的早期檢測[72]。對于前列腺癌與前列腺增生的常規(guī)鑒別診斷主要是區(qū)分兩者PSA糖型的微不均一性[73-74]。

有研究報(bào)道，前列腺癌病人血清中PSA巖藻糖基化和唾液酸化修飾發(fā)生變化[75-76]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與血清中PSA相比，巖藻糖基化PSA能更好區(qū)分侵襲性前列腺癌和非侵襲性前列腺癌[77]。與健康人相比，前列腺癌病人血清PSA上的N-聚糖末端的半乳糖殘基被唾液酸殘基以α-2，3-糖苷鍵連接修飾[78-79]，增強(qiáng)了與識別α-2，3-唾液酸的凝集素Maackia amurensis agglutinin（MMA）的結(jié)合作用[80]。Yoneyama等[81]開發(fā)了一種利用磁性微珠免疫試驗(yàn)檢測末端α-2，3-唾液酸化的PSA的方法，對于前列腺癌的診斷敏感性達(dá)到90.2%，特異性達(dá)到64.2%。

3 糖相關(guān)分子介導(dǎo)多種病原體感染

許多細(xì)菌病原體和宿主間存在著聚糖介導(dǎo)的相互作用，這些聚糖結(jié)構(gòu)與細(xì)菌黏附、侵襲和免疫逃逸相關(guān)，還可以作為毒素受體分子。一些細(xì)菌病原體通過糖苷酶修飾更改宿主聚糖結(jié)構(gòu)，暴露結(jié)合靶點(diǎn)、降解宿主聚糖或改變宿主糖蛋白功能。凝集素、聚糖和黏蛋白矩陣等鑒定結(jié)果表明，細(xì)菌與宿主間由聚糖介導(dǎo)的相互作用，對病原體定植、持續(xù)性感染和致病等至關(guān)重要。病毒附著在細(xì)胞表面受體上是感染的第一步。許多哺乳動物病毒能夠識別細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂上的聚糖結(jié)構(gòu)。盡管聚糖是哺乳動物細(xì)胞普遍存在的成分，但其末端結(jié)構(gòu)在不同細(xì)胞以及不同組織間存在著差異，這種差異造成了病毒感染不同組織和不同物種的趨向性。

3.1 多種凝集素分子介導(dǎo)細(xì)菌感染

3.1.1 糖相關(guān)分子13——FimH和糖相關(guān)分子14——UclD 大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）是一種重要的人類病原體，可引起多種疾病，包括腸炎、尿路感染（urinary tract infection，UTI）和腦膜炎等。例如尿路致病性大腸埃希菌（uropathogenicE.coli，UPEC）是UTI的主要病原[82]。大腸埃希菌通過幾種不同類型的菌毛（pili）黏附到宿主表面這些菌毛的結(jié)合特異性決定了宿主和組織的趨向性。1型菌毛的末端帶有凝集素FimH，介導(dǎo)與宿主細(xì)胞表面甘露糖的結(jié)合[83]。定殖于大腸的大腸埃希菌上的FimH偏向于結(jié)合單甘露糖基化的聚糖結(jié)構(gòu)，而尿路感染相關(guān)的大腸埃希菌偏向于結(jié)合甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)。UPEC對甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)的偏好性已被用于開發(fā)甘露糖衍生藥物進(jìn)行FimH的拮抗治療。

另一種大腸埃希菌菌毛黏附素UclD，具有凝集素功能。UclD凝集素結(jié)構(gòu)域與結(jié)腸上皮細(xì)胞結(jié)合，用O-糖苷酶預(yù)處理以除去上皮細(xì)胞上O-連接的聚糖后，這種結(jié)合作用受到抑制，表明UclD與宿主細(xì)胞上的1個或多個O-連接的聚糖相互作用。

3.1.2 糖相關(guān)分子15——BabA和糖相關(guān)分子16——SabA 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H. pylori）為革蘭陰性菌，定殖于人體胃黏膜。有1% ~ 3%陽性感染者最終發(fā)展為胃癌。人體胃黏膜和上皮層細(xì)胞被高度糖基化，幽門螺桿菌通過2種凝集素結(jié)合糖基化結(jié)構(gòu)，即BabA[84]和SabA[85]。

BabA特異性識別巖藻糖基化修飾的聚糖結(jié)構(gòu)（如Lewis B），這種類型的聚糖結(jié)構(gòu)可表達(dá)在胃上皮細(xì)胞表面。BabA介導(dǎo)的黏附具有pH依賴性，在較高pH環(huán)境中具有較強(qiáng)的黏附能力。SabA對唾液酸修飾的Lewis X（sLex）和唾液酸化的Lewis A（sLea）結(jié)構(gòu)具有特異性。在健康人體胃黏膜表面只表達(dá)低水平唾液酸結(jié)構(gòu)。當(dāng)幽門螺桿菌建立慢性感染后，黏膜表面的唾液酸表達(dá)水平升高，表明幽門螺桿菌會影響宿主胃部糖組學(xué)結(jié)構(gòu)。

3.2 聚糖介導(dǎo)病毒感染

3.2.1 糖相關(guān)分子17——人類組織血型抗原 輪狀病毒（rotavirus，RV）是引起嬰兒腹瀉病的常見病原體。RV感染宿主細(xì)胞的第一步，是由病毒VP4刺突蛋白上的VP8*結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)結(jié)合細(xì)胞表面的聚糖。RV識別不同類型HBGA，造成病毒感染人體宿主或動物宿主的差異。P[ 14]型RV能夠特異性結(jié)合A型HBGA結(jié)構(gòu)[86]，這種結(jié)構(gòu)在偶蹄類動物和人體中都存在，這可能是P[ 14]型RV產(chǎn)生種間傳播的基礎(chǔ)。Liu等[87]報(bào)道了1株P(guān)[ 19]型RV，能夠感染動物（如豬），卻不感染人體。P[ 19]型RV不但能結(jié)合HBGA中的三糖結(jié)構(gòu)（Gal-β-1，3-GlcNAc-β-1，3-Gal），也能結(jié)合黏蛋白核心結(jié)構(gòu)2、4和6亞型中的核心二糖（GlcNAc-β-1，6-GalNAc）。另外，P[ 19]型RV結(jié)合聚糖矩陣分析顯示，在三糖Gal-β-1，3-GlcNAc-β-1，3-Gal末端添加α-1，3-半乳糖、α-1，3-N-乙酰氨基半乳糖或α-1，2-巖藻糖（即H型HBGA），會增強(qiáng)識別信號，而Lewis表位的α-1，4-巖藻糖會阻斷識別信號。這個現(xiàn)象可以解釋P[ 19]型RV很少會感染人體。因?yàn)?0%以上人群都是Lewis陽性，只有10%左右是Lewis陰性的HBGA型人群。另有報(bào)道，P[ 4]、P[ 6]和P[ 8]型RV主要結(jié)合H型HBGA[88]。

3.2.2 糖相關(guān)分子18——末端唾液酸 目前，已經(jīng)報(bào)道的腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）分離株超過100種，其中感染人類和其他靈長類的AAV血清型有13種（AAV1-13）。由于它們都能夠?qū)⑼庠椿虬b運(yùn)輸至不同類型組織而不引起疾病，因此目前被批準(zhǔn)開展基因療法的相關(guān)研究[89]。不同AAV在序列上有60% ~ 90%的一致性，在體內(nèi)外顯示出不同的細(xì)胞趨向性、組織趨向性及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。據(jù)報(bào)道，病毒感染細(xì)胞的能力和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的效率，決定于病毒衣殼識別細(xì)胞表面聚糖的特異性。AAV1能夠結(jié)合N-聚糖上連接的α-2，3-和α-2，6-唾液酸[90]；AAV2、AAV3和AAV13結(jié)合硫酸類肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）[91]；AAV4結(jié)合O-聚糖上的α-2，3-唾液酸；AAV5結(jié)合N-聚糖上的α-2，3-唾液酸[92]；AAV6既能結(jié)合硫酸類肝素，也能結(jié)合N-聚糖上的α-2，3-和α-2，6-唾液酸[93]；AAV9主要結(jié)合N-聚糖末端半乳糖[94]；AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12結(jié)合聚糖的研究正在進(jìn)行中。

3.2.3 糖相關(guān)分子19——唾液酸-α-半乳糖 甲型流感病毒屬于正黏病毒科，是引起季節(jié)性流感的主要病原體。病毒糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）結(jié)合宿主上皮細(xì)胞上的唾液酸化的聚糖受體分子是病毒感染和傳播的啟動步驟。研究報(bào)道，HA從對唾液酸-α-2，3-半乳糖的結(jié)合特異性轉(zhuǎn)換至對唾液酸-α-2，6-半乳糖的結(jié)合特異性，是甲型流感病毒從感染禽宿主轉(zhuǎn)變?yōu)楦腥救怂拗鞯年P(guān)鍵因素。另外，除唾液酸的連鍵方式外，內(nèi)部糖類分子也會影響病毒結(jié)合特異性。Gambaryan等[95]發(fā)現(xiàn)人流感病毒HA對唾液酸-α-2，6-半乳糖-β-1，4-GlcNAc和唾液酸-α-2，6-半乳糖-β-1，4-Glc這2種聚糖結(jié)構(gòu)有不同的結(jié)合能力。另外有研究發(fā)現(xiàn)，不同屬源的禽流感病毒能共同識別α-2，6-唾液酸化的聚糖結(jié)構(gòu)，但是額外的聚糖修飾會引起結(jié)合能力的差異[96]。

4 人體糖蛋白甘露糖糖苷酶活性受限或表達(dá)水平異常與疾病的關(guān)系

自然界中存在多種特異性糖苷酶，能對不同類型聚糖進(jìn)行剪切[97-98]。人體細(xì)胞內(nèi)糖蛋白或分泌型糖蛋白，其N-聚糖從高甘露糖型加工至復(fù)合型或雜合型，是糖蛋白定位或黏附的關(guān)鍵步驟，gpM是該過程的重要參與者。gpM相關(guān)基因突變會引起gpM活性喪失，引起遺傳性疾病。目前針對gpM基因缺陷的治療手段包括基因療法、干細(xì)胞移植和酶替代療法等。

4.1 糖蛋白甘露糖糖苷酶系統(tǒng)的生物學(xué)功能

每一個細(xì)胞都有自己獨(dú)特的gpM系統(tǒng)。gpM系統(tǒng)由不同的gpM組合而成，在胞內(nèi)胞外發(fā)揮作用。生理?xiàng)l件下，gpM系統(tǒng)主要參與內(nèi)源糖蛋白聚糖水解加工、內(nèi)源糖蛋白正確折疊為二級結(jié)構(gòu)，以及外源糖蛋白聚糖降解等重要的生物學(xué)過程。在病理?xiàng)l件下，人體內(nèi)gpM相關(guān)基因缺陷會造成遺傳性疾病，其表達(dá)水平異?？赡芤鹉[瘤的發(fā)生和發(fā)展。

首先，gpM參與內(nèi)源糖蛋白聚糖的水解加工，人體中糖蛋白N-糖基化修飾是一個多步驟過程，其中g(shù)pM對含有甘露糖的聚糖剪切加工，形成不同的蛋白寡糖鏈。高甘露糖型聚糖，即富含多個（5 ~ 9個）甘露糖的聚糖，代表著糖蛋白糖基化修飾的早期階段[99]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體經(jīng)過gpM修剪至僅帶有5個甘露糖殘基（見圖1），隨后再被N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸等進(jìn)行修飾。

其次，gpM系統(tǒng)參與內(nèi)源糖蛋白質(zhì)控。錯誤折疊的糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中降解，該降解過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）[100]。ERAD需 要MAN1A1和MAN1B1參與，切除糖蛋白聚糖上3 ~ 4個α-1，2-連接的甘露糖，末端甘露糖的切除是糖蛋白靶向進(jìn)入ERAD途徑的信號[101]（見圖2）。高表達(dá)MAN1A1可以加快ERAD底物的降解速度，而敲低MAN1A1會使ERAD降解過程處于靜止?fàn)顟B(tài)[102]。

此外，gpM還參與外源糖蛋白聚糖的降解。外源糖蛋白進(jìn)入溶酶體內(nèi)被降解時(shí)，溶酶體α-gpM（MAN2B1與MAN2B2）以及β-gpM（MANBA）分別負(fù)責(zé)對糖蛋白上的α-甘露糖和β-甘露糖進(jìn)行切除（見圖3）。被釋放的甘露糖可被運(yùn)出溶酶體，重新用于內(nèi)源性糖蛋白上聚糖的合成[103]。

圖 1 人體糖蛋白甘露糖糖苷酶系統(tǒng)對糖蛋白進(jìn)行糖基化修飾的過程Figure 1 The process of glycosylation modification of glycoprotein by gpM system

圖 2 糖蛋白甘露糖糖苷酶系統(tǒng)參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解過程Figure 2 The endoplasmic reticulum-associated degradation process involving gpM system

圖 3 溶酶體中糖蛋白甘露糖糖苷酶對糖蛋白N-聚糖中甘露糖的降解過程Figure 3 The degradation process of N-glycan in glycoprotein by lysosomal gpM

4.2 糖蛋白甘露糖糖苷酶基因缺陷或表達(dá)異常引起的疾病

4.2.1 糖 相 關(guān) 分 子20——MAN1B1 MAN1B1是一種α-1，2-gpM，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)負(fù)責(zé)將N-聚糖前體結(jié) 構(gòu)Man9GlcNAc2中 間 分 支 的 末 端α-1，2-甘 露糖切除（見圖2），產(chǎn)生Man8GlcNAc2結(jié)構(gòu)。有報(bào)道稱，MAN1B1還能作為錯誤折疊蛋白檢查點(diǎn)（checkpoint），以及作為凝集素，在錯誤折疊蛋白進(jìn)入降解途徑前將其回收重新進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)再修飾加工[104]。gpM基因MAN1B1缺陷會引起MAN1B1型CDG[104]，主要癥狀表現(xiàn)為智力障礙、動作遲緩、肌張力減退和軀體肥胖等，其他癥狀包括輕微面部畸形，關(guān)節(jié)活動異常和皮膚松弛[105]。

4.2.2 糖相關(guān)分子21——MAN2B1和糖相關(guān)分子22——MANBA MAN2B1能將大部分α-1，2-、α-1，3-和α-1，6-糖苷鍵連接的甘露糖從N-聚糖上切除，而MANBA負(fù)責(zé)切除β-1，4-甘露糖，兩者是溶酶體糖蛋白降解的重要參與者。溶酶體中g(shù)pM缺陷會引起糖蛋白降解受阻，使得所有組織中都會產(chǎn)生甘露聚糖的積累，最終損傷細(xì)胞功能，引起細(xì)胞凋亡，這種癥狀被稱為甘露糖苷貯積癥[106]。MAN2B1缺陷引起α-甘露糖苷貯積癥，癥狀包括智力障礙、聽力受損、運(yùn)動機(jī)能失調(diào)、面部粗陋和肌肉骨骼畸形等[107]；MANBA缺陷引起β-甘露糖苷貯積癥，癥狀除智力障礙和聽力受損外，還包括上呼吸道反復(fù)感染，血管角質(zhì)瘤和肝脾腫大等[108]。

4.2.3 糖相關(guān)分子23——MAN2B2 溶酶體中的gpM——MAN2B2負(fù)責(zé)降解核心四糖Man2GlcNAc2中α-1，6-連接的核心甘露糖。目前已有報(bào)道在p.Asp38Asn錯義突變體病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量Man2GlcNAc2積累，提示末端α-1，6-甘露糖的存在。Asp38位于鋅結(jié)合域，其突變體可能引起MAN2B2失活。MAN2B2突變體病人出現(xiàn)免疫缺陷、免疫失調(diào)、斜視和神經(jīng)發(fā)育障礙等癥狀[109]。

5 結(jié)語

蛋白的糖基化修飾，是一類特殊的翻譯后修飾。其主要特點(diǎn)，是在糖鏈與蛋白共價(jià)連接后，在糖鏈上發(fā)生的再修飾。此糖鏈再修飾過程，涉及到上百種不同功能的基因，產(chǎn)生了多種結(jié)構(gòu)及功能不同的糖鏈。我們認(rèn)為，共價(jià)聯(lián)接在糖蛋白上的糖鏈，可載有物種特異[110]、組織特異、生理特異及病理特異的生物快速識別信號（biological quick recognition signal），是一種獨(dú)立于DNA、RNA及蛋白的新的生物信號。本文的主要關(guān)注點(diǎn)，是糖鏈在病理及藥學(xué)研究中的近況及展望。

研究已表明，糖蛋白和聚糖參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[111]，癌細(xì)胞相關(guān)糖基化異常為新診斷和新治療提供了新的切入點(diǎn)[112]。位于細(xì)胞表面的糖鏈及識別蛋白，在病原體黏附、定植和侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用，已成為重要的藥物靶點(diǎn)。具有類似凝集素競爭性結(jié)合功能的糖類分子，可用于抑制HIV、Ebola病毒和UPEC等病原體的感染。毒性小、特異性強(qiáng)的糖相關(guān)分子，將是未來抗感染藥物的新的競爭點(diǎn)。真核生物50%以上蛋白為糖基化修飾蛋白[113]，聚糖分子在維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的同時(shí)，決定蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位及胞外的靶向輸送。包括gpM在內(nèi)的多種糖苷酶維持人體內(nèi)糖基化修飾過程，對這一領(lǐng)域的探索，將為先天性（如CDG等罕見?。⑦z傳性及后天繼發(fā)性的功能缺失類疾病，打開一個新的窗口。