朱 艷,魏 穎*,嚴(yán)建剛,李明亮,陸 路,凌 空,蔡木易,谷瑞增
(1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京 100015 2 完美(廣東)日用品有限公司 廣東中山 528403)
人體腸道微生物是一個(gè)龐大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。成年人腸道微生物多達(dá)500~1 000 種[1],數(shù)量更是達(dá)到1 000 億。研究表明,腸道菌群數(shù)量與人體細(xì)胞數(shù)量間的比例接近于1∶1[2]。如此龐大的腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)已成為與機(jī)體不可分割的重要“器官”[3]。厚壁菌門 (Firmicutes) 和擬桿菌門(Bacteroidetes) 細(xì)菌是人體腸道中主要的兩大菌門,含量超過總數(shù)的90%[4]。此外,還含有少量的放線菌門和變形菌門細(xì)菌等。不同的菌群會(huì)聚集在不同的部位,形成特定的菌群結(jié)構(gòu),通過代謝產(chǎn)物影響機(jī)體的代謝,以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[5]。正常情況下,腸道菌群與機(jī)體之間形成相互依存、相互制約的共生關(guān)系,并處于動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化,原有的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破,原先的生理性菌群組合被破壞并生成病理性菌群組合,最終引起腸道菌群紊亂失調(diào)[6-7]。腸道微生態(tài)與宿主健康密切相關(guān),涉及眾多疾病的發(fā)病機(jī)制,如肥胖[8]、糖尿病[9]、高血壓[10]、阿爾茲海默癥等[11]。引起機(jī)體腸道菌群紊亂的因素有很多,如飲食、年齡、藥物等,然而長期大量使用抗生素是導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的最常見原因[12]。WHO 調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[13],我國住院患者抗生素類藥物使用率高達(dá)80%,遠(yuǎn)超國外的30%。抗生素的濫用不僅會(huì)殺滅腸道中具有屏障作用的益生菌,甚至?xí)^發(fā)真菌感染,引起腹瀉、腹痛等臨床癥狀,嚴(yán)重威脅機(jī)體的健康。
發(fā)酵豌豆蛋白肽是以豌豆蛋白為原料,通過微生物發(fā)酵后得到的含有豌豆肽、豌豆蛋白以及微生物代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。其能夠降低蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量,提高營養(yǎng)價(jià)值[14],而且在微生物發(fā)酵過程中沒有添加任何化學(xué)物質(zhì),從而形成了一個(gè)復(fù)雜而穩(wěn)定的具有多元功能的微生態(tài)系統(tǒng)[15],具有一定的調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的潛力。本試驗(yàn)中利用鹽酸林可霉素建立腸道菌群失調(diào)模型,通過對(duì)比添加和不添加益生菌的豌豆蛋白、豌豆肽、豌豆適度水解蛋白,探究發(fā)酵豌豆蛋白肽調(diào)節(jié)腸道菌群的效果。
健康雄性昆明鼠(許可證:SCXK (京)2016-0006),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉、發(fā)酵豌豆蛋白肽、益生菌粉,北京中食海氏生物技術(shù)有限公司(SEA SON);IL-2 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,北京百智生物科技有限公司;鹽酸林可霉素,北京索萊寶生物科技有限公司。
多功能酶標(biāo)儀,美國Dynex 公司;生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司。
1.2.1 樣品成分檢測(cè) 采用常壓干燥法測(cè)定樣品中水分含量(GB 5009.3-2016),采用凱式定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量(GB 5009.5-2010),采用高溫灼燒法測(cè)灰分含量(GB 5009.4-2010)。
1.2.2 腸道菌群失調(diào)模型建立于動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,按照表1進(jìn)行分組。除空白組,其余各組每天灌胃300 mg/mL 的鹽酸林可霉素0.2 mL,空白組灌胃等量的生理鹽水,持續(xù)3 d進(jìn)行造模。建模完成后,各組小鼠每天1 次灌胃相應(yīng)樣品,空白組和模型組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)14 d,最后一次灌胃后,小鼠斷食不斷水12 h,進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
表1 小鼠分組Table 1 Groups of mice
1.2.3 基于16s rRNA 技術(shù)分析樣品對(duì)小鼠腸道菌群的影響
1.2.3.1 小鼠糞便取樣 小鼠于最后一次灌胃后,斷食不斷水12 h,無菌收集小鼠糞便,液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存。
1.2.3.2 16s rRNA 細(xì)菌檢測(cè) 提取樣本基因組DNA,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度,取適量的樣本DNA 于離心管中,使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板,根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode 的特異引物和高效高保真酶進(jìn)行PCR 并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。使用TruSeqRDNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量,文庫合格后,使用NovaSeq6000 進(jìn)行測(cè)序。
1.2.3.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列得到雙端測(cè)序數(shù)據(jù),截去Barcode 和引物序列后對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行拼接,得到原始Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags)。原始Tags 數(shù)據(jù)通過過濾、除去嵌合體得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse v7.0.1001 軟件以97%的一致性對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可分類操作單元 (OTUs)聚類分析和物種注釋。將OUT 代表序列與相應(yīng)微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比,得到各樣本的物種分類信息和各水平注釋信息?;诰垲惤Y(jié)果進(jìn)行多樣性分析以及得到各分類水平的物種組成信息。
1.2.4 小鼠結(jié)腸切片病理分析 取小鼠結(jié)腸2~3 cm 新鮮組織,用生理鹽水清洗結(jié)腸內(nèi)容物后迅速浸泡于4%甲醛溶液中進(jìn)行固定,并進(jìn)行HE 染色,觀察結(jié)腸病理變化。
采用Origin8.5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)表示。采用組間t檢驗(yàn),P<0.05 具有顯著性差異。
如表2所示為各樣品的基礎(chǔ)理化性質(zhì)鑒定結(jié)果,豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽粉中蛋白質(zhì)含量居于首位,分別占據(jù)84.32%,86.47%,83.95%和84.94%,4 個(gè)樣品的灰分含量均在5%以下。因此,可以認(rèn)為樣品中發(fā)揮生物功能的主要是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
表2 樣品的基礎(chǔ)理化性質(zhì)(%)Table 2 Basic physical and chemical properties of samples (%)
2.2.1 基于門分類水平的物種豐富度分析 通過對(duì)各樣本OUT 序列進(jìn)行物種注釋,得到每個(gè)樣本在各分類(門、綱、目、科、屬、種)水平上最大豐度排名前十的物種,生成相對(duì)豐度柱形圖,如圖1所示為門分類水平下的相對(duì)豐度柱形圖。可以看出,各組樣本生成的OUT 中豐度排名前十的物種分別為:厚壁菌門 (Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、衣原體門(Chlamydiae)、螺旋體門(Spirochaetes)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、未鑒別的細(xì)菌門(unidentified_Bacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia),其 中厚壁菌門和擬桿菌門占90%左右,是腸道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌[16]。B 模型組的厚壁菌門相對(duì)于空白組A增加了73.16%,擬桿菌門、變形菌門、放線菌門相比于空白組A 分別降低了70.38%,2.57%,0.2%。腸道中的厚壁菌門細(xì)菌擔(dān)任著分解纖維素,產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,提高宿主營養(yǎng)利用率的責(zé)任,擬桿菌則幫助機(jī)體分解碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[17],因此厚壁菌門與擬桿菌門的比值(F/B)常與體重呈正相關(guān)[18]。A 和B 組F/B 值分別為330 和0.37,可知,鹽酸林可霉素導(dǎo)致厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌比例改變,從而引起群落結(jié)構(gòu)改變,這種改變可能會(huì)增加機(jī)體肥胖的風(fēng)險(xiǎn)。豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽,均能降低F/B值。其中隨著發(fā)酵豌豆蛋白肽濃度升高,F(xiàn)/B 值一直處于下降狀態(tài),以6.4 g/kg 灌胃發(fā)酵豌豆蛋白肽(M 組)的小鼠腸道菌中F/B 值最小為0.23。向未發(fā)酵的豌豆肽和酶解豌豆蛋白粉中添加益生菌相比于不添加,其F/B 值降低,而豌豆蛋白則相反。因此可見豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽均能起到調(diào)節(jié)腸道菌群中厚壁菌門和雙歧桿菌門細(xì)菌比例的作用,因此它們?cè)趲椭鷻C(jī)體減肥方面具有較大的潛力。
圖1 小鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度柱形圖Fig.1 Histogram of relative abundance of intestinal flora in mice at the phylum level
2.2.2 基于屬分類水平的物種豐富度分析 根據(jù)所有樣本在屬水平上的物種注釋和豐度信息,選取豐度排名前35 的屬,根據(jù)其豐度信息,從樣本和物種兩個(gè)層面進(jìn)行聚類,繪制熱圖,以便發(fā)現(xiàn)物種在樣本中的聚集信息,結(jié)果如圖2所示。在豐度排名前35 的屬中,厚壁菌門下的屬占62.86%,擬桿菌門下的屬占14.29%,放線菌門下的屬占5.71%,變形菌門下的屬占17.14%,藍(lán)細(xì)菌門下的屬占2.86%。B 組厚壁菌門下的艱難梭菌(Clostridioides)、糞腸球菌(Enterococcus)、咸海鮮球菌屬(Jeotgalicoccus)、羅姆布茨菌(Romboutsia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、未鑒別的梭菌(unidentified_Clostridiales)相對(duì)于A 組豐度分別增加了0.23%,57.02%,0.13%,0.13%,0.01%,37.44%,丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、布勞特氏菌屬(Blautia)、芽孢菌(Coprobacillus)、瘤胃梭菌屬(Lachnoclostridium)、未鑒別的毛螺旋菌屬(unidentified_Lachnospiraceae) 豐度分別降低了0.52%,5.04%,0.73%,8.82%,0.1%;B 組小鼠腸道中擬桿菌門下的細(xì)菌豐度均發(fā)生降低,其中擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、副桿菌屬(Parabacteroides)、增效丁酸蓖麻單胞菌(Butyricimonas)豐度降為0,黃桿菌豐度降低了50.98%。艱難梭菌是一種經(jīng)糞-口傳播的厭氧芽孢桿菌,它產(chǎn)生的毒素會(huì)攻擊機(jī)體腸道免疫細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞病變,并引起腹瀉和結(jié)腸炎[19];糞腸球菌可作為一類益生菌,抑制其它病原菌的生長,同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力[20],但是它也是一類致病菌,糞腸球菌大量生長會(huì)引發(fā)機(jī)體尿道感染和腸道感染等疾病[21];布勞特氏菌屬是醋酸鹽的生產(chǎn)者,研究表明,肥胖兒童中布勞特氏菌屬顯著減少,且其特定的OUT 具有抗炎作用[22];瘤胃菌屬成員能夠抑制機(jī)體感染霍亂弧菌,向小鼠體內(nèi)移植瘤胃菌,能夠改善其生長和代謝異常,而且它在長壽者糞便中含量較高,可作為長壽信號(hào)之一[23-24]。發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠提高小鼠腸道菌群的多樣性,并促進(jìn)一些益生菌如布勞特氏菌、瘤胃菌、毛螺菌等的生長。B 組擬桿菌屬和變形菌屬細(xì)菌豐度和多樣性大大降低,發(fā)酵豌豆蛋白肽使得小鼠腸道中副桿菌屬、黃桿菌豐度相對(duì)于B 組分別上升了0.03%,61.25%,并增加了變形菌門下各屬的豐度。
圖2 小鼠腸道菌群屬水平熱圖Fig.2 Heatmap of intestinal flora in mice at the genus level
2.3.1 小鼠糞便菌群稀釋曲線分析 稀釋曲線一方面可以反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性,同時(shí)也能間接反映出物種的豐富度[26]。如圖3所示,小鼠糞便菌群的稀釋曲線隨著測(cè)序量的增加而趨于平緩,說明測(cè)序結(jié)果已經(jīng)足以代表當(dāng)前樣本中所包含的多樣性。在同一測(cè)序深度下,D、E、C、K、J 組豐富度相對(duì)于B 組增高,其余各組豐富度則相對(duì)于B 組降低。豌豆蛋白、豌豆蛋白+菌、發(fā)酵豌豆蛋白肽在灌胃劑量為0.4,0.8,1.6 g/kg 時(shí),均能增加小鼠腸道菌群的豐富度,且豌豆蛋白效果更強(qiáng)。
圖3 小鼠腸道菌群稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of intestinal flora in mice
2.3.2 小鼠糞便菌群等級(jí)聚類曲線分析 等級(jí)聚類曲線是從豐富度和均勻度兩方面揭示物種多樣性的一種方法[26]。在水平方向上,曲線的寬度代表物種的豐富度,豐富度越高,在橫軸上的跨度越大;在垂直方向上,曲線的平滑程度代表物種的均勻程度,曲線越平緩,物種分布越均勻。如圖4所示,D、E、C、K 組豐富度最高,F(xiàn)、L、I、H 組豐富度最低。圖中各樣品曲線平滑度較好,整體趨勢(shì)趨于平緩,僅有末端略微曲折,表明樣品中物種分布較為均勻。
圖4 小鼠腸道菌群等級(jí)聚類曲線Fig.4 Rank abundance of intestinal flora in mice
2.3.3 小鼠糞便菌群中α 多樣性指數(shù)分析 α 多樣性可以衡量微生物群落的多樣性和豐富度,度量標(biāo)準(zhǔn)常包括ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、shannon 指數(shù)和simpson 指數(shù),它們的大小與微生物群落構(gòu)成的多樣性呈正相關(guān)[27]。其中ACE 和Chao 指數(shù)大小用來反映群落的豐富度,shannon 和simpson 指數(shù)用來反應(yīng)群落構(gòu)成的多樣性[28]。如表3所示,B組小鼠ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)相對(duì)于A 組顯著提高(P<0.05),但是shannon 指數(shù)和simpson 指數(shù)顯著降低(P<0.05),這說明抗生素的使用增加了小鼠腸道中微生物的豐富度,但卻使其多樣性降低,這可能與小鼠腸道中厚壁菌門細(xì)菌大量增加有關(guān)。發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠顯著增加小鼠腸道中微生物群落的多樣性(P<0.05),并降低物種豐富度,與空白組無顯著差異,而且隨著灌胃濃度升高,小鼠腸道菌群多樣性和豐富度降低,劑量為1.6 g/kg時(shí),小鼠腸道菌群豐富度和多樣性均較高,與空白組無顯著差異。
表3 小鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù)(n=3,±s)Table 3 The α diversity index of intestinal flora in mice (n=3,±s)
表3 小鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù)(n=3,±s)Table 3 The α diversity index of intestinal flora in mice (n=3,±s)
注:不同字母之間表示具有顯著性差異,P<0.05。
分組 ACE Chao1 shannon simpson A 121.7±4.1cde 118±10.3cde 3.8±0.29a 0.88±0.05a B 196.7±7.5ab 209±6.6ab 1.7±0.239b 0.58±0.05b C 193.6±11.3abc 198±18.4abcd 3.6±0.239a 0.85±0.03a D 208.8±13.2a 270±15.5a 4.1±0.469a 0.89±0.06a E 191±30.7abc 250±21.3 120±10.9 109±6.3d 114±25.4 a 4.12±0.39a 0.91±0.046a F 60.6±9.2ef bcde 3.3±0.29ab 0.81±0.05ab G 52.5±6.7ef e 3.8±0.52a 0.88±0.04a H 56.7±5.1ef de 3.3±0.35ab 0.81±0.03ab I 30.8±5.8f 86±15e 3.3±0.28ab 0.85±0.05a J 124±24.9bcde 207±28.8abc 3.7±0.17a 0.86±0.04a K 148.8±21abcd 206±20.2abc 3.5±0.23a 0.83±0.04a L 60.2±7ef 114±18.4de 3.2±0.24ab 0.81±0.05ab M 87.2±10.1def 140±11.5bcde 3.1±0.27ab 0.81±0.07ab
β 多樣性分析是對(duì)不同樣本中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行的比較分析,直觀的反映出不同樣本間微生物群落構(gòu)成的相似性[29]。PCoA 分析(主坐標(biāo)分析)是用于評(píng)估不同樣本間β 多樣性的方式之一?;赨nweighted Unifrac 距離的PCoA 分析主要針對(duì)于一些稀有物種,而基于Weighted Unifrac距離的PCoA 分析則對(duì)豐度較高的物種更加敏感[30]。如圖5所示,在Unweighted Unifrac 分析圖中,兩種主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值分別是23.03%和27.33%,A 與H、I 組的距離較近,與其余各組的距離較遠(yuǎn),且B 組與所有組之間均呈現(xiàn)比較離散的狀態(tài),這說明給小鼠灌胃鹽酸林可霉素后,小鼠腸道菌群中的一些稀有物種的種類發(fā)生改變,當(dāng)用豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽進(jìn)行干預(yù)后,除了A 與H 和I 組具有相似的稀有物種組成外,其余各組之間稀有物種的相似性較低。在Weighted Unifrac 分析圖中,A與C、H、K、I 的距離相近,B 依然與其余各組均保持較遠(yuǎn)的距離,因此,鹽酸林可霉素導(dǎo)致小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大程度的改變,豌豆蛋白、豌豆蛋白+菌、酶解豌豆蛋白粉+菌以及灌胃劑量為1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽的干預(yù)使得小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成向正常組靠近。
圖5 基于Unweighted Unifrac 距離(a)和Weighted Unifrac 距離(b)的PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis based on the Unweighted Unifrac distance (a) and Weighted Unifrac distance (b)
2.5.1 功能相對(duì)豐度分析 KEGG 將代謝通路分為6 大類,分別是代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、細(xì)胞進(jìn)程(Cellular Processes)、人類疾?。℉uman Diseases)和生物體系統(tǒng)(Organismal Systems),它們的變化情況如圖6所示。A 組代謝相關(guān)的基因相對(duì)豐度分別為新陳代謝(48.16%)、遺傳信息處理(22.09%)、環(huán)境信息處理(12.2%)、細(xì)胞過程(6.92%)、人類疾?。?.95%)、生物體系統(tǒng)(2.05%),B 組新陳代謝(43.92%)、細(xì)胞過程(6.27%)、生物體系統(tǒng)(1.38%),這些功能所占比例相對(duì)于A 組明顯降低,但是遺傳信息處理(24%)、環(huán)境信息處理(15.53%)、人類疾?。?.38%)功能所占比例明顯增加。
圖6 Tax4Fun 功能注釋相對(duì)豐度柱形圖Fig.6 Tax4Fun functional annotation relative abundance histogram
每一個(gè)代謝通路又被分為多個(gè)等級(jí),以便更詳細(xì)的反映出不同處理組小鼠腸道菌群的功能差異性。如圖7功能注釋聚類熱圖所示,小鼠在連續(xù)喂食鹽酸林可霉素后,相對(duì)于A 組,其腸道菌群基因組中與糖代謝(Carbohydrate metabolism)、脂代謝(Lipid metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、輔因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、能量代謝(Energy metabolism)相關(guān)基因豐度降低,但是核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)基因豐度增高,同時(shí)B 組小鼠腸道菌群表現(xiàn)出衰老(Aging) 和傳染病(Infectious diseases) 基因豐度增高,免疫系統(tǒng)(Immune system)基因豐度降低,從而增加小鼠罹患疾病的概率,而且糖、脂、氨基酸和能量代謝的降低也會(huì)增加小鼠肥胖的風(fēng)險(xiǎn),這可能跟小鼠腸道菌種厚壁菌門細(xì)菌增多,而擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量下降相關(guān)。小鼠在喂食各組樣品后,一定程度上提高了小鼠的營養(yǎng)物質(zhì)和能量代謝水平,并降低了核苷酸代謝。核苷酸代謝異常也會(huì)引起一系列的疾病,嘌呤代謝過快產(chǎn)生過多的尿酸積累在體內(nèi)引起高尿酸血癥[31]。因此,這些基因功能的改變提示豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠改善抗生素引起的腸道菌群紊亂。
圖7 Tax4Fun 功能注釋聚類熱圖Fig.7 Tax4Fun function annotation clustering heatmap
2.5.2 功能注釋PCA 分析 基于數(shù)據(jù)庫的功能注釋的豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)各組樣本進(jìn)行PCA 分析,可以直觀的反映出各組小鼠腸道菌群功能組成的相似性。如圖8所示A 與B 遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開,說明A、B兩組功能組成差異較大,但是A 與除B 組以外各組分布較為集中,說明經(jīng)樣品處理后的各組小鼠腸道菌群的功能組成與正常組小鼠非常接近。
圖8 Tax4Fun 功能注釋PCA 結(jié)果Fig.8 PCA result of Tax4Fun function annotation
如圖9所示,A 組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞和腸絨毛排列整齊,腸腺內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量豐富,無淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,形態(tài)良好。而在B 組中,腸絨毛排列雜亂無章,邊緣出現(xiàn)斷裂,并有明顯的炎性細(xì)胞浸潤。部分腸腺之間發(fā)生融合,杯狀細(xì)胞減少,體積增大并出現(xiàn)空泡。杯狀細(xì)胞主要分布在黏膜上皮,主要行使分泌黏蛋白的功能,形成黏液層,為腸黏膜在受到外源病菌和腸道固有菌侵襲時(shí)提供保護(hù)屏障[32]。研究表明,在腸炎、結(jié)腸癌患者體內(nèi),杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少[33]。小鼠食用發(fā)酵豌豆蛋白肽后,結(jié)腸黏膜受損程度得到不同程度的改善,灌胃劑量為1.6 g/kg 的小鼠結(jié)腸絨毛排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤,杯狀細(xì)胞形態(tài)正常且數(shù)量豐富,灌胃濃度升高和降低,都會(huì)出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤,且濃度降低還出現(xiàn)黏膜下層和肌層間隙增大的現(xiàn)象。豌豆蛋白、豌豆肽以及酶解豌豆蛋白粉也能降低小鼠結(jié)腸黏膜受損程度,但在降低炎性細(xì)胞浸潤、調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量方面不及灌胃劑量為1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽組。
圖9 小鼠結(jié)腸HE 染色Fig.9 HE staining of the colon of mice
本試驗(yàn)通過給小鼠灌胃鹽酸林可霉素成功建立腸道菌群紊亂模型,小鼠菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為菌群多樣性降低,厚壁菌門細(xì)菌增多,擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量減少。對(duì)小鼠腸道菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè),紊亂小鼠腸道菌總基因組中與葡萄糖代謝、脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝相關(guān)基因豐度降低,核苷酸代謝相關(guān)基因的豐度升高,與人類疾病如衰老、傳染病相關(guān)的基因豐度升高,而免疫系統(tǒng)基因豐度降低,可見鹽酸林可霉素改變了小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌的種類和豐度,并引起小鼠代謝異常,增加患病的概率。此外對(duì)紊亂小鼠結(jié)腸進(jìn)行HE 染色進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn),菌群紊亂小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出一定程度的受損,炎癥因子大量浸潤、杯狀細(xì)胞減少且出現(xiàn)空泡現(xiàn)象,嚴(yán)重?fù)p害了小鼠結(jié)腸的腸黏膜屏障,增加了病原菌入侵的幾率。給小鼠灌胃發(fā)酵豌豆蛋白肽后,小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及結(jié)腸病理變化得到不同程度的改善,其中當(dāng)灌胃劑量為1.6 g/kg 時(shí),小鼠與正常組小鼠的菌群多樣性和優(yōu)勢(shì)物種的豐度和構(gòu)成極為相近,且相比于灌胃豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉在添加和未添加益生菌的小鼠,灌胃劑量的1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽組的小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,絨毛整齊,紊亂小鼠出現(xiàn)的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少、腸腺融合以及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象消失,且厚壁菌門/擬桿菌門比例與空白組更為接近,腸道紊亂狀態(tài)得到更好的恢復(fù)。綜上所述,發(fā)酵豌豆蛋白肽具有良好的調(diào)節(jié)腸道菌群的效果,能夠降低厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌的比例,因此具有一定的減肥功效,并且具有增強(qiáng)結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞的數(shù)量,鞏固黏膜屏障,防止病原菌入侵的作用。