趙雅杰，趙軒微，田振東，胡樹平，包海柱

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

油用向日葵(HelianthusannuusL.)是世界上植物油的重要來源，油用向日葵貢獻(xiàn)了近3.3×107t的油籽產(chǎn)量，占世界總產(chǎn)量的8.5%[1]。我國是世界上重要的油用向日葵生產(chǎn)國和消費(fèi)國之一，其中以內(nèi)蒙古河套地區(qū)的種植面積和總產(chǎn)量居于首位。河套地區(qū)多年平均降水量為130～150 mm，蒸發(fā)量2 000～3 000 mm，屬于全國地表水資源缺乏的地區(qū)；加之近些年黃河灌溉水量配額下調(diào)的原因，農(nóng)業(yè)灌溉用水常顯不足，水資源短缺勢(shì)必將成為今后該地區(qū)油用向日葵生產(chǎn)的限制因子。非生物脅迫是世界上作物生產(chǎn)的主要限制因素[2-3]，因干旱脅迫每年約有超過30%的生產(chǎn)用地面臨減產(chǎn)，干旱造成的作物減產(chǎn)已超過其他逆境造成減產(chǎn)的總和[4]。有研究表明，干旱脅迫會(huì)干擾向日葵的生理過程和生化活性進(jìn)而影響向日葵的生長速度[5]，并導(dǎo)致葉面積指數(shù)、葉片相對(duì)含水量、生物產(chǎn)量、收獲指數(shù)以及油籽產(chǎn)量降低[6]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在植物逆境研究領(lǐng)域的應(yīng)用[7]，特別是高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，可以通過表型與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析用于闡明與水分脅迫反應(yīng)有關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]。已有研究表明，WRKY[9]、ERF[10]和NAC[11]等轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫條件下對(duì)植株抗逆性有一定作用。干旱脅迫下會(huì)引發(fā)植物的應(yīng)激反應(yīng)，如激素水平上的變化、氣孔關(guān)閉及功能基因的表達(dá)等[12]，這其中以脫落酸(ABA)被廣泛關(guān)注，ABA在植物應(yīng)對(duì)水分脅迫的能力中起主要作用[13]。王芳等[14]研究表明，干旱脅迫下外源ABA對(duì)玉米幼苗氧化損傷有保護(hù)作用。在缺水條件下，ABA作為一種重要的根源信號(hào)物質(zhì)，通過木質(zhì)部的運(yùn)輸和蒸騰到達(dá)葉片保衛(wèi)細(xì)胞并發(fā)出信號(hào)，表明植物根部正處于壓力狀態(tài)，進(jìn)而使蒸騰速率降低，葉片保衛(wèi)細(xì)胞的膨壓下降，最終引起氣孔關(guān)閉[15]。脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)首先需要識(shí)別脫落酸才能進(jìn)行后續(xù)的過程，PYR/PYR/RCAR蛋白被證明是ABA受體之一，處于ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的最上游，可以識(shí)別并結(jié)合ABA，且PP2C蛋白磷酸酶家族對(duì)ABA應(yīng)答起調(diào)控作用[16]。本研究以油用向日葵穩(wěn)定自交系為材料，研究了持續(xù)干旱和復(fù)水處理下的ABA表達(dá)水平，探討了脫落酸的變化與干旱脅迫的關(guān)系，以期為激素代謝差異基因的挖掘及激素與其他代謝途徑的互作關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為穩(wěn)定自交系17062(9D002)，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院油用向日葵研究室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院(40°48′N，111°42′E)日光溫室中進(jìn)行，采用盆栽方式進(jìn)行干旱脅迫，以田間土∶蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1∶1為栽培土壤，每盆5 kg，共40盆，選取飽滿、無病害的油用向日葵種子，每盆定植4株。每組分別設(shè)置正常供水(CK)和控水(T)處理各20盆。在生長至第5對(duì)真葉時(shí)開始進(jìn)行控水脅迫處理，脅迫天數(shù)分為控水0，4，8(TAR)，12，16 d(TAX)，脅迫16 d后進(jìn)行復(fù)水(FS)，脅迫期間對(duì)照組正常澆水，正常澆水8 d為CKAR、16 d為CKAX。測(cè)定控水時(shí)期的ABA含量并對(duì)控水8，16 d時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 脫落酸含量的測(cè)定

在干旱脅迫各個(gè)時(shí)期對(duì)葉片進(jìn)行混合取樣，置于-20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定脫落酸含量[17]。

1.4 總RNA的提取、文庫的構(gòu)建及測(cè)序

提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA(若為原核生物，則通過試劑盒去除rRNA來富集mRNA)；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，用Illumina HiSeqTM 2500或Illumina HiSeq X Ten等測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生125 bp或150 bp的雙端數(shù)據(jù)。質(zhì)檢合格后，使用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。建庫測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 油用向日葵葉片脫落酸含量對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

干旱脅迫下，油用向日葵葉片脫落酸含量變化見圖1。干旱脅迫8 d與16 d處理間存在顯著差異，且在干旱脅迫8 d的脫落酸含量最高，為23.55 ng/mL，在干旱脅迫16 d脫落酸含量最低，為15.74 ng/mL，干旱脅迫4 d比0 d增加2.38%，8 d比4 d增加19.86%，12 d比8 d降低25.33%，16 d比12 d降低10.55%。干旱脅迫4，8 d較0 d升高，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長及植物的生長發(fā)育，脫落酸含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，說明植物遭受適當(dāng)干旱脅迫時(shí)，植物會(huì)通過增加脫落酸含量來抵御干旱脅迫，而受到重度干旱脅迫時(shí)，脫落酸含量下降，干旱脅迫復(fù)水后脫落酸含量又有所升高，說明干旱脅迫給植物造成損傷后恢復(fù)到適宜的環(huán)境中，脫落酸含量會(huì)有一定程度的恢復(fù)。

2.2 差異基因篩選及富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)以P<0.05且∣log2FC∣>1為條件進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果見表1。由表1、圖2可知，在干旱脅迫8，16 d，通過與CK比較，處理組較CK顯著上調(diào)表達(dá)的差異基因數(shù)分別為940，1 743個(gè)，顯著下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)分別為1 752，3 037個(gè)；在干旱脅迫16 d的上調(diào)及下調(diào)基因數(shù)較干旱脅迫8 d分別高85.43%，73.34%。由KEGG、GO功能注釋可知(表2、圖3)，在干旱脅迫16 d較8 d的基因種類更豐富，其中參與生物過程的主要有生物調(diào)節(jié)、組織或生物合成、代謝過程等，參與細(xì)胞組分的主要有膜的組成部分、質(zhì)膜等，參與分子功能的主要有結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等，KEGG注釋到的主要代謝通路有植物MAPK信號(hào)通路途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體等。

FS.復(fù)水處理；不同小寫字母表示在0.05水平具有顯著性差異。圖5同。FS.Rehydration treatment;Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level.The same as Fig.5.

表1 差異表達(dá)基因篩選及各通路富集分類Tab.1 Screening of differentially expressed genes and enrichment classification of waypath

表2 主要KEGG代謝通路注釋Tab.2 Notes on the main KEGG metabolic pathways

圖2 干旱脅迫8 d(A)和16 d(B)差異基因上/下調(diào)Fig.2 Up/down regulation of differential genes on the 8 d(A)and 16 d (B)of drought stress

綠色.生物過程；藍(lán)色.細(xì)胞組分；紅色.分子功能。Green.Biological processes；Blue.Cellular components；Red.Molecular functions.

2.3 脫落酸代謝途徑分析

通過對(duì)干旱脅迫8 d進(jìn)行KEGG富集分析可知，與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因共有39 個(gè)，分別為LOC110942898、LOC110928553、LOC110930956、LOC110934537、LOC110938235、LOC110940069、LOC110865531、LOC110868014、LOC110873889、LOC110874243、LOC110879426、LOC110880149、LOC110883801、LOC110886507、LOC110889226、LOC110889238、LOC110891642、LOC110890361、LOC110890646、LOC110893934、LOC110894171、LOC110894173、LOC110894172、LOC110894634、LOC110898754、LOC110899197、LOC110899792、LOC110908801、LOC110906168、LOC110906280、LOC110911693、LOC110911722、LOC110912152、LOC110912611、LOC110912722、LOC110916036、LOC110915273、LOC110916907、LOC110920591，其代謝途徑如圖4所示，其中表現(xiàn)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有SAUR、AHP、B-ARR、GID1、GID2、PYR/PYL、PP2C、SnRK2、ABF、ETR、ERF 1/2，ABA的核心通路為ABA→PYR/PYL→PP2C→SnRK2→ABF。在39個(gè)與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因中有7個(gè)基因與脫落酸相關(guān)，分別為LOC110879426、LOC110883801、LOC110886507、LOC110898754、LOC110899197、LOC110899792、LOC110912152(表3)，其中基因LOC110879426、LOC110899197干旱脅迫較對(duì)照差異顯著，LOC110886507、LOC110898754干旱脅迫較對(duì)照差異極顯著。

圖4 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑圖Fig.4 Diagram of the metabolic pathway of plant hormone signal transduction

表3 脫落酸差異基因表達(dá)分析Tab.3 Analysis of differential gene expression of abscisic acid

2.4 干旱脅迫熱激蛋白變化

由圖5可知，干旱脅迫過程中出現(xiàn)多種熱激蛋白，其中HSP26在干旱脅迫8，16 d表達(dá)量較CK升高，且干旱脅迫16 d高于8 d，干旱脅迫第8，16天較各自對(duì)照呈顯著性差異。HSP70在干旱脅迫8，16 d表達(dá)量低于CK，熱激蛋白與脫落酸調(diào)控相關(guān)，因此，熱激蛋白的變化可證明干旱脅迫下游用向日葵以脫落酸升高來適應(yīng)和抵御逆境。

圖5 干旱脅迫下熱激蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of heat shock protein under drought stress

3 討論與結(jié)論

可溶性糖、可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，甜菜堿、脫落酸是調(diào)控逆境的激素類物質(zhì)，在植物逆境中起著重要的作用[18]。在干旱脅迫過程中，植物的抗性表現(xiàn)受多種分子和細(xì)胞通路的調(diào)控，這其中就包括了糖代謝、激素代謝、脂代謝等代謝途徑。對(duì)不同抗旱性小麥根系的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因富集分析發(fā)現(xiàn)，抗性基因主要富集在植物的碳代謝、類黃酮合成及植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等途徑[19]。研究表明，逆境誘導(dǎo)的內(nèi)源激素脫落酸(ABA)可通過參與多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)植物的生理響應(yīng)[20]。ABA調(diào)控脅迫主要有2條路徑，一條依賴ABA，另一條則不依賴ABA；對(duì)于不依賴ABA的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，植物將識(shí)別到的脅迫信號(hào)進(jìn)行以Ca2+和干旱應(yīng)答元件為中心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)植物發(fā)生相應(yīng)的生理生化變化以緩解逆境傷害[21]，研究中發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的變化會(huì)引起表型的變異[22]。本研究中干旱脅迫第4，8天脫落酸含量間差異不顯著，究其原因是植物在受到逆境脅迫時(shí)優(yōu)先表現(xiàn)于分子水平的差異，而生理水平上的表達(dá)較緩慢，但各時(shí)期脫落酸含量較正常供水明顯升高，復(fù)水后恢復(fù)至正常水平。經(jīng)過對(duì)脫落酸相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)受到干旱脅迫時(shí)脫落酸相關(guān)基因的表達(dá)量顯著升高，故對(duì)干旱脅迫8 d的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異基因進(jìn)行分析，與脫落酸代謝相關(guān)的基因共7個(gè)，均為上調(diào)表達(dá)，且受到干旱脅迫的樣本差異基因表達(dá)量均高于正常供水的樣本。

植物受到脅迫刺激會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄因子會(huì)將信號(hào)傳遞，能夠通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率，從多個(gè)層面降低逆境脅迫對(duì)植物的傷害，對(duì)植物在逆境下的生長發(fā)育起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[23-24]，尤其是WRKY、MYB、NAC、bZIP等家族參與多種代謝途徑，是信號(hào)通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子[25-26]。本研究中干旱脅迫8 d處理與對(duì)照組對(duì)比，生理水平上處理組脫落酸含量高于正常供水，分子水平上ABF2、SAPK2、PP2C、AHG1、PYL2、SAPK3等轉(zhuǎn)錄因子編碼的基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量較高，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑中占主要比例，受到脅迫的處理基因表達(dá)量高于對(duì)照。王彬等[27]在干旱敏感材料中發(fā)現(xiàn)DEGs在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有顯著富集。本研究經(jīng)兩兩對(duì)比發(fā)現(xiàn)，幾類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干旱脅迫下植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑的調(diào)控作用極顯著，其中，蛋白磷酸酶(PP)和bZIP的A亞族(ABF)參與脫落酸代謝[28]，干旱脅迫下，植株體內(nèi)脫落酸積累，ABA是植物抗旱的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，當(dāng)受體PYR/PYL感知到ABA存在時(shí)，便相互結(jié)合，進(jìn)一步與PP2C結(jié)合，形成三元復(fù)合體，抑制PP2C的酶活性，同時(shí)使PP2Cs-SnRK2復(fù)合體解離，SnRK2發(fā)生自磷酸化，隨后通過磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子或離子通道等下游底物，誘導(dǎo)ABA響應(yīng)基因表達(dá)或氣孔關(guān)閉[29]，與前人研究結(jié)果一致，ABF轉(zhuǎn)錄因子在番茄、煙草、葡萄及棉花中能增強(qiáng)植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的能力[30-31]。ABA受體蛋白通過與逆境誘發(fā)的ABA結(jié)合，介導(dǎo)逆境信號(hào)傳遞，是特定滲透脅迫誘導(dǎo)的ABA信號(hào)傳遞通路重要組分[32]。部分ABA信號(hào)通路組分編碼基因，通過在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)滲透脅迫逆境產(chǎn)生應(yīng)答，對(duì)特定逆境信號(hào)進(jìn)行傳遞[33]。如擬南芥PYR家族成員AtPYL的轉(zhuǎn)錄本豐度在干旱和鹽分逆境下顯著增大，通過基因轉(zhuǎn)錄效率改變，改善與ABA結(jié)合能力，對(duì)參與植株逆境響應(yīng)的ABA信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控[34]。

本研究以穩(wěn)定自交系17062為材料對(duì)干旱脅迫8，16 d進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序及脫落酸含量測(cè)定，篩選出GID1、GID2、AHP、PYR/PYL、PP2C、SnRK2、ABF、ETR等與脫落酸相關(guān)的高表達(dá)差異基因，可能參與植株干旱調(diào)控，其中ABF、PYL等脫落酸受體，可以更好地結(jié)合脫落酸，而脫落酸含量在適當(dāng)干旱脅迫下會(huì)升高，這說明脫落酸對(duì)植株抵御干旱逆境產(chǎn)生重要影響。在差異基因中篩選出熱激蛋白(HSP26、HSP70)表達(dá)量較高，其中HSP26在GO功能注釋到與脫落酸的調(diào)控相關(guān)，已有試驗(yàn)證明，ABA可調(diào)節(jié)熱激蛋白(HSP)基因表達(dá)，促進(jìn)其合成，從而提高植物抗逆能力[35]，脫落酸差異基因表達(dá)變化與生理指標(biāo)變化具有一致性，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有可靠性。干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子家族成員通過上調(diào)或下調(diào)表達(dá)來促進(jìn)或抑制一些基因的表達(dá)水平以調(diào)節(jié)作物生長發(fā)育，從而減少干旱脅迫對(duì)植物正常生命活動(dòng)的傷害。本研究對(duì)干旱脅迫下油用向日葵差異表達(dá)與脫落酸相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行初步分析，下一步將對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果將為轉(zhuǎn)錄因子的共表達(dá)、干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及油用向日葵分子育種提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。