孫永勝，許 沙，王宇航，魏新燕，李 晨，4，康紅彥，田洪濤，，4*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 河北保定 071001 2 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術研究中心 河北保定 071001 3 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071001 4 河北省益生功能性乳制品技術創(chuàng)新中心 河北保定 071001）

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好、定量準確等優(yōu)點而被廣泛應用于目的基因表達水平的定量分析[1-3]。當向qRT-PCR 體系中加入熒光標記的特定目的基因時，可通過對內(nèi)參基因的監(jiān)測，實現(xiàn)對目的基因表達狀況實時監(jiān)控的目的[4]。qRT-PCR 結(jié)果的準確性易受cDNA 數(shù)量與質(zhì)量、RNA 質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、引物特異性、qRT-PCR 條件與效率等因素的影響[5]。需引入內(nèi)參基因進行標準校正，以提高qRT-PCR 結(jié)果的準確性[6-7]。目前常用管家基因16S 核糖體RNA 基因（16S rRNA）、鳥苷酸激酶基因（gmk）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）作為內(nèi)參基因[8-9]。管家基因一般在生物體的各組織及各生長階段表達水平比較穩(wěn)定[10]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)：這些管家基因不能在所有生理條件下都穩(wěn)定表達，內(nèi)參基因的表達會隨表達條件的改變而改變[11-12]。目前尚未有任何一種內(nèi)參基因在各種試驗條件下均能穩(wěn)定表達的現(xiàn)象[13-14]。在qRTPCR 研究中，根據(jù)不同試驗條件，選擇合適的內(nèi)參基因尤為重要。

隨著科學技術水平的提高，與發(fā)酵乳制品促進人體健康功能性的揭示以及人們健康意識的增強，發(fā)酵乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展，在國民經(jīng)濟中占有越來越重要的地位，成為“朝陽產(chǎn)業(yè)”。酸奶是最常見的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，為了保持酸奶中乳酸菌的保健功能，酸奶經(jīng)發(fā)酵后含有一定數(shù)量的乳酸菌活菌，在冷藏條件下的貨架期一般為21 d[15-16]。酸奶發(fā)酵劑菌種長期使用可能發(fā)生變異或長期使用國外商業(yè)直投式發(fā)酵劑等不明原因，使冷藏酸奶中的乳酸菌繼續(xù)利用酸奶中殘存的乳糖緩慢發(fā)酵、產(chǎn)酸，這種現(xiàn)象稱為酸奶的后酸化?，F(xiàn)有研究表明：酸奶發(fā)酵劑的重要菌種保加利亞乳桿菌是導致酸奶后酸化的主要菌種[17]。目前大多采用誘變或細胞融合育種、高溫處理工藝、添加防腐劑等技術措施來控制酸奶的后酸化[18]，然而，后酸化基因的調(diào)控機制不清，不能從根本上解決后酸化問題。隨著分子生物學技術的發(fā)展，在通過轉(zhuǎn)錄組測序技術研究保加利亞乳桿菌后酸化形成機制與功能基因篩選的基礎上，研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達量，對于定向選育保加利亞乳桿菌弱后酸化菌株勢在必行。而篩選適宜的內(nèi)參基因是qRT-PCR 研究的關鍵環(huán)節(jié)。目前，有關乳酸菌在不同條件下內(nèi)參基因的篩選與表達穩(wěn)定性分析已有報道[19]，而保加利亞乳桿菌在qRT-PCR 研究中仍選用管家基因作為內(nèi)參基因[20]，對不同內(nèi)參基因在后酸化中經(jīng)歷的酸冷脅迫的穩(wěn)定性與適用性研究卻尚未見報道。

本文以保加利亞乳桿菌模式菌株ATCC11842為試驗菌株，根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選擇5 個候選內(nèi)參基因（16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA），利用qRT-PCR 技術，以ATCC11842 菌株正常培養(yǎng)為對照，研究ATCC11842 菌株的候選內(nèi)參基因在酸脅迫培養(yǎng)和酸冷脅迫培養(yǎng)下的表達水平。采用三款軟件geNorm、NormFinder 和Bestkeeper[21]，分析候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下的表達穩(wěn)定性，篩選獲得最適內(nèi)參基因。通過篩選獲得的最適內(nèi)參基因，分析ATCC11842 菌株的目的基因在酸脅迫和酸冷脅迫下qRT-PCR 的相對表達量，驗證內(nèi)參基因的可靠性。為利用qRT-PCR 技術研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達以及揭示后酸化機制及定向選育弱后酸化菌株提供依據(jù)；也為采用qRT-PCR 技術研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同條件下功能基因表達提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.buLgaricus）ATCC 11842：保加利亞乳桿菌模式菌株，本研究試驗菌株，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心 （China General Microbiological Culture Collection Center CGMCC），-80 ℃超低溫冰箱保存于河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院發(fā)酵工程研究室。

1.1.2 主要試劑 MRS 培養(yǎng)基；DEPC、DNaseI，購于北京康為世紀科技公司；TransZol Up 試劑盒，購于北京全式金生物技術有限公司；RevertAidTM第一鏈cDNA synthesis 試劑盒，購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；SYBRRSelect Master Mix試劑盒，購于美國ABI 公司。

1.1.3 儀器與設備 DL-CJ-1N 型超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；5417R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf；ABI 7500 Real-Time PCR 擴增儀，美國ABI 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下的qRT-PCR 分析

1） 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取與cDNA 的合成

①候選內(nèi)參基因在不同表達條件下的樣品制備 保加利亞乳桿菌ATCC11842 經(jīng)初始pH 值6.5 的MRS 液體培養(yǎng)基42 ℃培養(yǎng)活化2～3 次，以1%（體積分數(shù)） 接種于起始pH 6.5、200 mL 液體MRS 的三角瓶中，42 ℃培養(yǎng)9 h 至對數(shù)中期后分裝3 份（50 mL/管），常溫下6 000 r/min、10 min 離心收集菌體，分別在3 種不同的條件下進行培養(yǎng)：一是空白對照（CK）培養(yǎng)：離心管中第1 份離心收集的菌體加入pH 6.5 的50 mL 液體MRS，42 ℃培養(yǎng)40 min；二是T1 酸脅迫培養(yǎng)[22]：離心管中第2份離心收集的菌體加入pH 4.8 的50 mL 液體MRS，42 ℃培養(yǎng)40 min；三是T2 酸冷脅迫培養(yǎng)：離心管中第3 份離心收集的菌體加入起始pH 4.8的50 mL 液體MRS，4 ℃培養(yǎng)40 min。以上3 個樣品分別離心收集菌體（其中：CK 和T1 酸脅迫樣品在室溫下6 000 r/min 離心10 min，T2 酸冷脅迫樣品在4 ℃下6 000 r/min 離心10 min），經(jīng)液氮冷凍后入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

②候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取與cDNA 的合成 將3 個-80 ℃凍存的樣品分別在預冷研缽中用液氮研磨至質(zhì)地細膩的粉末；按照TransZol Up 試劑盒說明書方法提取各樣品總RNA；利用DNaseI 去除各樣品總RNA中的基因組DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣品總RNA 的完整性；借助紫外分光光度計檢測各樣品OD260/OD280與OD260/OD230的比值 （注：OD260/OD280＞1.8（DNA）～2.0（RNA），若比值小，說明核酸中存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的污染；OD260/OD230＞1.8（DNA）～2.0（RNA），若比值小，說明存在碳水化合物與鹽（胍鹽）的污染），判斷各樣品總RNA 的純度和濃度。

采用RevertAidTM 第一鏈cDNA synthesis（Fermentas）將各樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA：在利用DNaseI 去除各樣品總RNA 中的基因組DNA基礎上，按照給出的體系合成各樣品cDNA 第一條鏈。反應體系：5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTMRNA 酶抑制劑 （20 U/μL） 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTM M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）1 μL，總體系為20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃5 min，42 ℃60 min，75 ℃5 min 終止反應。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10 倍，分裝（20 μL/支）-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2） qRT-PCR 內(nèi)參基因與需要驗證的功能基因的選擇及其引物設計 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果中估算的基因表達量FPKM 值，選擇5 個功能不同的候選內(nèi)參基因，分別為16SrRNA、rpoB、ldh、rodA 和recA。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果中KEGG 數(shù)據(jù)，選擇3 個用于做為驗證篩選的內(nèi)參基因的目的基因，分別為：與細胞膜上H+-ATPase相關的基因（Ldb1301）、參與碳水化合物和丙酮酸代謝途徑的相關基因（poxI）、參與負責內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)折疊的相關基因（dnaJ）。依據(jù)NCBI 已公布的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCC 11842 的基因組中相應的序列，采用DNAMAN 6.0 軟件設計5 個候選內(nèi)參基因與3 對目的基因的引物，引物序列由華大基因合成，見表1。

表1 候選內(nèi)參基因與目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of candidate internal reference gene and target gene

3） 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下qRT-PCR 分析

①qRT-PCR 反應條件 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR 反應程序，按照ABI 公司的SYBRRSelect Master Mix 試劑盒說明書的反應體系進行，在ABI 7500 Real-Time PCR 擴增儀上完成。qRT-PCR20 μL 反應體系：cDNA template 1 μL、2×SYBRRSelect Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL，加入ddH2O 補齊至20 μL。qRT-PCR擴增程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，激活Taq DNA polymerase 的活性；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。每個樣品反應重復3 次。

②引物特異性鑒定、擴增標準曲線及擴增效率計算 引物特異性鑒定：qRT-PCR 產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并作qRT-PCR 擴增后熔解曲線圖分析，檢測溫度為60～95 ℃，每升溫1℃，采集5 次熒光信號。判斷引物特異性。

擴增標準曲線及擴增效率計算：以候選內(nèi)參基因的cDNA 第一條鏈為模板，進行10 倍濃度梯度稀釋，配置5 個濃度梯度系列（10-1～10-5），以濃度稀釋梯度的對數(shù)為橫坐標，以候選內(nèi)參基因的3 次重復的平均Ct 值為縱坐標，繪制候選內(nèi)參基因的擴增標準曲線；采用qRT-PCR 自帶軟件計算候選內(nèi)參基因擴增標準曲線的擴增效率E（%）=（10-1/斜率-1）×100、斜率、回歸系數(shù)R2。

③候選內(nèi)參基因Ct 值的分析 qRT-PCR 結(jié)束后，儀器自動給出各個樣品的Ct 值；再用Excel對原始Ct 值進行統(tǒng)計計算得出平均Ct 值；繪出候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫不同表達條件下Ct 值分布圖，根據(jù)Ct 值越低，基因表達量即豐度越高，進行分析比較。

1.2.2 采用3 款軟件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper）分析比較候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性

1） 3 款軟件分析比較之前的數(shù)據(jù)處理方法qRT-PCR 結(jié)束后，儀器自動給出各個樣品的Ct值；用Excel 對原始Ct 值進行統(tǒng)計計算得出每個候選內(nèi)參基因的平均Ct 值，根據(jù)每個候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Bestkeeper 軟件分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性。根據(jù)每個候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，利用2-△△Ct法計算在酸脅迫和酸冷脅迫不同表達條件下候選基因的相對表達量，根據(jù)不同候選內(nèi)參基因在不同表達條件下的相對表達量，用geNorm、NormFinder 軟件分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性。

2） geNorm 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 geNorm 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對表達量，換算成候選內(nèi)參基因平均表達穩(wěn)定值M，繪制geNorm 分析候選內(nèi)參基因平均表達穩(wěn)定值M 值圖。一般M 值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高；通常M 值＜1.5，候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性非常高，可作為內(nèi)參基因。

與此同時，geNorm 軟件可以對候選內(nèi)參基因的相對表達量做標準化因子配對差異分析（Vn/n+1），以確定內(nèi)參基因最佳數(shù)目，繪制geNorm 分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性最適數(shù)目圖，一般Vn/n+1＜0.15，表示以n 個基因做為內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，無需選擇更多的內(nèi)參基因；如果Vn/n+1＞0.15，則表示以n 個基因做為內(nèi)參基因不穩(wěn)定，需要引入n+1 個基因做為內(nèi)參基因才能穩(wěn)定。

3） NormFinder 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 NormFinder 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對表達量，通過求取組內(nèi)和組間方差，計算平衡表達穩(wěn)定值SV 及排名，繪制NormFinder 分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的SV 值及排名表。一般SV 值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高，排名越前。

4） Bestkeeper 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 Bestkeeper 軟件可以根據(jù)每個候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Excel 計算候選內(nèi)參基因之間的標準偏差SD 與變異系數(shù)CV%，繪制Bestkeeper 分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的SD 值與CV%值及排名表。一般SD 值與CV%值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高，排名越靠前；如果SD值＞1，則認為內(nèi)參基因不穩(wěn)定。

5） 利用幾何平均值法對候選內(nèi)參基因進行綜合排名 采用Excel 的幾何平均值計算法對geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進行幾何平均數(shù)綜合排名，繪制利用幾何平均值法對候選內(nèi)參基因進行綜合排名表。一般幾何平均值越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高，排名越前。然后根據(jù)3 種軟件排名穩(wěn)定性的r值，分析3 種軟件之間的相關性。

1.2.3 篩選獲得的內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性的驗證 根據(jù)篩選獲得的內(nèi)參基因在qRT-PCR 中不同條件下的表達量，計算目的基因在qRT-PCR 中不同條件下的相對表達量，繪制以篩選獲得的內(nèi)參基因的表達量分析目的基因的相對表達量圖，通過生物統(tǒng)計學分析目的基因在不同條件下相對表達量的差異顯著性，分析目的基因相對表達量的qRT-PCR 結(jié)果是否與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致，進而驗證篩選獲得的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫條件下的qRT-PCR 分析

2.1.1 候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 質(zhì)量檢測 根據(jù)1.2.1 節(jié)（1）①、②試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下總RNA 的提取，總RNA 的檢測結(jié)果，見圖1、表2。

由圖1可見，提取樣品的總RNA 的23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA條帶清晰，表明ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫不同條件下提取的總RNA 完整性良好。表2顯示，提取樣品的 總RNA 的OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm均 在1.8～2.0 之間，表明ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫不同條件下提取的總RNA 的純度和質(zhì)量較高?？捎糜诤罄m(xù)試驗。

圖1 11842 菌株在酸與酸冷脅迫下總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 The electrophoresis of total RNA agarose gel of 11842 strain under acid and acid cold stress

表2 11842 菌株在酸與酸冷脅迫下總RNA 的定量檢測結(jié)果Table 2 Quantitative detection results of total RNAof 11842 strain under acid and acid cold stress

2.1.2 候選內(nèi)參基因引物特異性鑒定、擴增標準曲線及擴增效率分析 根據(jù)1.2.1 節(jié)（2）、（3）①、②試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下5 個候選內(nèi)參基因的引物特異性鑒定、擴增標準曲線及擴增效率分析，結(jié)果見圖2、圖3、圖4、表3。

由圖2看出，以ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行qRT-PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，5 個候選內(nèi)參基因條帶大小在85～200 bp 之間，與預期的條帶大小一致，而且各條帶均比較清晰、均呈單一條帶，表明5 個候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴增產(chǎn)物均比較單一，沒有出現(xiàn)引物二聚體與其它非正常擴增產(chǎn)物。

圖2 5 個候選內(nèi)參基因qRT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of qRT-PCR products of 5 candidate internal reference genes

由圖3可知，5 個候選內(nèi)參基因經(jīng)qRT-PCR在65～95 ℃下擴增的熔解曲線，均呈單一信號峰，無其它非特異性雜峰產(chǎn)生，表明5 個候選內(nèi)參基因的引物設計合理，均能實現(xiàn)候選內(nèi)參基因的特異性擴增。

圖3 5 個候選內(nèi)參基因qRT-PCR 熔解曲線Fig.3 qRT-PCR melting curves of 5 candidate internal reference genes

由圖4可見，5 個候選內(nèi)參基因的qRT-PCR擴增標準曲線中，每個內(nèi)參基因的cDNA 模板濃度分別與Ct 值成反比，各點基本分布在一條直線上。表3顯示，5 個候選內(nèi)參基因的qRT-PCR 擴增效率在91%～97%范圍內(nèi)、相關斜率的回歸系數(shù)R2均≥0.990。上述結(jié)果表明，5 個內(nèi)參基因所設計引物的qRT-PCR 擴增，線性關系良好，擴增效率較高，符合qRT-PCR 擴增要求，試驗結(jié)果準確可靠。

表3 5 個候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴增效率E%、斜率與回歸系數(shù)R2Table 3 Five candidate internal reference genes qRT-PCR amplification efficiency E%,slope and regression coefficient R2

圖4 5 個候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴增標準曲線Fig.4 Five candidate internal reference genes qRT-PCR expansion standard curve

2.1.3 候選內(nèi)參基因Ct 值的分析 基因表達豐度是指基因轉(zhuǎn)錄成mRNA 的數(shù)量，基因表達豐度越高，轉(zhuǎn)錄成mRNA 的數(shù)量越多，合成的蛋白質(zhì)也越多。Ct 值越小，表示基因的拷貝數(shù)越高，基因表達豐度越高。通過不同條件下qRT-PCR 的Ct 值變化，可以評價候選內(nèi)參基因表達豐度變化。根據(jù)1.2.1 節(jié) （3） ③試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下Ct 值的分析，結(jié)果見圖5。

由圖5可看出，5 個候選基因的平均Ct 值介于29.38～36.42 之間，其中rpoB 的Ct 值最小，表達豐度最高；recA 的Ct值最大，表達豐度最低；其它3 個候選內(nèi)參基因的Ct 值變化范圍分別是，16SrRNA （30.01～32.11），ldh （29.23～31.01），rodA（31.29～32.48）。統(tǒng)計分析表明，同一內(nèi)參基因在不同試驗處理條件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）的表達量存在顯著（或極顯著）差異，其中，處理組（酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）與對照組（正常培養(yǎng)CK）相比，存在顯著（或極顯著）差異，說明酸脅迫和酸冷脅迫能夠產(chǎn)生顯著（或極顯著）影響。從同一內(nèi)參基因Ct 值在不同試驗條件下的變化來看，rpoB 和recA 變化最小，但仍需利用3 款軟件對候選內(nèi)參基因進行表達穩(wěn)定性分析。

圖5 5 個候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下Ct 值分布圖Fig.5 Ct value distribution of five candidate internal reference genes under acid stress and acid cold stress

2.2 采用3 款軟件（geNorm、NormFinder、Bestkeeper） 分析比較候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性

2.2.1 Genorm 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 geNorm 軟件可以根據(jù)內(nèi)參基因的相對表達量，換算成候選內(nèi)參基因平均表達穩(wěn)定值M 值，一般M 值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高；通常M 值＜1.5，候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性非常高，可作為內(nèi)參基因。與此同時，geNorm 軟件可以對候選內(nèi)參基因的相對表達量做標準化因子配對差異分析（Vn/n+1），以確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，一般Vn/n+1＜0.15，表示以n 個基因做為內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，無需選擇更多的內(nèi)參基因；如果Vn/n+1＞0.15，則表示以n 個基因做為內(nèi)參基因不穩(wěn)定，需要引入n+1 個基因做為內(nèi)參基因才能穩(wěn)定。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（2） 試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性的geNorm 分析，結(jié)果見圖6。

由圖6a 可知，6 個候選內(nèi)參基因在不同試驗處理條件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)） 的M 值均＜1.5，理論上均可以作為內(nèi)參基因；以M 值為標準的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排序為recA（0.005）=rpoB（0.005）＜rodA（0.02）＜ldh（0.03）＜16SrRNA（0.04）。表明recA 和rpoB 的M 值最小，表達穩(wěn)定性最高，適宜作為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達的內(nèi)參基因。

由圖6b 可見，所有3 個條件組的標準化因子配對差異值Vn/n+1值均＜0.15，而且V2/3 配對變異值最小（0.009）。表明沒有必要引入第3 個內(nèi)參基因，適宜的內(nèi)參基因數(shù)目為2 個。

圖6 geNorm 軟件分析5 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值與最適數(shù)目Fig.6 geNorm software analyzes the expression stability value and optimal number of 5 candidate internal reference genes

2.2.2 NormFinder 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 NormFinder 軟件可以根據(jù)候選內(nèi)參基因的相對表達量，通過求取組內(nèi)和組間方差，計算平衡表達穩(wěn)定值SV 及排名。一般SV 值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高，排名越前。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（3） 試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性的NormFinder 分析，結(jié)果見表4。

表4顯示，以SV 值為標準的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的排序為recA（0.002）=rpoB（0.002）＜ldh（0.024）＜rodA （0.026）＜16SrRNA （0.035）。表明recA 和rpoB 的SV 值最小，表達穩(wěn)定性最高，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達的內(nèi)參基因，與geNorm 軟件分析結(jié)果相符。

表4 NormFinder 軟件分析5 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性與排名Table 4 NormFinder software analyzes the expression stability and ranking of 5 candidate internal reference genes

2.2.3 Bestkeeper 分析比較候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性 Bestkeeper 軟件可以根據(jù)每個候選內(nèi)參基因Ct 值的平均值，用Excel 計算候選內(nèi)參基因之間的標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV%），一般SD值與CV%值越小，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性越高，排名越前；如果SD 值＞1，則認為內(nèi)參基因不穩(wěn)定。根據(jù)1.2.2 節(jié)（1）、（4）試驗方法，進行保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株5 個候選內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性的Bestkeeper 分析，結(jié)果見表5。

由表5看出，5 個候選內(nèi)參基因在不同試驗處理條件下（正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)） 的SD 值均＜1，理論上均可以作為內(nèi)參基因；以CV%±SD 值為標準的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排序為rpoB （0.26±0.08）＜recA （0.49±0.18）＜rodA（1.06±0.18）＜ldh（2.02±0.62）＜16SrRNA（2.81±0.86）。表明rpoB 和recA SD 值與CV%值最小，是表達穩(wěn)定性最高的2 個內(nèi)參基因，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達的內(nèi)參基因，與geNorm 和NormFinder 軟件分析結(jié)果基本吻合。

表5 Bestkeeper 軟件分析5 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性與排名Table 5 Bestkeeper software analyzes the expression stability and ranking of 5 candidate internal reference genes

2.2.4 利用幾何平均值法對候選內(nèi)參基因進行綜合排名 采用Excel 的幾何平均值計算法對geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進行幾何平均數(shù)綜合排名。一般幾何平均值Ct 值越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高，排名越前。再根據(jù)3 款軟件排名穩(wěn)定性的r值，分析3 種軟件之間的相關性。根據(jù)1.2.2 節(jié)（5）試驗方法，對geNorm、NormFinder、Bestkeeper 軟件分析的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名進行幾何平均數(shù)綜合排名，結(jié)果見表6。

由表6看出，根據(jù)幾何平均值Ct 分析，5 個候選內(nèi)參基因在不同試驗處理條件下 （正常培養(yǎng)CK、酸脅迫培養(yǎng)、酸冷脅迫培養(yǎng)）的表達穩(wěn)定性由高到低綜合排名依次是rpoB（1.00）≥recA（1.26）＞rodA（3.30）＞ldh（3.63）＞16SrRNA（5.00），表明rpoB和recA 幾何平均值最小，表達穩(wěn)定性最高，適宜做為保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達的內(nèi)參基因，與geNorm、NormFinder 和Bestkeeper 軟件分析結(jié)果相符。根據(jù)3 款軟件排名穩(wěn)定性的r 值分析它們之間的相關性得出geNorm 與Bestkeeper 之間相關性最高（r=0.93），達到極顯著水平（P＜0.01）。

表6 利用幾何平均值法對候選內(nèi)參基因綜合排名Table 6 Comprehensive ranking of candidate internal reference genes using geometric mean method

2.3 篩選獲得的內(nèi)參基因在酸脅迫和酸冷脅迫下表達穩(wěn)定性的驗證

為了進一步驗證篩選獲得的保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下2 個內(nèi)參基因rpoB 和recA 的表達穩(wěn)定性，通過分析保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株的3 個目的基因Ldb1301 （與細胞膜上H+-ATPase 相關的基因）、poxI （參與碳水化合物和丙酮酸代謝途徑的基因）和dnaJ（負責內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)折疊的基因）在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下的相對表達量而實現(xiàn)。根據(jù)篩選獲得的內(nèi)參基因在qRT-PCR中不同條件下的表達量，計算目的基因在qRTPCR 中不同條件下的相對表達量，通過生物統(tǒng)計學分析目的基因在不同條件下相對表達量的差異顯著性，分析目的基因相對表達量的qRT-PCR 結(jié)果是否與前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致。根據(jù)1.2.3節(jié)試驗方法，驗證篩選獲得的保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在酸脅迫（T1）和酸冷脅迫（T2）下2 個內(nèi)參基因rpoB 和recA 的表達穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。

圖7 以rpoB 和recA 為內(nèi)參基因分析在T1（酸脅迫）和T2（酸冷脅迫）下poxI（a）、Ldb1301（b）、dnaJ（c）的相對表達量Fig.7 Analysis of relative expression levels of poxI（a），Ldb1301 （b），dnaJ （c） under T1 （acid stress）and T2 （acid cold stress） using rpoB and recA as internal reference genes

由圖7可知，以篩選獲得的rpoB 和recA 作為內(nèi)參基因時，3 個目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在qRT-PCR 中酸脅迫和酸冷脅迫下的相對表達量存在顯著差異（P＜0.05），即poxI 和dnaJ 在酸脅迫下表達量均上調(diào)，在酸冷脅迫下表達量均下調(diào)；而Ldb1301 在酸脅迫和酸冷脅迫下表達量均上調(diào)。3 個目的基因在qRT-PCR 中酸脅迫和酸冷脅迫下的相對表達量分析結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組學測序分析結(jié)果一致。本試驗進一步證明，recA 和rpoB 適宜做為qRT-PCR 研究保加利亞乳桿菌ATCC11842 在酸脅迫和酸冷脅迫下基因表達的內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵乳制品工業(yè)在國民經(jīng)濟中占有越來越重要的地位，保加利亞乳桿菌既是酸奶發(fā)酵劑的常用菌種，又是引起酸奶后酸化的主要菌種。隨著分子生物學技術研究的深入，在進行保加利亞乳桿菌后酸化形成機制研究與功能基因篩選時，常利用轉(zhuǎn)錄組測序技術；而對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中后酸化相關功能基因表達量的分析驗證，則多采用qRT-PCR 技術。選擇表達水平穩(wěn)定的內(nèi)參基因是提高qRT-PCR 結(jié)果準確性的重要前提，一般采用管家基因做為qRT-PCR 的內(nèi)參基因[23]，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，這些管家基因并非在所有生理條件下都能穩(wěn)定表達，表現(xiàn)為它們的轉(zhuǎn)錄水平并非穩(wěn)定[11]，目前對保加利亞乳桿菌在不同條件下篩選內(nèi)參基因的研究，尚未見報道。

本文首先根據(jù)前期保加利亞乳桿菌ATCC11842 菌株在后酸化不同條件下轉(zhuǎn)錄組學測序結(jié)果，選擇5 個候選內(nèi)參基因，通過qRT-PCR的基因表達水平即Ct 值分析，結(jié)果表明，同一候選內(nèi)參基因Ct 值在不同試驗條件下，rpoB 和recA表達量變化最小，初步判斷，rpoB 和recA 可做為內(nèi)參基因。此外，在進行qRT-PCR 的Ct 值分析試驗時，做為本底信號3～15 個循環(huán)的熒光信號，通常存在檢測誤差，因此一般取Ct 值在15～35 個循環(huán)的數(shù)據(jù)進行分析。其次，采用3 款軟件geNorm、NormFinder 和Bestkeeper，分析比較了5 個候選內(nèi)參基因在后酸化不同條件下qRT-PCR 的表達穩(wěn)定性，3 款軟件分析比較結(jié)果一致得出：rpoB 和recA 是表達最穩(wěn)定的2 個基因，可作為篩選出的內(nèi)參基因。值得注意的是：由于3 款軟件所用的統(tǒng)計分析方法不同，有時會出現(xiàn)3 款軟件分析比較內(nèi)參基因排名結(jié)果不完全一致的現(xiàn)象[24]，這就需要利用幾何平均值法對候選內(nèi)參基因進行綜合排名。本研究為了提高試驗結(jié)果的可靠性，仍采用幾何平均值法對5 個候選內(nèi)參基因進行綜合排名，結(jié)果表明：綜合排名結(jié)果與3 款軟件分析比較結(jié)果相符。最后，運用篩選出的內(nèi)參基因rpoB 和recA，分析了ATCC11842 菌株3 個目的基因pox-I、Ldb1301 和dnaJ 在后酸化不同條件下qRTPCR 的相對表達量，結(jié)果表明，3 個目的基因在后酸化不同條件下qRT-PCR 的相對表達量的分析結(jié)果與前期轉(zhuǎn)錄組學測序分析結(jié)果一致，進一步證實了本研究篩選獲得的2 個內(nèi)參基因rpoB 和recA 的可靠性。

本試驗篩選獲得的2 個內(nèi)參基因之一rpoB基因，是細菌RNA 聚合酶β 亞基的編碼基因，為單拷貝基因，序列高度保守，在基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。本研究篩選獲得的2 個內(nèi)參基因之二的recA 基因，是細菌中編碼RecA 蛋白的基因，序列高度保守，在DNA 同源重組與DNA 損傷應急修復（SOS）中發(fā)揮重要作用。Lin 等[19]在研究植物乳桿菌R23 經(jīng)SO2脅迫處理前后的基因表達量時，通過篩選8 個候選內(nèi)參基因得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為rpoB、rpoC、recA 和ldh。而趙文靜等[25]研究了ldh、recA、rpoB、gapdh 和16S rRNA 5 個內(nèi)參基因在植物乳桿菌發(fā)酵過程中的表達穩(wěn)定性，結(jié)果表明在不同發(fā)酵時間節(jié)點中表達最穩(wěn)定的是ldh 基因。Wen 等[26]研究了干酪乳桿菌發(fā)酵過程中關鍵酶基因表達變化分析時 對recA、gapd、gyrB、16S rRNA 和ldh 5 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的為gapd 和gyrB 基因。

綜上所述，本研究通過層層篩選與驗證，獲得了保加利亞乳桿菌ATCC11842 在后酸化不同條件下qRT-PCR 表達穩(wěn)定的2 個內(nèi)參基因rpoB 和recA，為利用qRT-PCR 技術深入研究保加利亞乳桿菌后酸化功能基因表達以及進一步揭示后酸化機制及定向選育弱后酸化菌株提供了可靠依據(jù)；也為采用qRT-PCR 技術研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同條件下功能基因表達提供了借鑒指導。