王蕾，李維泉，陳力，陳萃英*

（1. 先思達生物科技有限公司，江蘇 南京 211800；2. 復旦大學上海醫(yī)學院教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032）

糖基化修飾是蛋白質翻譯后修飾的重要形式，約70%的蛋白需要經(jīng)過糖基化修飾后，轉移到細胞膜或分泌到細胞外行使功能。在真核生物中，蛋白上的糖鏈共價連接到天冬酰胺、蘇氨酸或絲氨酸殘基上，參與蛋白的翻譯后折疊和質控[1]。此外，糖鏈還可以連接到脂質分子上，甚至RNA上[2]。在多細胞生物中，糖鏈廣泛參與受精、發(fā)育、生長、分化以及免疫等生命過程中[3]。

糖組泛指在特殊的時間、空間和環(huán)境下細胞和組織產(chǎn)生的所有糖鏈的集合[4]。對比基因組、轉錄組和蛋白組的蓬勃發(fā)展，糖組研究受限于分析技術。近20年來，由于分析技術的突飛猛進，糖組的研究也開始進入爆發(fā)期[5]。包括質譜（MS）、毛細管電泳（CE）、高效液相色譜（HPLC）和凝聚素芯片等在內(nèi)的新技術，推動了肝臟糖鏈新標志物在疾病領域的臨床應用。

肝病診斷中仍然存在著許多挑戰(zhàn)。以肝癌為例，α-甲胎血清蛋白（AFP）仍然是臨床肝癌檢測最常用的血液標志物，其特點在于特異度高（80% ~94%），而靈敏度有限（25% ~ 65%）。進一步研究表明，AFP的糖基化物即AFP異質體（AFP-L3）在肝細胞癌（HCC）患者血清中的改變更具特異性，也成為肝癌早期診斷的血清標志物[6]。近年來，異常凝血酶原（PIVKA-II）也逐漸在肝癌的診斷中發(fā)揮作用，并與AFP在臨床使用中互補，但是其臨床效能需要進一步驗證[7-8]。指南上推薦的基于液體活檢方案的微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）、循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）技術作為潛在的肝癌標志物[9-10]，其臨床使用受限于樣本量、檢測周期和成本等因素。

本篇綜述旨在總結肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中，糖組作為標志物在肝臟疾病的早期診斷、治療效果監(jiān)測和預后評估中的潛力和最新進展。

1 人血清中糖組的穩(wěn)定性

生理條件下，糖蛋白主要來源于肝臟與免疫細胞[11]。對血液中主要糖蛋白的定量和糖型分析顯示，血液中蛋白總量為70 ~ 75 g · L-1，其中非糖基化的白蛋白約為40 g · L-1。糖基化的蛋白中，免疫球蛋白（Ig）家族中Ig G在血清中平均能達到約12 g · L-1，Ig A和Ig M在血清中濃度約為4 g · L-1，Ig E和Ig D在血清中含量較低。除Ig之外，包括纖維蛋白原、結合珠蛋白、酸性糖蛋白和載脂蛋白等在內(nèi)的肝臟分泌蛋白約能占到14 g · L-1[11]。

糖鏈的合成、降解和轉運，涉及到至少250種不同的糖基轉移酶參與其中，在基因和轉錄水平上都受到了嚴格的調(diào)控[12]。糖鏈合成相關基因或調(diào)控元件的突變，會導致一系列的先天性糖基化障礙綜合征，從而發(fā)生胚胎致死，或因嬰幼兒時期多系統(tǒng)的發(fā)育遲緩和多臟器功能衰竭導致的早夭。對患者血液及組織水平上的蛋白糖基化研究，均觀察到了糖基化的顯著變化[13]。

除了受遺傳因素導致的蛋白糖基化改變外，異常糖基化還與包括衰老、腫瘤、感染和自體免疫性疾病在內(nèi)的生理病理改變密切相關[14-15]。人群隊列的研究表明，糖基化水平與年齡、性別和疾病等生理因素相關，但不受血糖水平、飲食習慣、社會經(jīng)濟地位等生理和非生理因素的影響[16]。個體水平上，血液中蛋白的糖基化水平穩(wěn)定[17]。以上研究，為糖鏈/糖組作為疾病的標志物奠定了基礎。

2 肝臟疾病相關糖型

糖型與腫瘤的發(fā)生密切相關，大量報道都觀察到了在肝病尤其是乙型肝炎病毒相關的肝癌患者組織和血清樣本中的特征糖型——巖藻糖、多分支、二平分N-乙酰葡糖胺、唾液酸等糖型的變化（見圖1）[6]。

圖 1 肝病相關糖型合成通路Figure 1 Synthetic pathway of live disease-related glycan

2.1 巖藻糖糖型

巖藻糖基化的改變是由巖藻糖基轉移酶（FUT）缺乏或過度表達所致，在肝病尤其是肝癌中，可觀察到核心巖藻糖基化和分支巖藻糖基化水平的升高。且基因組分析顯示，負責核心巖藻糖基化的糖基轉移酶FUT8的基因在HCC樣本中過度表達，與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝癌患者的血清和肝組織中可觀察到蛋白過度核心巖藻糖基化[19-22]。在非酒精性脂肪肝患者中，巖藻糖基化的結合珠蛋白顯著升高，并與肝細胞的氣球樣變相關[19]。研究人員比較了健康對照組和肝硬化患者血漿中的Ig G蛋白和其他血清蛋白質，均發(fā)現(xiàn)雙天線糖型、三天線糖型和四天線糖型的巖藻糖基化水平升高了約2倍[21]。巖藻糖基化N-聚糖，如核心α-1，6-巖藻糖基化三天線聚糖，在包括HCC在內(nèi)的晚期肝病患者的血清中顯著升高[22]。

巖藻糖基化的標志物AFP-L3（即AFP上修飾了核心巖藻糖基化的糖型）在臨床實踐中展示了對早期肝癌的診斷效能[23-24]。在肝癌的組織病理樣本中，應用N-糖基化的質譜成像分析也觀察到了巖藻糖糖型的顯著升高，顯示其在肝癌診斷中的潛在價值[25]。

2.2 多分支糖型

與未患肝癌患者的樣本相比，研究人員在肝癌患者的組織以及血清樣本中也發(fā)現(xiàn)了高分支糖鏈的異常改變。多分支糖型的增加主要由N-乙酰葡糖胺基轉移酶Ⅴ（N-acetylglucosaminyltransferase Ⅴ，GnT-Ⅴ）的上調(diào)引起[26]。

在嚴重的肝硬化患者中，研究人員觀察到α1-抗胰凝乳蛋白酶（AAT）的雙天線寡糖減少[27]。并且，在肝硬化和肝癌患者中，AFP和AAT蛋白均出現(xiàn)了多分支的聚糖變化[28]，以及四天線寡糖鏈水平的增加[29]。多分支糖型的改變同樣也在肝癌患者的組織病理樣本中被觀察到[25]。

編者按：2018年是中國改革開放四十周年。四十年來，上?；ば袠I(yè)發(fā)展由封閉向開放，由簡單初級向綠色高端，由傳統(tǒng)要素投入向科技創(chuàng)新驅動加快轉變的40年。四十年來，上海化工人眾志成城、砥礪奮進、艱難探索，實現(xiàn)了上海石化產(chǎn)業(yè)的跨越式發(fā)展。四十年的歷史值得記載，四十年的經(jīng)驗值得總結，四十年的春華秋實，讓人感慨。本刊特開辟紀念專欄，向讀者介紹上海石化產(chǎn)業(yè)改革發(fā)展的典型事例和成功經(jīng)驗，以饗讀者。

2.3 二平分N-乙酰葡糖胺糖型

二平分N-乙酰葡糖胺通過N-乙酰葡糖胺基轉移酶Ⅲ（N-acetylglucosaminyltransferaseⅢ，GnT-Ⅲ）轉移到核心五糖β連接的甘露糖上。與健康人、肝炎和肝硬化患者相比，肝癌患者血清樣本中的GnT-Ⅲ活性顯著升高，并在有效治療后出現(xiàn)下降[30]。

肝纖維化向肝硬化進展的過程中，MS和CE分析結果表明，除了巖藻糖基化的改變外，二平分N-乙酰葡糖胺糖型顯著增加[31]。并且，隨著肝硬化向肝癌轉變的過程中，二平分N-乙酰葡糖胺糖型出現(xiàn)下降，但依然高于健康組和肝纖維化組[32]。在肝癌患者樣本中，GnT-Ⅲ和GnT-Ⅴ都會升高，在競爭同一底物的過程中，GnT-Ⅲ的活性強于GnT-Ⅴ[33-35]。GnT-Ⅲ會一定程度上阻礙腫瘤的進展，而GnT-Ⅴ則會促進腫瘤進展[36-37]。

2.4 唾液酸糖型

唾液酸的高表達，伴隨著肝癌的發(fā)生和進展。在肝病尤其是HCC患者的組織和血清中也觀察到了α-2，3-和α-2，6-唾液酸轉移酶的異常變化。與正常肝臟和肝硬化肝臟相比，肝癌組織中α-2，6-唾液酸顯著過度表達[38]。與肝硬化患者相比，早期HCC患者血清中對氧磷酶1異質體的巖藻糖基化和唾液酸化水平顯著升高，表現(xiàn)出其在區(qū)分早期肝細胞癌和肝硬化患者中的潛力[39]。

3 血清糖組作為診斷標志物的效能

血清糖組檢測是一種評估肝臟狀態(tài)的非侵入性方法。通過糖組標志物的確定，建立相關的預測模型和方法，來預測和輔助診斷相關的疾?。òǜ卫w維化、肝硬化、肝癌），以及進行肝移植的過程監(jiān)測。

3.1 肝纖維化診斷標志物

肝纖維化是一個病理生理過程，多種致病因子會導致肝內(nèi)結締組織異常增生。對于乙型肝炎病毒感染引起的肝纖維化，由于病人體內(nèi)病毒長期存在，不斷刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應，最終導致肝細胞受損、凋亡。

Kam等[40]利用飛行時間質譜技術（MALDITOF）發(fā)現(xiàn)，N-糖組圖譜可作為乙型肝炎肝纖維化的診斷標志物，在17個N-糖相關的標志物中，通過線性回歸發(fā)現(xiàn)4個峰納入診斷模型，對于46例肝纖維化診斷的AUC達到0.912，靈敏度85%，特異度84%。隨后，Gui等[41]在173例乙型肝炎患者中，通過熒光CE技術獲得血清的N-糖組圖譜，發(fā)現(xiàn)N-糖鏈的變化與肝纖維化的分級顯著相關。該研究組用GlycoFibroTest算法獲得了診斷肝纖維化的AUC為0.740，略優(yōu)于肝纖四項（FibroTest）。同時，N-糖組圖譜對肝纖維化的診斷效能，在128例肝損傷病理結果確認的樣本中得到了驗證；且研究組進一步發(fā)現(xiàn)N-糖組圖譜在區(qū)分纖維化不同階段方面的潛力[42]。此后，Cao等[43]基于423例乙型肝炎肝纖維化患者的N-糖組圖譜的分析結果，建立了多參數(shù)的診斷模型，對于肝纖維化F0-F1/F2/F3/F4的分期效能分別為0.917、0.720和0.785。

3.2 肝硬化診斷標志物

乙型肝炎病毒感染后，肝臟經(jīng)歷損傷、產(chǎn)生纖維因子，使纖維母細胞合成膠原的作用增強，致使肝內(nèi)纖維組織不斷地增生，形成纖維包繞的異常肝細胞結節(jié)（假小葉），即形成肝硬化。

Callewaert等[31]基于熒光CE技術，分析丙型肝炎肝硬化病人的血清中蛋白糖組圖譜。該方法對于24例代償期肝硬化病例的靈敏度為79%，特異度為86%；對于24例失代償期肝硬化病例的診斷，達到了100%的靈敏度和特異度。與之一致，Kam等[40]利用MALDI-TOF獲得N-糖組圖譜，對46例乙型肝炎肝硬化診斷的AUC達到0.911，靈敏度88%，特異度83%。

3.3 肝癌的診斷標志物

由乙型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎、肝硬化、肝癌被眾多醫(yī)者比喻為肝癌“三部曲”。我國的肝癌患者約90%與慢性乙型肝炎病毒感染有關。85% ~ 95%的肝癌發(fā)生在肝硬化基礎上。

陳萃英研究組發(fā)現(xiàn)，與乙型肝炎肝硬化患者相比，乙型肝炎肝癌患者血清中的α-1，3-巖藻糖基化三天線寡糖增加，而二平分的核心α-1，6-巖藻糖基化二天線寡糖降低。針對這2個標志物建立的分析預測模型GlycoHCCTest對HCC患者的診斷準確率為81%，優(yōu)于常規(guī)的AFP檢測（對HCC患者的診斷準確率為50% ~ 60%）[32]。與此一致，Comunale等[44]報道了總血清的聚糖分析方法，其區(qū)分乙型肝炎肝硬化和乙型肝炎肝癌的AUC為0.851，靈敏度為73%，特異性為88%。并且，總血清聚糖分析方法與AFP檢測聯(lián)合應用時，對乙型肝炎肝癌的靈敏度在90%的特異性下可提高到95%。此后，Cong等[45]通過血清糖組中3個特征糖峰，建立了早癌預測模型Glycomics-EHCC。在247例患者中，該模型在臨界值為-0.39時，區(qū)分早期HCC與肝纖維化/肝硬化的靈敏度為84.6%，特異性為85.0%。此外，在67例早期HCC患者確診前6和12個月的樣本中，該模型預測早期HCC的靈敏度和特異性分別超過90%和85%。

3.4 肝移植過程的監(jiān)測

肝臟移植是終末肝病的最終治療手段，移植成功后的病人生存率較長。對于移植手術，移植肝臟的狀態(tài)直接影響移植結局。在一項肝臟移植手術中，研究人員前瞻性地對肝臟灌洗液進行糖組檢測，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝失能病例中出現(xiàn)特征的去唾液酸無半乳糖核心巖藻糖基化二天線N-聚糖，與移植的結局完全相符[46]，提示糖組檢測在肝移植過程監(jiān)測中的潛力。

4 糖組檢測方法

檢測技術的發(fā)展和進步，為糖組在各種疾病（特別是肝臟疾?。╊I域的基礎研究和臨床應用提供了強有力的支撐。從糖蛋白上釋放的糖鏈/糖組，可通過質譜（成像）、高效液相色譜和CE等技術對其進行直接分離和分析，或使用凝聚素芯片進行間接檢測。

質譜技術基于物質質荷比，對分子進行直接解析，在疾病標志物的發(fā)現(xiàn)中占有重要的位置。2010年后，質譜技術在糖肽和糖鏈分析中的顯著進步，推動了該技術在糖蛋白質組學和糖組學中的應用[47-48]。質譜技術具有高靈敏度、高覆蓋率和高分辨等優(yōu)勢。但是，設備、專業(yè)分析人員、復雜樣本預處理及結果穩(wěn)定性不佳等方面的因素，制約了質譜技術在臨床中的大規(guī)模應用[49]?；谫|譜技術的質譜成像技術，在包括肝癌在內(nèi)的腫瘤診斷中展現(xiàn)了巨大的價值[25]。質譜成像技術在病理切片樣本分析中的應用，展現(xiàn)了其無需標記、高靈敏和可反映分子的空間分布等優(yōu)勢。在未來的臨床應用中，高昂的平臺建設和復雜的前處理過程仍是需要解決的問題。高效液相色譜具有優(yōu)越的分離功能，常與質譜技術聯(lián)用，可將靈敏度提高至納克水平[50]。而單獨使用高效液相色譜時，仍需要對樣本進行相應前處理來獲得高質量的結果。

臨床應用場景中，操作簡單、靈敏、可靠和高通量是決定檢測能否大規(guī)模使用的先決條件。CE是以高壓電場為驅動力，分離不同構型糖鏈的方法。只需微量樣本，無需樣本預處理，即可對樣本進行高靈敏和高分辨率的檢測，且每次上機可以達到96個樣品的檢測通量[51]。

凝集素芯片是間接的糖組檢測方法，該方法系通過凝集素對特定寡糖結構、糖鍵和糖型的識別，檢測樣本間的糖組差異。對于各種天然/重組的凝集素的高需求、糖芯片定制的復雜性，以及特異度不高等因素，限制了該方法在臨床應用過程中的推廣[52]。

以上糖組檢測技術的方法、檢測原理、優(yōu)勢和現(xiàn)存問題如表1所示。CE技術因其操作簡單、無需樣本前處理、只需微量樣本、高靈敏等特性，目前正在臨床轉化過程中[53]。質譜（成像）、高效液相色譜和凝集素芯片技術則廣泛應用于實驗室研究中。在未來的技術發(fā)展過程中，降低儀器成本、簡化樣本預處理過程、提高樣本處理和分析自動化水平是糖組檢測技術的主要發(fā)展方向。

表 1 糖組檢測技術匯總Table 1 Glycome test techniques

5 結語與展望

在生理和病理過程中，糖鏈均發(fā)揮著重要的作用。糖鏈結構和數(shù)量的改變，與肝病尤其是肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。近幾十年的研究表明，血清糖組在肝纖維化、肝硬化和肝癌的診斷和預后中具有巨大潛力。

未來，血清糖組的臨床數(shù)據(jù)和進入臨床后的隨訪數(shù)據(jù)，將更清晰地為其在臨床病人管理、診斷、治療和預后中提供方向。此外，在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中，特征糖鏈的生物學意義將會得到闡明，為疾病的干預提供新的手段。

感染乙型肝炎病毒后，部分患者會經(jīng)歷肝炎、肝硬化，甚至肝癌的病程階段，需要終身隨訪和管理。如何對肝病進行全周期的管理，是一個重大挑戰(zhàn)。結合現(xiàn)有的臨床診斷和干預手段，我們也對肝病糖組寄以厚望，相信它能為臨床的決策提供新的信息和手段。