宋微，李虹怡，呂洪波

葫蘆島市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧葫蘆島125000

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床常見的一種急腹癥，起病急驟，發(fā)展迅猛，病情兇險，常并發(fā)休克或多器官功能衰竭等，病死率為15%～56%[1]。急性腎損傷(AKI)是指突發(fā)且持續(xù)性腎功能快速減退所致的臨床綜合征[2]。SAP發(fā)生時會產(chǎn)生大量炎癥因子進(jìn)入血液循環(huán)，極易造成AKI。據(jù)報道，在SAP患者中AKI的發(fā)生率為14%～43%，并且合并AKI的SAP患者病死率為71%～84%[3]。以往臨床多采用血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等指標(biāo)來預(yù)測AKI的發(fā)生風(fēng)險，但這些指標(biāo)易受飲食、尿量等因素影響，同時存在診斷滯后性[4]。因此，探索新的早期診斷AKI的生物標(biāo)志物具有重要意義。微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程中具有重要的調(diào)控作用。miR-21-3p是miRNA家族成員之一，能夠參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展。有研究報道，miR-21-3p、Scr、胱抑素C(Cys C)聯(lián)合檢測對膿毒癥患兒AKI發(fā)生具有較高的預(yù)測價值[5]。IL-18是一種由激活的單核—巨噬細(xì)胞分泌的前炎癥因子，主要發(fā)揮免疫誘導(dǎo)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，體外循環(huán)術(shù)后AKI患者尿液IL-18水平明顯升高，并且其水平能夠在一定程度上反映腎損傷程度[6]。但血清miR-21-3p、IL-18水平能否早期預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生尚不清楚。為此，本研究探討了血清miR-21-3p、IL-18水平對SAP患者AKI發(fā)生的預(yù)測價值?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月—2021年6月葫蘆島市中心醫(yī)院收治的SAP患者195例。SAP臨床診斷參照《中國急性胰腺炎診治指南(2013年，上海)》[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合SAP診斷標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病至入院時間<72 h；③年齡18～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①SAP發(fā)病前已存在慢性腎衰竭、慢性腎炎等腎功能損傷者；②合并其他重要臟器功能障礙者；③合并急慢性炎癥性疾病或自身免疫性疾病者；④入院后48 h內(nèi)死亡者；⑤合并精神疾病或惡性腫瘤者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。根據(jù)住院期間是否發(fā)生AKI[8]，將SAP患者分為AKI組57例和非AKI組138例。本研究經(jīng)葫蘆島市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：20181021)，所有研究對象或其家屬知情同意并簽屬書面知情同意書。

1.2 血清miR-21-3p檢測 所有研究對象入院次日采集清晨空腹肘靜脈血3 mL，置于不含抗凝劑的離心管中，3 000 r/min離心10 min、離心半徑12 cm，留取上層血清，-80 ℃保存。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)NanoDrop Lite分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按PrimeScipt RT Reagent Kit說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR?Green Realtime PCR Master Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由北京天根生化科技有限公司設(shè)計合成。引物序列：miR-21-3p上游引物5′-ACTCCTACGACTTAGACATG-3′、下游引物5′-GACTGTATGCTGTCGTAG-3′，擴(kuò)增片段長度542 bp；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，擴(kuò)增片段長度386 bp。PCR反應(yīng)體系共20 μL：TaqMan MicroRNA Assay 1 μL，cDNA模板1.3 μL，上下游引物各2.0 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.0 μL，無酶雙氧水3.7 μL；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s共45個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。所有操作在ABI 7500型熒光定量PCR儀上完成。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算miR-21-3p相對表達(dá)量。

1.3 血清IL-18檢測 所有研究對象入院次日采集清晨空腹肘靜脈血3 mL，置于含有抗凝劑的離心管中，3 000 r/min離心10 min、離心半徑12 cm，留取上層血清，-80 ℃保存。采用ELISA法檢測血清IL-18。IL-18 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，檢測儀器為Olympus AU2700全自動生化分析儀。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 資料收集分析 所有研究對象入組后收集基本病歷資料、實驗室檢查資料、Ranson評分[9]。其中，基本病歷資料包括性別、年齡、BMI、糖尿病史、高血壓史、收縮壓、舒張壓；實驗室檢查資料包括空腹血糖(FPG)、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、Cys C。采用Logistic回歸模型分析SAP患者AKI發(fā)生的危險因素。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-21-3p、IL-18水平比較 AKI組與非AKI組血清miR-21-3p相對表達(dá)量分別為2.45±0.67、0.98±0.55，血清IL-18水平分別為(187.46±39.21)、(72.50±33.18)pg/mL。AKI組血清miR-21-3p、IL-18水平均高于非AKI組(t分別為15.904、20.846，P均<0.05)。

2.2 SAP患者AKI發(fā)生的危險因素分析 兩組基本病歷資料和實驗室檢查資料比較見表1、2。AKI組與非AKI組Ranson評分分別為(4.02±0.39)、(1.50±0.35)分，AKI組Ranson評分高于非AKI組(t=44.218，P<0.05)。

表1 兩組基本病歷資料比較

表2 兩組實驗室檢查資料比較

以SAP患者是否發(fā)生AKI為因變量(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，以miR-21-3p、IL-18、HDL-C、LDL-C、Scr、BUN、hs-CRP、Cys C、Ranson評分為自變量，納入多因素Logistic回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p、IL-18、Scr、BUN、hs-CRP、Cys C、Ranson評分均為SAP患者AKI發(fā)生的獨立危險因素(P均<0.05)。見表3。

表3 SAP患者住院期間AKI發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 血清miR-21-3p、IL-18水平對SAP患者AKI發(fā)生的預(yù)測價值分析 ROC曲線分析顯示，血清miR-21-3p相對表達(dá)量預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的曲線下面積(AUC)為0.786(95%CI：0.703～0.852)，最佳截斷值為1.93，此時其預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的靈敏度為79%、特異度為81%；血清IL-18水平預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的AUC為0.769(95%CI：0.687～0.835)，最佳截斷值為137.85 pg/mL，此時其預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的靈敏度為78%、特異度為76%；二者聯(lián)合預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的AUC為0.858(95%CI：0.773～0.927)，其預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的靈敏度為87%、特異度為83%。血清miR-21-3p、IL-18水平聯(lián)合預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的AUC高于二者單獨(Z分別為2.172、2.451，P均<0.05)。見圖1。

圖1 血清miR-21-3p、IL-18水平預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的ROC曲線

3 討論

SAP發(fā)生時能夠釋放大量炎癥因子，這些炎癥因子隨著血液循環(huán)到達(dá)全身各個組織器官，而腎臟血運豐富，是最容易受累的器官，極易引起AKI。SAP患者AKI發(fā)生后腎功能通常呈不可逆性損傷。因此，早期預(yù)測AKI的發(fā)生風(fēng)險并及時進(jìn)行干預(yù)，是改善SAP患者預(yù)后、降低病死率的重要措施。Scr是臨床預(yù)測AKI的常用指標(biāo)，但Scr升高一般發(fā)生在腎臟受損72 h后，存在診斷滯后性。此外，Scr易受性別、年齡、肌肉含量等因素影響。BUN也是臨床預(yù)測AKI的常用指標(biāo)，但其靈敏度較差[10]。因此，尋找靈敏度高、特異度強的生物標(biāo)志物輔助早期預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生成為臨床研究的熱點。

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在真核生物中廣泛存在。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。有研究報道，部分miRNA可作為評估SAP治療效果和患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[11]。JONES等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過參與細(xì)胞增殖、分化、代謝等信號傳導(dǎo)通路對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，進(jìn)而調(diào)控AKI的發(fā)生、進(jìn)展。miR-21-3p屬于miRNA家族成員之一，能夠參與腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展。PU等[13]研究報道，在大鼠AKI模型中血清miR-21-3p水平明顯升高，并且其水平升高發(fā)生在Scr、BUN之前。提示miR-21-3p可作為早期診斷AKI的生物標(biāo)志物。GAEDE等[14]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-21可作為心臟手術(shù)患者AKI發(fā)生的預(yù)測指標(biāo)。吳仕燕等[15]研究顯示，血清miR-21-3p是膿毒癥患者AKI發(fā)生的獨立預(yù)測指標(biāo)，其預(yù)測膿毒癥患者AKI發(fā)生的AUC為0.863。但血清miR-21-3p能否用于預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKI組血清miR-21-3p相對表達(dá)量明顯高于非AKI組，提示miR-21-3p可能參與SAP患者AKI發(fā)生。多因素Logistic回歸模型在校正可能的混雜因素后發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p仍然是SAP患者AKI發(fā)生的獨立危險因素。miR-21-3p主要由損傷的腎組織合成，能夠參與腎小管上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控。張盼等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腎臟出現(xiàn)損傷時，機體通過代償性機制刺激損傷的腎組織釋放miR-21-3p，減輕腎臟缺血再灌注損傷并促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖，從而保護(hù)損傷的腎組織；但當(dāng)機體大量釋放miR-21-3p時，會通過刺激PTEN、PDCD4/Fasl來阻止腎小管上皮細(xì)胞凋亡，同時活化TGF-β，加速腎組織纖維化，最終導(dǎo)致AKI發(fā)生。此外，岳飛利等[17]研究表明，血清miR-21水平與AKI嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系，即血清miR-21水平越高，AKI病情越嚴(yán)重。

IL-18是一種主要由近端腎小管中單核—巨噬細(xì)胞合成并分泌的前炎癥因子。腎功能損傷后通常在尿液中能夠檢測到IL-18，AKI發(fā)生后尿液IL-18水平會顯著升高[18]。王魁彬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，窒息并發(fā)AKI的新生兒尿液IL-18水平顯著升高，并且尿液IL-18可作為臨床輔助診斷窒息新生兒AKI發(fā)生的早期可靠指標(biāo)。SONG等[20]研究證實，膿毒癥并發(fā)AKI患者尿液IL-18水平明顯升高，并且尿液IL-18水平診斷膿毒癥并發(fā)AKI的AUC為0.768?，F(xiàn)有的研究主要觀察尿液IL-18水平與AKI發(fā)生的關(guān)系，但SAP患者可能出現(xiàn)持續(xù)性無尿或少尿癥狀，這可能影響尿液IL-18水平對SAP患者AKI發(fā)生的預(yù)測價值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKI組血清IL-18水平明顯高于非AKI組，提示IL-18可能參與SAP患者AKI發(fā)生。多因素Logistic回歸模型在校正可能的混雜因素后發(fā)現(xiàn)，IL-18仍然是SAP患者AKI發(fā)生的獨立危險因素。SAP患者病情加重能夠刺激淋巴細(xì)胞大量合成并釋放IL-18，形成由復(fù)雜細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的爆發(fā)性炎癥反應(yīng)，加重免疫功能紊亂，繼而引起腎臟缺血再灌注損傷、腎小管毛細(xì)血管微循環(huán)障礙等，最終導(dǎo)致AKI發(fā)生，并且IL-18合成和釋放越多，炎癥反應(yīng)越強烈，AKI病情越重。

本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-21-3p、IL-18水平預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的AUC分別為0.856、0.829，說明二者對SAP患者AKI發(fā)生均具有一定預(yù)測價值。血清miR-21-3p、IL-18水平聯(lián)合預(yù)測SAP患者AKI發(fā)生的AUC為0.920，明顯高于二者單獨，提示血清miR-21-3p、IL-18水平聯(lián)合能夠提高對SAP患者AKI發(fā)生的預(yù)測價值。

綜上所述，血清miR-21-3p、IL-18是SAP患者AKI發(fā)生的獨立危險因素；血清miR-21-3p、IL-18水平對SAP患者AKI發(fā)生均具有一定預(yù)測價值，二者聯(lián)合時預(yù)測價值更高。