袁 蕊，唐 偉，孫書(shū)軍，趙路寬，胡 楊，馬居奎，王 潔，曹清河，周志林

（江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221131）

甘薯（Ipomoea batatas Lam.），是我國(guó)重要的糧食、經(jīng)濟(jì)和能源作物，具有穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。甘薯塊根中含有大量的淀粉、可溶性糖，少量的蛋白質(zhì)、維生素、纖維素等，在身體健康和疾病預(yù)防方面有重要作用，甘薯既可以作為人類(lèi)的糧食和蔬菜，又能作為工業(yè)原料和飼料[1-2]。我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)，每年種植面積近460 萬(wàn)hm2，占世界甘薯種植面積的50%以上，鮮薯總產(chǎn)量1 億t，占世界甘薯總產(chǎn)量的80%左右[3]。

甘薯主要依靠無(wú)性繁殖，在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中常因病毒的感染而退化，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重受損。由甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）協(xié)生共侵染引起的甘薯病毒?。⊿PVD）對(duì)甘薯產(chǎn)量影響極大，可造成90%以上的產(chǎn)量損失，甚至絕收[4]。莖尖脫毒是應(yīng)對(duì)甘薯病毒病的主要措施，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)脫毒的組培苗是甘薯產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要保障[5]。脫毒后的甘薯能恢復(fù)品種原始的優(yōu)良性狀，采用快速繁殖技術(shù)將甘薯這些優(yōu)良品質(zhì)遺傳下去，可達(dá)到提高甘薯產(chǎn)量和質(zhì)量的目的[6]。但由于品種間的特異性，不同品種的脫毒快繁方法存在差異，一種合理的快速繁殖方式不僅可以節(jié)約大量的成本，還能大幅縮減脫毒甘薯種苗投入實(shí)際生產(chǎn)需要的時(shí)間[7]。此外，甘薯脫毒組培苗的移栽馴化是甘薯離體繁殖程序中的關(guān)鍵步驟，組培苗移栽成活率低，會(huì)造成生產(chǎn)成本大幅度上升[8]，因此，組培苗移栽質(zhì)量和成活率也會(huì)影響在生產(chǎn)上的推廣。

前人對(duì)甘薯脫毒培養(yǎng)研究較多[9-12]，但是針對(duì)近年來(lái)SPFMV 和SPCSV 引起的SPVD 研究較少，并且普遍反映甘薯感染SPVD 后難以脫除[13]。因此，針對(duì)脫除SPVD 甘薯組培苗培養(yǎng)、脫毒組培苗快繁及移栽技術(shù)，本試驗(yàn)利用莖尖分生組織培養(yǎng)和不同病毒抑制劑預(yù)處理相結(jié)合的方法探究SPVD 脫除效率，并通過(guò)添加不同濃度的NAA、6-BA，篩選最適快繁培養(yǎng)基激素組合，同時(shí)分析不同繼代培養(yǎng)時(shí)間和是否煉苗對(duì)脫毒組培苗移栽成活率影響，以期為甘薯脫毒種苗在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

感染SPVD 的徐薯22 和阜徐薯20 病株，均來(lái)自江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所甘薯抗病鑒定圃。

1.2 供試試劑

MS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖，海博生物）、蔗糖（分析純，滬試SCR）、瓊脂粉（Biotopped）、NAA（常熟市福山生化試劑廠(chǎng)）、6-BA（上海宇涵生物科技有限公司），M-MLV、PCRmix 均購(gòu)自takara 北京生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)用不同病毒抑制劑種類(lèi)及濃度見(jiàn)表1。

表1 不同病毒抑制劑

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫除SPVD 甘薯組培苗培養(yǎng) 取感病材料外植體清洗干凈，置超凈工作臺(tái)消毒，解剖鏡下切取帶1～2 個(gè)葉原基的莖尖分生組織[14]，產(chǎn)生愈傷組織后經(jīng)培養(yǎng)、分化出苗、株系分離，參考喬奇等[15]的方法對(duì)甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）檢測(cè)，分別計(jì)算脫除率

對(duì)檢測(cè)出病毒的組培苗，在完成第1 次莖尖脫毒后再次進(jìn)行剝尖培養(yǎng)，完成第2 次莖尖脫毒，重新進(jìn)行病毒檢測(cè)。選出脫毒組培苗培養(yǎng)、繁殖供后續(xù)試驗(yàn)用。本試驗(yàn)培養(yǎng)基為4.4 g/L MS 培養(yǎng)基+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂粉+0.01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，定容到1 L，調(diào)節(jié)pH 值到5.8～6.0。

1.3.2 病毒抑制劑結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng) 取感病材料，按表1 配制不同病毒抑制劑的水溶液，水培72 h，對(duì)照（CK）為水，按1.3.1 步驟進(jìn)行莖尖分生組織培養(yǎng)及病毒檢測(cè)。

1.3.3 不同濃度NAA+6-BA 組合對(duì)組培苗株高的影響 取徐薯22 和阜徐薯20 脫毒組培苗，分別接種在添加有不同濃度NAA 和6-BA 組合的培養(yǎng)基上，30 d 后調(diào)查株高。培養(yǎng)條件：（28±2）℃，日光燈冷光源強(qiáng)度為33 μmol/（m2·s），每天光照9 h，暗培養(yǎng)15 h。

本試驗(yàn)培養(yǎng)基為MS+B5 有機(jī)物（10 mg/L VB1、10 mg/L VB6、10 mg/L 煙酸、10 mg/L 肌醇）+30 g/L蔗糖+9 g/L 瓊脂粉，定容到1 L，調(diào)節(jié)pH 值到5.8～6.0。

1.3.4 移栽試驗(yàn) 徐薯22 和阜徐薯20 脫毒組培苗，在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)（20、30、40、50、60 d）后分別移栽，移栽用基質(zhì)為草炭土∶蛭石∶珍珠巖=5∶4∶1，加0.5 g/L 枯草芽孢桿菌水溶液混勻。煉苗馴化是在組培苗移栽前在室內(nèi)松開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口再培養(yǎng)3 d，然后進(jìn)行移栽；不煉苗是直接移栽到基質(zhì)，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。移栽7 d后，計(jì)算成活率

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理及分析使用Microsoft Excel 2007 軟件，相關(guān)性及顯著性分析采用軟件DPS 15.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖分生組織培養(yǎng)對(duì)甘薯苗SPVD 的脫除效果

由表2 可知，感病材料徐薯22 和阜徐薯20，通過(guò)一次莖尖分生組織培養(yǎng)，SPCSV 的脫除率均達(dá)到100%，SPFMV 的脫除率分別是90.00%和53.33%；通過(guò)二次莖尖分生組織培養(yǎng)，徐薯22 和阜徐薯20 的SPCSV 和SPFMV 脫除率均為100%。所以經(jīng)二次莖尖分生組織培養(yǎng)能完全脫除SPFMV和SPCSV。

表2 不同莖尖分生組織培養(yǎng)次數(shù)對(duì)甘薯SPVD 脫除率的影響 單位：%

2.2 不同病毒抑制劑結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)對(duì)SPFMV 脫除率和成苗率的影響

通過(guò)不同病毒抑制劑水培72 h 后進(jìn)行常規(guī)莖尖分生組織培養(yǎng)，對(duì)成苗進(jìn)行SPFMV 檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。徐薯22 成苗率最高的是對(duì)照（43.33%），SPFMV 脫除率最高的是寧南·嘧肽（100%），這兩組抑制劑成苗率較其他抑制劑有顯著性差異（P＜0.05）；阜徐薯20 成苗率和SPFMV 脫除率最高的均為寧南·嘧肽處理，分別為46.67%和90%，說(shuō)明寧南·嘧肽的預(yù)處理有助于莖尖分生組織培養(yǎng)SPFMV的脫除。

表3 不同病毒抑制劑對(duì)甘薯SPFMV 莖尖成苗率和脫除率的影響 單位：%

2.3 不同濃度NAA+6-BA 組合對(duì)組培苗株高的影響

統(tǒng)計(jì)徐薯22 和阜徐薯20 脫毒組培苗接種在不同濃度NAA+6-BA 組合培養(yǎng)基上的株高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，徐薯22 在A4 處理（0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA）培養(yǎng)基上株高最高，達(dá)到了11.58 cm，顯著（P＜0.05）高于其他組合；而阜徐薯20 在A5 處理（0.01 mg/L NAA+6-BA 1.0 mg/L）培養(yǎng)基上株高最高，達(dá)到了10.00 cm，顯著（P＜0.05）高于其他組合（表4）。

表4 不同濃度NAA+6-BA 組合對(duì)甘薯組培苗株高的影響

2.4 煉苗對(duì)組培苗移栽成活率的影響

由表5 可知，徐薯22 和阜徐薯20 組培苗的成活率在煉苗處理中，隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸升高，培養(yǎng)60 d 時(shí)成活率最高，分別為86.67%和83.33%；在不煉苗處理中，徐薯22 和阜徐薯20 組培苗培養(yǎng)30 d 時(shí)成活率最高分別為75.00%和80.00%。徐薯22 組培苗在培養(yǎng)20 d 和30 d 煉苗成活率顯著小于不煉苗（P＜0.05），在培養(yǎng)40 d 煉苗和不煉苗成活率相等，在培養(yǎng)50 d 和60 d 煉苗成活率顯著大于不煉苗（P＜0.05）；阜徐薯20 組培苗在培養(yǎng)20、30 和40 d煉苗成活率均顯著小于不煉苗（P＜0.05），在培養(yǎng)60 d煉苗成活率顯著大于不煉苗（P＜0.05）。

表5 煉苗對(duì)組培苗移栽成活率的影響

2.5 組培苗成活率與繼代培養(yǎng)時(shí)間、煉苗處理相關(guān)性分析

組培苗成活率與繼代培養(yǎng)時(shí)間、煉苗處理相關(guān)性分析見(jiàn)表6。不同繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)組培苗移栽成活率的相關(guān)性不顯著，這有利于節(jié)約時(shí)間成本；是否煉苗對(duì)不同基質(zhì)快繁苗移栽成活率有極顯著影響，在實(shí)際應(yīng)用中可選擇最優(yōu)的煉苗處理和培養(yǎng)時(shí)間。

表6 組培苗成活率與繼代培養(yǎng)時(shí)間、煉苗處理相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

病毒在植株中通過(guò)胞間連絲實(shí)現(xiàn)細(xì)胞到細(xì)胞間的移動(dòng)，再通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流動(dòng)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)距離移動(dòng)，由于莖尖特殊表達(dá)機(jī)制，抑制了病毒在莖尖的傳遞和復(fù)制，使其不能到達(dá)可存活的組織，莖尖脫毒是應(yīng)對(duì)甘薯病毒病的主要措施[16]。研究表明，利用甘薯莖尖分生組織培養(yǎng)的脫毒苗能較好地恢復(fù)品種的優(yōu)良性狀，比未經(jīng)脫毒的植株增產(chǎn)30%～50%[17]。本試驗(yàn)以感染SPVD 的徐薯22 和阜徐薯20 為材料，進(jìn)行莖尖剝離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次莖尖分生組織培養(yǎng)對(duì)SPCSV 脫除率為100%，SPFMV 需要二次剝尖，二次莖尖分生組織培養(yǎng)對(duì)感病甘薯的脫毒組培苗培養(yǎng)是必要的。

病毒抑制劑對(duì)植物病毒脫毒效果的研究，在大白菜[18]、蝴蝶蘭[19]等植物病毒脫毒中已有應(yīng)用，適宜的病毒抑制劑對(duì)植物病毒脫除有增效作用。試驗(yàn)用4 種不同病毒抑制劑預(yù)處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)，探究對(duì)感病材料SPFMV 的脫除效果，本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)階段發(fā)現(xiàn)甘薯苗在水培第4 天時(shí)，部分甘薯葉片出現(xiàn)異樣（葉片略顯增厚且顏色加深或葉片變黃），所以選用水培72 h。結(jié)果表明，病毒抑制劑寧南·嘧肽處理組對(duì)供試材料適用效果最好，對(duì)阜徐薯20 的病毒脫除增效明顯。

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，植物激素在植物組織生長(zhǎng)、發(fā)育、器官分化中起到了重要的作用，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是合成植物激素，可以調(diào)節(jié)植物的代謝和生理功能[20-21]。在組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度是影響組培苗誘導(dǎo)分化及生長(zhǎng)的重要因素[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，徐薯22 最適快繁植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合是A4 處理（0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA），而A5 處理（0.01 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA）是阜徐薯20 最適快繁植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，這與周志林等[23]對(duì)不同蔓長(zhǎng)特性甘薯品種的快繁最佳培養(yǎng)基為添加NAA/6BA 分別0.01～0.05 mg/L 和1.0 mg/L MS 培養(yǎng)基的研究結(jié)果相對(duì)一致。

由于組培苗組織分化不完善、光合自養(yǎng)能力弱、適應(yīng)性差、氣孔多且不易關(guān)閉、葉綠素少、根毛少，一般在高濕、弱光、恒溫下異養(yǎng)培養(yǎng)。而通過(guò)煉苗過(guò)程逐步改變其生長(zhǎng)條件逐步促使其組織發(fā)育完全，以適應(yīng)外界環(huán)境，提高對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[24]。不同培養(yǎng)時(shí)間，煉苗對(duì)快繁苗移栽成活率影響不同，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)經(jīng)過(guò)煉苗移栽成活率越高。但是本試驗(yàn)在培養(yǎng)20～40 d 的供試材料組培苗中，不煉苗的移栽成活率顯著高于煉苗，尤其在繼代培養(yǎng)30 d，不煉苗直接移栽成活率也可達(dá)75.00%～80.00%，所以實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)需求選擇是否煉苗確定移栽時(shí)間。

本試驗(yàn)中，二次莖尖分生組織培養(yǎng)可完全脫除由SPFMV 和SPCSV 協(xié)生共侵染引起的SPVD，不同病毒抑制劑結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)對(duì)不同品種甘薯的SPFMV 脫除效果有差異，脫毒組培苗快繁的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為0.01～0.05 mg/L NAA 和1.0 mg/L 6-BA，煉苗能顯著提高組培苗移栽成活率，但繼代培養(yǎng)30 d 不煉苗移栽可能是今后脫毒試管苗高效快速產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用需關(guān)注的一個(gè)方向。