肖池，何彩紅，王安鴿，譚中菊，趙新秀，廖俏云，李金優(yōu)，歸崎峰

1 杭州醫(yī)學院基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，杭州310003；2 浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學科

舌苔是指覆蓋在舌背面上的一層苔狀物，主要由脫落的角化上皮、唾液、食物碎屑、細菌等組成。舌苔是中醫(yī)舌診的重要內容，也是中醫(yī)臨床辨證不可缺少的客觀依據(jù)，能夠反映機體內部的正邪斗爭、氣血盛衰、寒熱虛實[1]?，F(xiàn)階段，舌苔形成的機制是中醫(yī)現(xiàn)代化基礎研究的一個重要方向。舌苔微生態(tài)作為一個相對完整且獨立的微生態(tài)系統(tǒng)，因其在舌苔形成過程中具有重要作用而受到眾多學者關注[2-5]。研究證實，多種疾病可導致舌苔微生態(tài)發(fā)生顯著變化，而舌苔菌群變化能夠為中醫(yī)病證診斷提供依據(jù)[1，6]。但目前在健康人群中舌苔與舌苔微生態(tài)關系的研究較少。本研究以健康成年人為研究對象，運用高通量測序技術，觀察了不同舌苔類型舌苔微生態(tài)的結構特點，旨在從微生態(tài)學角度闡釋健康成年人不同舌苔類型的形成機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年6月—2020年10月在浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院、紹興市越城區(qū)斗門鎮(zhèn)衛(wèi)生院和浙江古纖道綠色纖維有限公司體檢健康的成年志愿者79例。納入標準：①身體狀態(tài)良好，無任何不適癥狀或體征；②年齡18～59歲；③取樣前1周保持正常飲食習慣；④人口學資料完整。排除標準：①合并高血壓、糖尿病、高脂血癥等基礎疾病者；②合并HBV、HCV、HIV等病毒感染者；③有胃腸道手術史者；④合并精神疾病者；⑤取樣前8周內行口腔正畸手術者，或使用益生菌、益生元、合生元及抗生素者；⑥取樣前4周內做過腸道準備者。參照《中醫(yī)診斷學》、《中醫(yī)舌診圖譜》中舌苔分類標準，由浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院一位經驗豐富的中醫(yī)師診查舌苔。根據(jù)舌苔質地將研究對象分為膩苔組43例、薄苔組36例。其中，膩苔組男25例、女18例，平均年齡42歲，BMI(23.5±2.7)kg/m2，城鎮(zhèn)人口27例、農村人口16例，有吸煙史12例，有飲酒史6例，黃膩苔22例、白膩苔21例；薄苔組男14例、女22例，平均年齡36歲，BMI(22.7±3.4)kg/m2，城鎮(zhèn)人口28例、農村人口8例，有吸煙史7例，有飲酒史2例，薄白苔28例、薄黃苔8例。兩組性別、年齡、BMI、人口來源比較差異均無統(tǒng)計學意義，而有吸煙史和飲酒史比例比較差異均有統(tǒng)計學意義。本研究由浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院設計與實施，符合《赫爾辛基宣言(2013年版)》，并經醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準[批件號：(2019)科研快審第(1026)號]，所有研究對象知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 舌苔樣本收集與處理 留樣當日，所有研究對象于清晨空腹、不刷牙狀態(tài)下，用兩根無菌棉簽在舌苔表面輕輕擦拭3次，將棉簽頭端折斷后置于2 mL凍存管中，1 h內轉存于-80 ℃冰箱保存。舌苔樣本成批后送至北京諾禾致源科技股份有限公司檢測和分析。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴增純化和文庫構建 采用CTAB法提取樣本基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的基因組DNA純度和濃度合格。取適量基因組DNA置于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶barcode的特異引物，擴增區(qū)域為16sv34。引物序列：①341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；②806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。按Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶說明進行PCR擴增。反應條件：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶采用GeneJET凝膠回收試劑盒回收。采用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit構建文庫，經過Qubit和qPCR定量合格后，NovaSeq 6000測序系統(tǒng)測序。

1.4 生物信息學分析 測序數(shù)據(jù)經Reads拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)，嚴格過濾處理獲得高質量Clean Tags數(shù)據(jù)，然后與物種注釋數(shù)據(jù)庫進行比對，最終得到有效的Tags數(shù)據(jù)。利用Uparse算法對有效的Tags數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單位(OTUs)，然后對OTUs序列進行物種注釋，獲得分類學信息并分別在各個分類水平上統(tǒng)計各樣本的菌群組成，通過R軟件(Version 2.15.3)構建Veen圖。采用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage和Observed species指數(shù)，然后用R軟件分析α多樣性指數(shù)的組間差異。采用Qiime軟件計算Weighted UniFrac距離，通過R軟件繪制主成分分析(PCA)圖和主坐標分析(PCoA)圖并評估組間的β多樣性。采用線性判別分析效應值(LEfSe)軟件分析LEfSe，設置線性判別分析(LDA)的篩選值為4。

2 結果

2.1 兩組舌苔微生物α、β多樣性分析 經高通量測序分析，79例健康成年志愿者舌苔標本中共檢出2 099個OTUs。其中，膩苔組和薄苔組共享的OTUs共1 233個，膩苔組和薄苔組獨有的OTUs分別為458、408個，兩組OTUs比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，膩苔組與薄苔組Chao1指數(shù)分別為345.13±82.15、349.02±88.44，ACE指數(shù)分別為348.96±82.46、352.35±91.45，Shannon指數(shù)分別為4.93±0.36、4.87±0.44，Simpson指數(shù)分別為0.93±0.02、0.92±0.04，Goods coverage指數(shù)分別為1.00±0.00、1.00±0.00，Observed species指數(shù)分別為287.33±60.02、286.58±69.80，兩組上述指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1。

注：TF為薄苔組，GF為膩苔組；a為Chao1指數(shù)，b為ACE指數(shù)，c為Shannon指數(shù)，d為Simpson指數(shù)，e為Goods coverage指數(shù)，f為Observed species指數(shù)。

β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，膩苔組與薄苔組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結構相似度較高。見插頁Ⅰ圖1。

2.2 兩組差異物種分析 LEfSe分布柱狀圖展示了LDA>4的差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種。見插頁Ⅰ圖2。

進化分支圖同樣顯示了兩組間的差異物種，并且在由門至屬的分類級別上揭示了差異物種的所屬關系。見插頁Ⅰ圖3。

3 討論

舌苔作為口腔微生物的主要定植部位，其口腔微生物的數(shù)量和種類遠高于口腔其他部位。因此，舌苔微生態(tài)成為口腔微生態(tài)研究的主要對象。此外，舌苔微生態(tài)還與中醫(yī)辨證施治密切相關[1]。根據(jù)張伯禮院士對6 708例健康人群舌苔類型的研究發(fā)現(xiàn)，健康人群舌苔類型以黃膩苔、白膩苔、薄白苔、薄黃苔最為常見，占95%以上[7]。本研究健康成年志愿者舌苔類型均為上述四種類型，與張伯禮等[7]研究結果吻合。本研究根據(jù)舌苔質地將研究對象分為膩苔組和薄苔組，然后提取舌苔樣本基因組DNA，經PCR擴增純化和文庫構建后進行生物信息學分析，結果發(fā)現(xiàn)兩組共享的OTUs共1 233個，膩苔組和薄苔組獨有的OTUs分別為458、408個，兩組OTUs比較差異無統(tǒng)計學意義；α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，兩組Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage、Observed species指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義；β多樣性分析亦顯示，兩組菌群均傾向于聚集，提示兩組菌群結構相似度較高。結果表明健康人群的舌苔微生態(tài)相對穩(wěn)定，究其原因可能與舌具有一定的自潔作用有關[8]。但本研究通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，兩組存在差異物種，其中膩苔組放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是差異物種，而薄苔組紫單胞菌科是差異物種，與既往文獻[9]報道基本一致。結果表明，不同舌苔類型的菌群結構存在差異，而這些差異菌群可能在相應的舌苔類型形成過程中起重要作用。

放線菌屬是人類口腔內的優(yōu)勢菌群之一[10]。與非吸煙者比較，吸煙者口腔放線菌門富集，相對豐度較高[11]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，膩苔組放線菌綱富集明顯高于薄苔組，與國內馬廣強等[9]研究結果一致，其原因可能與膩苔組有吸煙史比例高于薄苔組有關。國內李華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，放線菌屬豐度和舌苔的苔量、苔厚、苔膩呈明顯正相關關系。由此推測，放線菌有可能是形成膩苔的主要微生物因素之一，并且從舌苔微生態(tài)角度上也能更好地解釋吸煙可使舌苔變厚這一現(xiàn)象[12]。放線菌可能和人類某些疾病有一定聯(lián)系。有研究報道，糖尿病患者口腔放線菌檢出率明顯升高，放線菌有可能增加受檢者罹患糖尿病的風險[13]。此外，放線菌還可通過口腔或牙齦傷口侵入組織內部，在人體免疫力下降時易誘發(fā)慢性膿腫[14]。因此，健康人群出現(xiàn)膩苔可在一定程度上預示體內潛在疾病的發(fā)生風險增加。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，膩苔組乳桿菌目和鏈球菌科豐度明顯高于薄苔組。乳桿菌雖然是一種有益菌，但它也有對機體不利的一面。乳桿菌能夠與口腔中的鏈球菌一起使糖類發(fā)酵產生乳酸或其他酸類物質，溶解牙釉質，導致齲齒、牙周炎等口腔疾病[15]。王菁等[16]對口臭患者與健康志愿者舌背微生態(tài)的菌群結構研究發(fā)現(xiàn)，口臭患者舌苔微生態(tài)發(fā)生了顯著改變，其特有的細菌高達17種，其中鏈球菌檢出率最高。有研究報道，口臭、牙周炎等口腔疾病與舌苔厚度呈明顯正相關關系[17-18]。提示乳桿菌和鏈球菌可能通過口腔疾病導致膩苔形成。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，薄苔組紫單胞菌科豐度明顯高于膩苔組，與既往文獻[9]報道基本一致。紫單胞菌科屬于擬桿菌目，包括卟啉單胞菌屬、巴氏菌屬等，是人和動物口腔、胃腸道的正常菌群，在維持口腔微生態(tài)平衡中具有重要作用。其中，卟啉單胞菌是一種小型厭氧革蘭陰性非運動球菌，作為正常菌群的一部分存在于人類口腔內，對維持口腔健康具有重要作用[9]。正常人的舌苔由于口腔微生態(tài)穩(wěn)定，舌上皮細胞正常生長、分化且不存在明顯炎癥，這為薄白苔舌象形成奠定了基礎[19]。

綜上所述，健康成年人不同舌苔表象具有不同的舌苔微生態(tài)特征，其中放線菌綱、乳桿菌目、微球菌目和鏈球菌科是膩苔的差異物種，紫單胞菌科是薄苔的差異物種，這些菌群差異可能是不同舌苔類型形成的微生態(tài)基礎。但本研究還存在一定局限性，如僅比較了薄苔和膩苔的微生態(tài)差異，對更加細化的舌苔類型未進一步探討，中醫(yī)辨證和舌苔微生態(tài)的關系亦未闡明；只評估了舌苔的微生態(tài)特征，而對兩者相互作用的機制未進一步闡明；未進行吸煙、飲酒、運動、飲食等因素對舌苔及其微生態(tài)的共發(fā)生網絡進行分析。