方城杰，吳漫漫，于海寧

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310014）

大量的研究證實，腸道菌群的數(shù)量和種類影響著多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。腸道菌群調(diào)節(jié)機體眾多代謝過程，包括能量穩(wěn)態(tài)、葡萄糖代謝和脂質(zhì)代謝等[3]。腸道菌群對機體的調(diào)控依賴于腺苷酸活化蛋白激酶 （adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）通路、膽汁酸、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）和三甲胺通路。其中，膽汁酸在肝臟中產(chǎn)生，并被腸道菌群的酶代謝，對維持健康的腸道菌群，平衡脂代謝等至關(guān)重要[4]。膽汁酸主要通過法尼酯X 受體（farnesoid X Receptor，F(xiàn)XR） 和G 蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體（G protein bile acid receptor-1，TGR5）信號通路來調(diào)節(jié)機體脂代謝[5]。FXR 信號通路不僅控制膽汁酸的合成，還可以通過調(diào)控膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c （sterol-regulatory element binding proteins 1c，SREBP-1c）的表達來影響脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和硬脂酰輔酶A去飽和酶1 （stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）等脂代謝基因。

目前，由于抗生素的大量使用或高脂飲食的影響，機體腸道菌群遭到極大破壞。許多研究表明，抗生素處理后腸道菌群發(fā)生顯著改變，影響機體膽汁酸組成，最終會導(dǎo)致脂代謝異常，引發(fā)糖尿病等疾病[6-7]。機體營養(yǎng)狀態(tài)是防治疾病重要的影響因素，營養(yǎng)干預(yù)對腸道菌群有改善作用，也是防治疾病的重要作用機制[8]。膳食纖維是不易消化碳水化合物和木質(zhì)素的總稱[9]。在高脂飲食模型中，膳食纖維不僅能改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加擬桿菌（Bacteroidetes）豐度，提高SCFAs 含量，還能改善脂肪酸組成，調(diào)節(jié)脂代謝[10]。也有研究者認為，可溶性膳食纖維通過AMPK 和三甲胺實現(xiàn)對機體脂代謝的調(diào)節(jié)[11]。菊粉（inulin，SS）作為一種膳食纖維營養(yǎng)補充劑，被應(yīng)用多種營養(yǎng)強化食品，具有調(diào)節(jié)腸道菌群和改善機體脂質(zhì)平衡的功能[12-13]。

高脂飲食模型能引起腸道菌群紊亂，其含有的脂類物質(zhì)對機體代謝也能產(chǎn)生直接的影響。采用頭孢曲松鈉灌胃，利用其不入血的特點，構(gòu)建單純的腸道菌群紊亂模型，對研究腸道菌群紊亂與脂代謝的關(guān)系更具優(yōu)勢。而膳食纖維是否能修復(fù)腸道菌群紊亂所致脂代謝異常，至今未見報道。

本文以菊粉為材料，通過灌胃頭孢曲松鈉（ceftriaxone，CRO），建立小鼠腸道菌群紊亂模型，探究其改善腸道菌群及修復(fù)脂代謝的作用，以期為膳食纖維的應(yīng)用提供新的理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型建立

SPF 級BALB/c 小鼠30 只，購自上海醫(yī)科院，5 周齡，體重18～20 g，雌雄各半。小鼠在受控的環(huán)境條件（溫度20～24 ℃；濕度40%～60%；12 h 光照/黑暗周期） 下適應(yīng)1 周。隨機分為3 組：正常組（CK 組），頭孢曲松鈉組（CRO 組）和菊粉組（SS組），每組10 只，雌雄各半。除CK 組外其余2 組灌胃CRO 10 d 構(gòu)建腸道菌群紊亂模型。構(gòu)建成功后，CRO 組自然恢復(fù)10 d；SS 組喂養(yǎng)菊粉10 d，劑量為0.04 g/只/d。

在處理前、建模成功、試驗結(jié)束3 個時間點收集每只小鼠的糞便樣本。試驗結(jié)束后，小鼠禁食但不禁水12 h，采用摘除眼球的方式取血，隨后脫頸處死，并取肝臟樣本。全血室溫靜置30 min 后，3 500 r/min 4 ℃離心15 min，吸取上層血清于潔凈離心管中。所有樣本收集后，做好標記，及時放于-80 ℃冰箱中保存。所有試驗程序均按照浙江工業(yè)大學(xué)實驗室動物護理和使用指南進行，并符合美國國立衛(wèi)生研究院實驗室動物護理和使用指南（第85-23 號出版物，1996年修訂）。

1.2 腸道菌群宏基因分析

糞便樣品由浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司完成宏基因組測序。針對樣品16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)，采用通用引物進行PCR 擴增及測序；對測序結(jié)果進行多樣性及菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.3 血脂測定

血清中總甘油三酯 （total triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇 （high density lipoprotein cholesterol，HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C） 和載脂蛋白B48（apolipoprotein B48，APO-B48）均采用試劑盒（南京建成）進行測定。

1.4 糞便SCFAs 測定

稱取干燥后糞便100 mg，加入1.6 mL 純水溶解，充分渦旋振蕩2 min 后，再加入0.4 mL 50%硫酸溶液及1.5 mL 乙醚，放置到搖床中，250 r/min振蕩30 min，取出后，3 000 r/min 離心5 min，取上清于離心管中，加入無水氯化鈣脫水，過0.22 μm濾膜后，乙醚定容至1 mL，取1 μL 進行氣相色譜分析。

1.5 肝臟與血清脂肪酸譜測定

在100 mg 肝組織中加入1 mL 生理鹽水并在0 ℃下全速勻漿5 min，通過與氯仿和甲醇（體積比2∶1） 混合將樣品萃取兩次。在4 ℃下以3 000 r/min 離心10 min 后，分離出有機相。除去上層相并收集下層相，將脂質(zhì)提取物在氮氣流中干燥。

血清樣本取100 μL，加入氯仿和甲醇（體積比2∶1），將樣品萃取兩次。在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min 后，分離出有機相。除去上層相并收集下層相，將脂質(zhì)提取物在氮氣流中干燥。并進行衍生化：取1 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇放入用氮氣密封的干燥管中，在60 ℃水浴中加熱10 min；通過添加1.5 mL 的13%BF3-甲醇并在60 ℃水浴中溫育40 min 進行甲基叔丁基醚衍生化。加入1.5 mL 正己烷，渦旋1 min，然后加入飽和氯化鈉溶液并以3 000 r/min 離心15 min 后收集樣品。采用氣相色譜進行脂肪酸譜測定。

1.6 糞便膽汁酸測定

1） 取0.1 g 凍干糞便樣本，加入2 μL 內(nèi)標液（23-nor-5b-cholanoic acid-3a，12b-diol at 1 mg/mL）。

2） 1 mL 樣本加入4 mL 0.4 mol/L 碳酸銨。孵育30 min，60 ℃。

3） 加入4 mL 水，均質(zhì)化30 s。

4） 離心20 min，20 000 r/min，4 ℃。

5） 固相萃?。翰捎梅聪喽趸鐲18 色譜柱，色譜柱依次通過5 mL 甲醇和5 mL 水活化，加入離心后上清液，之后依次使用20 mL 水、10 mL己烷、20 mL 水、10 mL 己烷、20 mL 水洗脫，最后使用甲醇洗脫膽汁酸。

6） 將含有膽汁酸的甲醇溶液使用氮氣吹干，50 ℃。

7） 使用150 μL 甲醇重溶，采用液質(zhì)聯(lián)用進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 8.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準誤表示。

2 結(jié)果

2.1 菊粉對腸道菌群的修復(fù)作用

CRO 處理后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，通過SS 干預(yù)能夠促進部分腸道菌群豐度的恢復(fù)（圖1a 和1b）。通過Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可知（圖1c 和1d），小鼠的腸道菌群多樣性經(jīng)CRO 處理后明顯降低，SS 干預(yù)后仍低于處理前。由此，SS 干預(yù)能促進部分有益菌豐度的顯著增加，并不能快速提高小鼠腸道菌群的多樣性。由圖1e 和1f 可知，經(jīng)SS 干預(yù)后，頭孢曲松鈉處理導(dǎo)致的門水平擬桿菌門、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）的改變均得到顯著修復(fù)。這3類菌群是小鼠腸道菌群的主要微生物群類，占總菌的90%以上，而其中變形菌門被認為是一種致病菌[14]，該菌門豐度的增加往往意味著腸道菌群紊亂，同時它也是肥胖等疾病的潛在診斷標準[15-16]，SS 能夠顯著降低變形菌門的豐度。同時，擬桿菌和厚壁菌參與了脂類和膽汁酸代謝，維持宿主體內(nèi)能量平衡。擬桿菌和變形菌都能產(chǎn)生膽汁酸水解酶（bile salt hydrolase，BSH），能夠水解共軛膽汁酸[17-19]。SS 能夠明顯增加這兩種菌門的豐度。因此，SS 可能通過修復(fù)腸道菌群紊亂改善膽汁酸代謝，并改善脂代謝異常。此外擬桿菌和厚壁菌比例的失調(diào)可能會增加肥胖的概率[20-21]。從屬水平上看，擬桿菌屬為擬桿菌門，它們除了能夠代謝共軛膽汁酸為游離膽汁酸外，還具有較高的7α-/7β-脫羥基酶活性，能夠在腸道中將初級膽汁酸代謝為次級膽汁酸[22]。擬桿菌屬（Bacteroides）也被認為是一類有益的腸道菌群[23-24]。SS 的干預(yù)能顯著提高擬桿菌屬的豐度，從而增加BSH 活性并減少共軛膽汁酸含量，促進初級膽汁酸代謝，改善機體代謝。

圖1 小鼠腸道菌群豐度變化Fig.1 Changes of gut microbial community profiles in mice

2.2 菊粉對血脂指標的修復(fù)作用

由圖2可知，與CRO 組相比，SS 干預(yù)能顯著降低TG、TC 水平，并提高HDL-C 水平。因此，SS干預(yù)對腸道菌群紊亂引起的血脂異常具有修復(fù)作用。由APO-B48 測定結(jié)果可知（圖2e），SS 干預(yù)能降低乳糜微粒含量，改善小鼠體內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運。

圖2 膳食纖維對小鼠血脂的影響Fig.2 Effects of SS on lipids metabolism shifts in mice

2.3 菊粉對小鼠糞便中SCFAs 含量的影響

腸道菌群發(fā)生顯著改變，而腸道菌群的這種變化會直接導(dǎo)致SCFAs 含量明顯降低。從圖3的結(jié)果可知，CRO 的處理會導(dǎo)致腸道短鏈脂肪酸含量顯著降低，經(jīng)過SS 營養(yǎng)干預(yù)7，14 d，丙酸、丁酸和戊酸水平的提高均快于CRO 處理后的自然組。因此，SS 干預(yù)能夠促進CRO 處理后短鏈脂肪酸水平的恢復(fù)，可見其對腸道菌群紊亂的修復(fù)功能。

圖3 膳食纖維對小鼠糞便SCFAs 的作用Fig.3 Contents of SCFAs in feces of mice

2.4 菊粉對肝臟與血清脂肪酸譜的調(diào)節(jié)作用

CRO 處理后，自然恢復(fù)組小鼠肝臟與血清脂肪酸與對照組相比仍顯著不同（表1和表2），CRO的處理可導(dǎo)致棕櫚烯酸、油酸和神經(jīng)酸含量顯著上升，而硬脂酸、亞油酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和花生四烯酸的含量顯著降低。SS 干預(yù)降低了棕櫚烯酸的含量，并使它們恢復(fù)到了正常水平。同時，SS 干預(yù)提高了硬脂酸、亞油酸、花生四烯酸、EPA 和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的含量?？傮w來說，SS干預(yù)能顯著修復(fù)腸道菌群紊亂引起的脂肪酸譜的改變。

表1 肝臟脂肪酸譜Table 1 Contents of fatty acids in liver

表2 血清脂肪酸譜Table 2 Contents of fatty acids in serum

2.5 菊粉對膽汁酸的調(diào)節(jié)作用

SS 干預(yù)能促進TG 和TC 修復(fù)，膽固醇是膽汁酸合成前體物質(zhì)，我們推測SS 能夠影響膽汁酸代謝，因此采用液質(zhì)聯(lián)用法測定了小鼠糞便中膽汁酸含量。由圖4a 可知，CRO 處理提高了牛磺共軛膽汁酸的含量，而降低了?；浅跫壞懼岬暮?；SS 的干預(yù)促進了?；鞘懰岷康幕謴?fù)，而對其余?；悄懼岬暮縿t無此作用。由圖4b 可知，除了甘氨熊脫氧膽酸外，其余甘氨膽汁酸含量均受到CRO 處理的影響，以甘氨膽酸的含量增加最為顯著；在SS 干預(yù)下，其含量恢復(fù)到了正常水平。由圖4c 可知，CRO 處理提高了膽酸和鵝脫氧膽酸含量，降低了熊脫氧膽酸、脫氧膽酸和石膽酸的含量。在SS 的干預(yù)下，膽酸得到了完全的恢復(fù)，而其它游離膽汁酸改善則不明顯?？偨Y(jié)膽汁酸的結(jié)果可知（圖4d），SS 的干預(yù)主要降低了甘氨膽汁酸、游離膽汁酸和初級膽汁酸的含量，其并未完全修復(fù)CRO 引起的膽汁酸含量改變，但其能夠修復(fù)甘氨膽酸和游離膽酸含量，并降低游離膽汁酸和初級膽汁酸含量。

圖4 膳食纖維對糞便中膽汁酸含量的影響Fig.4 Effects of dietary fiber on bile acids contents in fecal samples

3 討論

根據(jù)腸道菌群結(jié)果可知，CRO 降低了代謝膽汁酸的菌群豐度，結(jié)合膽汁酸的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，共軛膽汁酸和初級膽汁酸的含量明顯增加，而膽汁酸譜的改變會引起FXR 信號通路發(fā)生顯著改變，F(xiàn)XR 信號通路可以調(diào)節(jié)脂代謝過程，因此CRO 引起的脂代謝異常是通過腸道菌群誘發(fā)膽汁酸譜改變來實現(xiàn)的。SS 能夠顯著增加擬桿菌和厚壁菌門以及擬桿菌屬的豐度，它們不僅能夠產(chǎn)生BSH 水解共軛膽汁酸[17-18，25]，還具有一定的代謝初級膽汁酸的能力。因此我們認為SS 能夠增加特定的腸道菌群豐度，調(diào)節(jié)膽汁酸譜結(jié)構(gòu)，影響了FXR 信號通路。從肝臟脂肪酸譜分析結(jié)果可知，CRO 處理引起了小鼠肝臟脂肪酸組成的顯著變化，而這些變化可能是通過改變脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵基因（如FAS、ACC 和SCD1 等）來實現(xiàn)的。結(jié)合上述結(jié)果推測，SS 改善了腸道菌群，通過膽汁酸-FXR信號通路調(diào)節(jié)膽汁酸代謝和脂肪酸代謝 （圖5），最終修復(fù)了由于腸道菌群紊亂引起的脂代謝異常。

圖5 膳食纖維改善腸道紊亂小鼠脂代謝的機制圖Fig.5 The repair mechanism of SS on lipid metabolism shift caused by gut microbiome