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發(fā)酵豌豆蛋白肽對(duì)鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用

2022-01-10 03:57嚴(yán)建剛李明亮蔡木易谷瑞增
中國食品學(xué)報(bào) 2021年12期
關(guān)鍵詞:厚壁菌門豌豆

朱 艷,魏 穎*,嚴(yán)建剛,李明亮,陸 路,凌 空,蔡木易,谷瑞增

(1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京 100015 2 完美(廣東)日用品有限公司 廣東中山 528403)

人體腸道微生物是一個(gè)龐大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。成年人腸道微生物多達(dá)500~1 000 種[1],數(shù)量更是達(dá)到1 000 億。研究表明,腸道菌群數(shù)量與人體細(xì)胞數(shù)量間的比例接近于1∶1[2]。如此龐大的腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)已成為與機(jī)體不可分割的重要“器官”[3]。厚壁菌門 (Firmicutes) 和擬桿菌門(Bacteroidetes) 細(xì)菌是人體腸道中主要的兩大菌門,含量超過總數(shù)的90%[4]。此外,還含有少量的放線菌門和變形菌門細(xì)菌等。不同的菌群會(huì)聚集在不同的部位,形成特定的菌群結(jié)構(gòu),通過代謝產(chǎn)物影響機(jī)體的代謝,以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[5]。正常情況下,腸道菌群與機(jī)體之間形成相互依存、相互制約的共生關(guān)系,并處于動(dòng)態(tài)平衡之中。當(dāng)機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化,原有的動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破,原先的生理性菌群組合被破壞并生成病理性菌群組合,最終引起腸道菌群紊亂失調(diào)[6-7]。腸道微生態(tài)與宿主健康密切相關(guān),涉及眾多疾病的發(fā)病機(jī)制,如肥胖[8]、糖尿病[9]、高血壓[10]、阿爾茲海默癥等[11]。引起機(jī)體腸道菌群紊亂的因素有很多,如飲食、年齡、藥物等,然而長期大量使用抗生素是導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的最常見原因[12]。WHO 調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[13],我國住院患者抗生素類藥物使用率高達(dá)80%,遠(yuǎn)超國外的30%。抗生素的濫用不僅會(huì)殺滅腸道中具有屏障作用的益生菌,甚至?xí)^發(fā)真菌感染,引起腹瀉、腹痛等臨床癥狀,嚴(yán)重威脅機(jī)體的健康。

發(fā)酵豌豆蛋白肽是以豌豆蛋白為原料,通過微生物發(fā)酵后得到的含有豌豆肽、豌豆蛋白以及微生物代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。其能夠降低蛋白中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量,提高營養(yǎng)價(jià)值[14],而且在微生物發(fā)酵過程中沒有添加任何化學(xué)物質(zhì),從而形成了一個(gè)復(fù)雜而穩(wěn)定的具有多元功能的微生態(tài)系統(tǒng)[15],具有一定的調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)的潛力。本試驗(yàn)中利用鹽酸林可霉素建立腸道菌群失調(diào)模型,通過對(duì)比添加和不添加益生菌的豌豆蛋白、豌豆肽、豌豆適度水解蛋白,探究發(fā)酵豌豆蛋白肽調(diào)節(jié)腸道菌群的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

健康雄性昆明鼠(許可證:SCXK (京)2016-0006),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉、發(fā)酵豌豆蛋白肽、益生菌粉,北京中食海氏生物技術(shù)有限公司(SEA SON);IL-2 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒,北京百智生物科技有限公司;鹽酸林可霉素,北京索萊寶生物科技有限公司。

多功能酶標(biāo)儀,美國Dynex 公司;生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品成分檢測(cè) 采用常壓干燥法測(cè)定樣品中水分含量(GB 5009.3-2016),采用凱式定氮法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量(GB 5009.5-2010),采用高溫灼燒法測(cè)灰分含量(GB 5009.4-2010)。

1.2.2 腸道菌群失調(diào)模型建立于動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,按照表1進(jìn)行分組。除空白組,其余各組每天灌胃300 mg/mL 的鹽酸林可霉素0.2 mL,空白組灌胃等量的生理鹽水,持續(xù)3 d進(jìn)行造模。建模完成后,各組小鼠每天1 次灌胃相應(yīng)樣品,空白組和模型組灌胃等量的生理鹽水,連續(xù)14 d,最后一次灌胃后,小鼠斷食不斷水12 h,進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

表1 小鼠分組Table 1 Groups of mice

1.2.3 基于16s rRNA 技術(shù)分析樣品對(duì)小鼠腸道菌群的影響

1.2.3.1 小鼠糞便取樣 小鼠于最后一次灌胃后,斷食不斷水12 h,無菌收集小鼠糞便,液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3.2 16s rRNA 細(xì)菌檢測(cè) 提取樣本基因組DNA,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度,取適量的樣本DNA 于離心管中,使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板,根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode 的特異引物和高效高保真酶進(jìn)行PCR 并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。使用TruSeqRDNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 和Q-PCR 定量,文庫合格后,使用NovaSeq6000 進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列得到雙端測(cè)序數(shù)據(jù),截去Barcode 和引物序列后對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行拼接,得到原始Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags)。原始Tags 數(shù)據(jù)通過過濾、除去嵌合體得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse v7.0.1001 軟件以97%的一致性對(duì)所有樣本的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行可分類操作單元 (OTUs)聚類分析和物種注釋。將OUT 代表序列與相應(yīng)微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比,得到各樣本的物種分類信息和各水平注釋信息?;诰垲惤Y(jié)果進(jìn)行多樣性分析以及得到各分類水平的物種組成信息。

1.2.4 小鼠結(jié)腸切片病理分析 取小鼠結(jié)腸2~3 cm 新鮮組織,用生理鹽水清洗結(jié)腸內(nèi)容物后迅速浸泡于4%甲醛溶液中進(jìn)行固定,并進(jìn)行HE 染色,觀察結(jié)腸病理變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)表示。采用組間t檢驗(yàn),P<0.05 具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品理化性質(zhì)

如表2所示為各樣品的基礎(chǔ)理化性質(zhì)鑒定結(jié)果,豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽粉中蛋白質(zhì)含量居于首位,分別占據(jù)84.32%,86.47%,83.95%和84.94%,4 個(gè)樣品的灰分含量均在5%以下。因此,可以認(rèn)為樣品中發(fā)揮生物功能的主要是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

表2 樣品的基礎(chǔ)理化性質(zhì)(%)Table 2 Basic physical and chemical properties of samples (%)

2.2 OUT 聚類分析

2.2.1 基于門分類水平的物種豐富度分析 通過對(duì)各樣本OUT 序列進(jìn)行物種注釋,得到每個(gè)樣本在各分類(門、綱、目、科、屬、種)水平上最大豐度排名前十的物種,生成相對(duì)豐度柱形圖,如圖1所示為門分類水平下的相對(duì)豐度柱形圖。可以看出,各組樣本生成的OUT 中豐度排名前十的物種分別為:厚壁菌門 (Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、衣原體門(Chlamydiae)、螺旋體門(Spirochaetes)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、未鑒別的細(xì)菌門(unidentified_Bacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia),其 中厚壁菌門和擬桿菌門占90%左右,是腸道中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌[16]。B 模型組的厚壁菌門相對(duì)于空白組A增加了73.16%,擬桿菌門、變形菌門、放線菌門相比于空白組A 分別降低了70.38%,2.57%,0.2%。腸道中的厚壁菌門細(xì)菌擔(dān)任著分解纖維素,產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,提高宿主營養(yǎng)利用率的責(zé)任,擬桿菌則幫助機(jī)體分解碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[17],因此厚壁菌門與擬桿菌門的比值(F/B)常與體重呈正相關(guān)[18]。A 和B 組F/B 值分別為330 和0.37,可知,鹽酸林可霉素導(dǎo)致厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌比例改變,從而引起群落結(jié)構(gòu)改變,這種改變可能會(huì)增加機(jī)體肥胖的風(fēng)險(xiǎn)。豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽,均能降低F/B值。其中隨著發(fā)酵豌豆蛋白肽濃度升高,F(xiàn)/B 值一直處于下降狀態(tài),以6.4 g/kg 灌胃發(fā)酵豌豆蛋白肽(M 組)的小鼠腸道菌中F/B 值最小為0.23。向未發(fā)酵的豌豆肽和酶解豌豆蛋白粉中添加益生菌相比于不添加,其F/B 值降低,而豌豆蛋白則相反。因此可見豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽均能起到調(diào)節(jié)腸道菌群中厚壁菌門和雙歧桿菌門細(xì)菌比例的作用,因此它們?cè)趲椭鷻C(jī)體減肥方面具有較大的潛力。

圖1 小鼠腸道菌群門水平相對(duì)豐度柱形圖Fig.1 Histogram of relative abundance of intestinal flora in mice at the phylum level

2.2.2 基于屬分類水平的物種豐富度分析 根據(jù)所有樣本在屬水平上的物種注釋和豐度信息,選取豐度排名前35 的屬,根據(jù)其豐度信息,從樣本和物種兩個(gè)層面進(jìn)行聚類,繪制熱圖,以便發(fā)現(xiàn)物種在樣本中的聚集信息,結(jié)果如圖2所示。在豐度排名前35 的屬中,厚壁菌門下的屬占62.86%,擬桿菌門下的屬占14.29%,放線菌門下的屬占5.71%,變形菌門下的屬占17.14%,藍(lán)細(xì)菌門下的屬占2.86%。B 組厚壁菌門下的艱難梭菌(Clostridioides)、糞腸球菌(Enterococcus)、咸海鮮球菌屬(Jeotgalicoccus)、羅姆布茨菌(Romboutsia)、葡萄球菌(Staphylococcus)、未鑒別的梭菌(unidentified_Clostridiales)相對(duì)于A 組豐度分別增加了0.23%,57.02%,0.13%,0.13%,0.01%,37.44%,丁酸弧菌屬(Anaerostipes)、布勞特氏菌屬(Blautia)、芽孢菌(Coprobacillus)、瘤胃梭菌屬(Lachnoclostridium)、未鑒別的毛螺旋菌屬(unidentified_Lachnospiraceae) 豐度分別降低了0.52%,5.04%,0.73%,8.82%,0.1%;B 組小鼠腸道中擬桿菌門下的細(xì)菌豐度均發(fā)生降低,其中擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、副桿菌屬(Parabacteroides)、增效丁酸蓖麻單胞菌(Butyricimonas)豐度降為0,黃桿菌豐度降低了50.98%。艱難梭菌是一種經(jīng)糞-口傳播的厭氧芽孢桿菌,它產(chǎn)生的毒素會(huì)攻擊機(jī)體腸道免疫細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞病變,并引起腹瀉和結(jié)腸炎[19];糞腸球菌可作為一類益生菌,抑制其它病原菌的生長,同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體免疫力[20],但是它也是一類致病菌,糞腸球菌大量生長會(huì)引發(fā)機(jī)體尿道感染和腸道感染等疾病[21];布勞特氏菌屬是醋酸鹽的生產(chǎn)者,研究表明,肥胖兒童中布勞特氏菌屬顯著減少,且其特定的OUT 具有抗炎作用[22];瘤胃菌屬成員能夠抑制機(jī)體感染霍亂弧菌,向小鼠體內(nèi)移植瘤胃菌,能夠改善其生長和代謝異常,而且它在長壽者糞便中含量較高,可作為長壽信號(hào)之一[23-24]。發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠提高小鼠腸道菌群的多樣性,并促進(jìn)一些益生菌如布勞特氏菌、瘤胃菌、毛螺菌等的生長。B 組擬桿菌屬和變形菌屬細(xì)菌豐度和多樣性大大降低,發(fā)酵豌豆蛋白肽使得小鼠腸道中副桿菌屬、黃桿菌豐度相對(duì)于B 組分別上升了0.03%,61.25%,并增加了變形菌門下各屬的豐度。

圖2 小鼠腸道菌群屬水平熱圖Fig.2 Heatmap of intestinal flora in mice at the genus level

2.3 小鼠糞便菌群α 多樣性分析

2.3.1 小鼠糞便菌群稀釋曲線分析 稀釋曲線一方面可以反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性,同時(shí)也能間接反映出物種的豐富度[26]。如圖3所示,小鼠糞便菌群的稀釋曲線隨著測(cè)序量的增加而趨于平緩,說明測(cè)序結(jié)果已經(jīng)足以代表當(dāng)前樣本中所包含的多樣性。在同一測(cè)序深度下,D、E、C、K、J 組豐富度相對(duì)于B 組增高,其余各組豐富度則相對(duì)于B 組降低。豌豆蛋白、豌豆蛋白+菌、發(fā)酵豌豆蛋白肽在灌胃劑量為0.4,0.8,1.6 g/kg 時(shí),均能增加小鼠腸道菌群的豐富度,且豌豆蛋白效果更強(qiáng)。

圖3 小鼠腸道菌群稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of intestinal flora in mice

2.3.2 小鼠糞便菌群等級(jí)聚類曲線分析 等級(jí)聚類曲線是從豐富度和均勻度兩方面揭示物種多樣性的一種方法[26]。在水平方向上,曲線的寬度代表物種的豐富度,豐富度越高,在橫軸上的跨度越大;在垂直方向上,曲線的平滑程度代表物種的均勻程度,曲線越平緩,物種分布越均勻。如圖4所示,D、E、C、K 組豐富度最高,F(xiàn)、L、I、H 組豐富度最低。圖中各樣品曲線平滑度較好,整體趨勢(shì)趨于平緩,僅有末端略微曲折,表明樣品中物種分布較為均勻。

圖4 小鼠腸道菌群等級(jí)聚類曲線Fig.4 Rank abundance of intestinal flora in mice

2.3.3 小鼠糞便菌群中α 多樣性指數(shù)分析 α 多樣性可以衡量微生物群落的多樣性和豐富度,度量標(biāo)準(zhǔn)常包括ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、shannon 指數(shù)和simpson 指數(shù),它們的大小與微生物群落構(gòu)成的多樣性呈正相關(guān)[27]。其中ACE 和Chao 指數(shù)大小用來反映群落的豐富度,shannon 和simpson 指數(shù)用來反應(yīng)群落構(gòu)成的多樣性[28]。如表3所示,B組小鼠ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)相對(duì)于A 組顯著提高(P<0.05),但是shannon 指數(shù)和simpson 指數(shù)顯著降低(P<0.05),這說明抗生素的使用增加了小鼠腸道中微生物的豐富度,但卻使其多樣性降低,這可能與小鼠腸道中厚壁菌門細(xì)菌大量增加有關(guān)。發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠顯著增加小鼠腸道中微生物群落的多樣性(P<0.05),并降低物種豐富度,與空白組無顯著差異,而且隨著灌胃濃度升高,小鼠腸道菌群多樣性和豐富度降低,劑量為1.6 g/kg時(shí),小鼠腸道菌群豐富度和多樣性均較高,與空白組無顯著差異。

表3 小鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù)(n=3,±s)Table 3 The α diversity index of intestinal flora in mice (n=3,±s)

表3 小鼠腸道菌群α 多樣性指數(shù)(n=3,±s)Table 3 The α diversity index of intestinal flora in mice (n=3,±s)

注:不同字母之間表示具有顯著性差異,P<0.05。

分組 ACE Chao1 shannon simpson A 121.7±4.1cde 118±10.3cde 3.8±0.29a 0.88±0.05a B 196.7±7.5ab 209±6.6ab 1.7±0.239b 0.58±0.05b C 193.6±11.3abc 198±18.4abcd 3.6±0.239a 0.85±0.03a D 208.8±13.2a 270±15.5a 4.1±0.469a 0.89±0.06a E 191±30.7abc 250±21.3 120±10.9 109±6.3d 114±25.4 a 4.12±0.39a 0.91±0.046a F 60.6±9.2ef bcde 3.3±0.29ab 0.81±0.05ab G 52.5±6.7ef e 3.8±0.52a 0.88±0.04a H 56.7±5.1ef de 3.3±0.35ab 0.81±0.03ab I 30.8±5.8f 86±15e 3.3±0.28ab 0.85±0.05a J 124±24.9bcde 207±28.8abc 3.7±0.17a 0.86±0.04a K 148.8±21abcd 206±20.2abc 3.5±0.23a 0.83±0.04a L 60.2±7ef 114±18.4de 3.2±0.24ab 0.81±0.05ab M 87.2±10.1def 140±11.5bcde 3.1±0.27ab 0.81±0.07ab

2.4 小鼠糞便菌群β 多樣性分析

β 多樣性分析是對(duì)不同樣本中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行的比較分析,直觀的反映出不同樣本間微生物群落構(gòu)成的相似性[29]。PCoA 分析(主坐標(biāo)分析)是用于評(píng)估不同樣本間β 多樣性的方式之一?;赨nweighted Unifrac 距離的PCoA 分析主要針對(duì)于一些稀有物種,而基于Weighted Unifrac距離的PCoA 分析則對(duì)豐度較高的物種更加敏感[30]。如圖5所示,在Unweighted Unifrac 分析圖中,兩種主成分對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)值分別是23.03%和27.33%,A 與H、I 組的距離較近,與其余各組的距離較遠(yuǎn),且B 組與所有組之間均呈現(xiàn)比較離散的狀態(tài),這說明給小鼠灌胃鹽酸林可霉素后,小鼠腸道菌群中的一些稀有物種的種類發(fā)生改變,當(dāng)用豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽進(jìn)行干預(yù)后,除了A 與H 和I 組具有相似的稀有物種組成外,其余各組之間稀有物種的相似性較低。在Weighted Unifrac 分析圖中,A與C、H、K、I 的距離相近,B 依然與其余各組均保持較遠(yuǎn)的距離,因此,鹽酸林可霉素導(dǎo)致小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大程度的改變,豌豆蛋白、豌豆蛋白+菌、酶解豌豆蛋白粉+菌以及灌胃劑量為1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽的干預(yù)使得小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成向正常組靠近。

圖5 基于Unweighted Unifrac 距離(a)和Weighted Unifrac 距離(b)的PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis based on the Unweighted Unifrac distance (a) and Weighted Unifrac distance (b)

2.5 功能預(yù)測(cè)

2.5.1 功能相對(duì)豐度分析 KEGG 將代謝通路分為6 大類,分別是代謝(Metabolism)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、細(xì)胞進(jìn)程(Cellular Processes)、人類疾?。℉uman Diseases)和生物體系統(tǒng)(Organismal Systems),它們的變化情況如圖6所示。A 組代謝相關(guān)的基因相對(duì)豐度分別為新陳代謝(48.16%)、遺傳信息處理(22.09%)、環(huán)境信息處理(12.2%)、細(xì)胞過程(6.92%)、人類疾?。?.95%)、生物體系統(tǒng)(2.05%),B 組新陳代謝(43.92%)、細(xì)胞過程(6.27%)、生物體系統(tǒng)(1.38%),這些功能所占比例相對(duì)于A 組明顯降低,但是遺傳信息處理(24%)、環(huán)境信息處理(15.53%)、人類疾?。?.38%)功能所占比例明顯增加。

圖6 Tax4Fun 功能注釋相對(duì)豐度柱形圖Fig.6 Tax4Fun functional annotation relative abundance histogram

每一個(gè)代謝通路又被分為多個(gè)等級(jí),以便更詳細(xì)的反映出不同處理組小鼠腸道菌群的功能差異性。如圖7功能注釋聚類熱圖所示,小鼠在連續(xù)喂食鹽酸林可霉素后,相對(duì)于A 組,其腸道菌群基因組中與糖代謝(Carbohydrate metabolism)、脂代謝(Lipid metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、輔因子和維生素代謝(Metabolism of cofactors and vitamins)、能量代謝(Energy metabolism)相關(guān)基因豐度降低,但是核苷酸代謝(Nucleotide metabolism)基因豐度增高,同時(shí)B 組小鼠腸道菌群表現(xiàn)出衰老(Aging) 和傳染病(Infectious diseases) 基因豐度增高,免疫系統(tǒng)(Immune system)基因豐度降低,從而增加小鼠罹患疾病的概率,而且糖、脂、氨基酸和能量代謝的降低也會(huì)增加小鼠肥胖的風(fēng)險(xiǎn),這可能跟小鼠腸道菌種厚壁菌門細(xì)菌增多,而擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量下降相關(guān)。小鼠在喂食各組樣品后,一定程度上提高了小鼠的營養(yǎng)物質(zhì)和能量代謝水平,并降低了核苷酸代謝。核苷酸代謝異常也會(huì)引起一系列的疾病,嘌呤代謝過快產(chǎn)生過多的尿酸積累在體內(nèi)引起高尿酸血癥[31]。因此,這些基因功能的改變提示豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉以及發(fā)酵豌豆蛋白肽能夠改善抗生素引起的腸道菌群紊亂。

圖7 Tax4Fun 功能注釋聚類熱圖Fig.7 Tax4Fun function annotation clustering heatmap

2.5.2 功能注釋PCA 分析 基于數(shù)據(jù)庫的功能注釋的豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果對(duì)各組樣本進(jìn)行PCA 分析,可以直觀的反映出各組小鼠腸道菌群功能組成的相似性。如圖8所示A 與B 遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開,說明A、B兩組功能組成差異較大,但是A 與除B 組以外各組分布較為集中,說明經(jīng)樣品處理后的各組小鼠腸道菌群的功能組成與正常組小鼠非常接近。

圖8 Tax4Fun 功能注釋PCA 結(jié)果Fig.8 PCA result of Tax4Fun function annotation

2.6 小鼠結(jié)腸HE 染色結(jié)果分析

如圖9所示,A 組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞和腸絨毛排列整齊,腸腺內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量豐富,無淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,形態(tài)良好。而在B 組中,腸絨毛排列雜亂無章,邊緣出現(xiàn)斷裂,并有明顯的炎性細(xì)胞浸潤。部分腸腺之間發(fā)生融合,杯狀細(xì)胞減少,體積增大并出現(xiàn)空泡。杯狀細(xì)胞主要分布在黏膜上皮,主要行使分泌黏蛋白的功能,形成黏液層,為腸黏膜在受到外源病菌和腸道固有菌侵襲時(shí)提供保護(hù)屏障[32]。研究表明,在腸炎、結(jié)腸癌患者體內(nèi),杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少[33]。小鼠食用發(fā)酵豌豆蛋白肽后,結(jié)腸黏膜受損程度得到不同程度的改善,灌胃劑量為1.6 g/kg 的小鼠結(jié)腸絨毛排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤,杯狀細(xì)胞形態(tài)正常且數(shù)量豐富,灌胃濃度升高和降低,都會(huì)出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤,且濃度降低還出現(xiàn)黏膜下層和肌層間隙增大的現(xiàn)象。豌豆蛋白、豌豆肽以及酶解豌豆蛋白粉也能降低小鼠結(jié)腸黏膜受損程度,但在降低炎性細(xì)胞浸潤、調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量方面不及灌胃劑量為1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽組。

圖9 小鼠結(jié)腸HE 染色Fig.9 HE staining of the colon of mice

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過給小鼠灌胃鹽酸林可霉素成功建立腸道菌群紊亂模型,小鼠菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為菌群多樣性降低,厚壁菌門細(xì)菌增多,擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量減少。對(duì)小鼠腸道菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè),紊亂小鼠腸道菌總基因組中與葡萄糖代謝、脂代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝相關(guān)基因豐度降低,核苷酸代謝相關(guān)基因的豐度升高,與人類疾病如衰老、傳染病相關(guān)的基因豐度升高,而免疫系統(tǒng)基因豐度降低,可見鹽酸林可霉素改變了小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌的種類和豐度,并引起小鼠代謝異常,增加患病的概率。此外對(duì)紊亂小鼠結(jié)腸進(jìn)行HE 染色進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn),菌群紊亂小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出一定程度的受損,炎癥因子大量浸潤、杯狀細(xì)胞減少且出現(xiàn)空泡現(xiàn)象,嚴(yán)重?fù)p害了小鼠結(jié)腸的腸黏膜屏障,增加了病原菌入侵的幾率。給小鼠灌胃發(fā)酵豌豆蛋白肽后,小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)以及結(jié)腸病理變化得到不同程度的改善,其中當(dāng)灌胃劑量為1.6 g/kg 時(shí),小鼠與正常組小鼠的菌群多樣性和優(yōu)勢(shì)物種的豐度和構(gòu)成極為相近,且相比于灌胃豌豆蛋白、豌豆肽、酶解豌豆蛋白粉在添加和未添加益生菌的小鼠,灌胃劑量的1.6 g/kg 的發(fā)酵豌豆蛋白肽組的小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,絨毛整齊,紊亂小鼠出現(xiàn)的杯狀細(xì)胞數(shù)量減少、腸腺融合以及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象消失,且厚壁菌門/擬桿菌門比例與空白組更為接近,腸道紊亂狀態(tài)得到更好的恢復(fù)。綜上所述,發(fā)酵豌豆蛋白肽具有良好的調(diào)節(jié)腸道菌群的效果,能夠降低厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌的比例,因此具有一定的減肥功效,并且具有增強(qiáng)結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞的數(shù)量,鞏固黏膜屏障,防止病原菌入侵的作用。

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