吳大志，李曉玲，施恩，高雪，牟趙杰，倪倍倍

含大麻葉提取物的女士護(hù)理液的制備及功效研究

吳大志1，李曉玲2，施恩3，高雪3，牟趙杰1，倪倍倍4

（1. 大通漢麻生物科技研究院，山東 青島 266500； 2. 青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266071；3. 青島黃海學(xué)院，山東 青島 266555； 4. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 青島 266000）

目的：提供一種工業(yè)化制備含大麻葉提取物的女士護(hù)理液的方法。方法：工業(yè)大麻花葉預(yù)處理及干燥，乙醇提取后真空減壓濃縮、超低溫脫脂脫蠟、脫色后，分子蒸餾，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～35%的大麻二酚（cannabidiol，CBD）全譜油。通過(guò)工業(yè)制備高效液相色譜系統(tǒng)精準(zhǔn)分離，先用40%～60%的乙醇溶液平衡，再用50%～85%乙醇溶液洗脫5～10倍柱體積，然后再用50%～85%的乙醇溶液洗脫5～10倍柱體積洗脫目標(biāo)成分，收集富含目標(biāo)成分的洗脫液，得到CBD組分富集液；根據(jù)洗脫液中CBD圖譜，準(zhǔn)確把前雜、CBD組分富集液切到不同的儲(chǔ)罐，得到CBD組分富集液。真空減壓濃縮后，得到CBD質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～60%的精制CBD廣譜油。按原料配比稱重各項(xiàng)原料。將A相原料和B相原料按步驟分別投入攪拌鍋中，攪拌至透明溶液，檢測(cè)合格后出料，即得含大麻葉提取物的女士護(hù)理液。結(jié)果：該方法所制備的含大麻葉提取物的女士護(hù)理液有良好的抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用。結(jié)論：該方法可成功制備含大麻葉提取物的女士護(hù)理液，方法簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

大麻葉提取物； 大麻二酚； 女士護(hù)理液；

女性的外陰無(wú)任何保護(hù)且尿道、肛門位置挨近，容易被污染，并使外陰長(zhǎng)時(shí)間處于潮濕環(huán)境下，易于滋生細(xì)菌。女性的這種生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了有利的條件，此外女性每月的生理周期也會(huì)增加生殖器炎癥感染的可能性[1]。女性生殖器極易感染金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、新型念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和滴蟲等[2]。據(jù)了解80%的現(xiàn)代女性都深受婦科炎癥困擾[1]。若不能采取有效的預(yù)防和治療措施，不僅嚴(yán)重影響患者生活，還會(huì)給患者身心健康帶來(lái)巨大困擾[3]。加強(qiáng)自身衛(wèi)生管理，保持個(gè)人衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣是避免婦科炎癥發(fā)生的關(guān)鍵[4]。因此，日常的抑菌、洗護(hù)對(duì)婦科炎癥的預(yù)防尤為重要，成分天然、無(wú)刺激備的中草藥女士護(hù)理液已成為良好選擇。

大麻Cannabis sativa 為桑科Moraceae 植物，位列古代“五谷之首”，具有悠久的用藥歷史。大麻分為工業(yè)大麻和毒品大麻，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大麻為工業(yè)大麻[5]。區(qū)別工業(yè)大麻與毒品大麻的重要指標(biāo)是成癮成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）含量，THC<0.3 %的大麻植株屬于工業(yè)大麻，不具備毒品利用價(jià)值[6]。我國(guó)獲準(zhǔn)合法種植的工業(yè)大麻，均是低含毒量的品種。大麻的葉、花、莖中有數(shù)十種化合物。大麻及其有效成分具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血栓、抗炎、抗菌等多種藥理作用[7]。大麻中的非成癮成分大麻二酚（cannabidiol，CBD）引起廣泛的藥理活性成為新的研究熱點(diǎn)。CBD已被證明具有抗菌、抗炎、抗氧化活性并能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和免疫細(xì)胞功能，能夠抑制多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。目前CBD的利用價(jià)值還未充分開發(fā)。工業(yè)大麻的大麻葉提取物中的CBD含量很高，目前尚未出現(xiàn)將大麻葉提取物應(yīng)用于女性護(hù)理液的研究報(bào)道。本文介紹一種含大麻葉提取物的女士護(hù)理液的制備方法，以期為更好地利用大麻的藥用價(jià)值，助力工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

主要材料如下：甘油、羧甲基脫乙酰殼多糖、丁二醇、丙二醇、苯氧乙醇、1,2-己二醇、辛酰羥肟酸、糖類同分異構(gòu)體、椰油酰氨基丙酸鈉、椰油酰胺丙基甜菜堿水溶液所用原料、薄荷醇乳酸酯、薄荷氧基丙二醇均為醫(yī)用級(jí)或化學(xué)純級(jí)別。大麻為云南合法種植的工業(yè)大麻。主要儀器如下：高效液相色譜（LC-2030puls,日本島津）；粉碎機(jī)（FW135, 天津泰斯特）；鼓風(fēng)干燥箱（WGLL-45BE，天津泰斯特）；離心機(jī)（TDZ5，赫西）；萬(wàn)分之一天平（ATY224,日本島津）；冷藏冷凍冰箱（YCD-EL260，中科美凌冰箱）。

1.2 含大麻葉提取物的女士護(hù)理液的制備

1.2.1 大麻葉提取物的制備

大麻葉提取物來(lái)源于中國(guó)云南合法種植、加工提取的工業(yè)大麻（THC＜0.3%）。其CBD質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～60%，具體制備步驟為：

1)原料預(yù)處理：將晾干的工業(yè)大麻花葉經(jīng)振動(dòng)篩過(guò)篩，去除麻籽和麻稈、砂石雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎至10～30目（1 700～550 μm），得到工業(yè)大麻花葉初級(jí)原料；

2)原料干燥處理：將步驟(1)得到的初級(jí)原料，經(jīng)過(guò)熱風(fēng)帶式干燥設(shè)備進(jìn)行干燥0.5～3 h，得到水分小于7％的干燥工業(yè)大麻花葉原料；

3)乙醇提取：對(duì)于步驟(2)得到的干燥花葉原料，于多功能提取罐內(nèi)進(jìn)行乙醇溶劑提取，乙醇與花葉原料的質(zhì)量比為6∶1，得到一次提取液和殘?jiān)?；殘?jiān)凑?∶1進(jìn)行二次乙醇提取得到二次提取液和廢渣；殘?jiān)凑?∶1進(jìn)行第三次乙醇提取得到三次提取液和廢渣；三次提取液合并得到CBD萃取液；

4)濃縮：將步驟(3)得到的萃取液進(jìn)行真空減壓濃縮，得到濃縮液；

5)超低溫脫脂脫蠟：按照濃縮液與95%(體積分?jǐn)?shù))食品級(jí)乙醇比例1∶5(質(zhì)量比)混勻，超低溫冷凍脫脂脫蠟3～8 h，離心分離，過(guò)濾得到一級(jí)處理液；

6)脫色：將一級(jí)處理液通過(guò)活性炭和大分子樹脂聯(lián)合脫色30～60 min，脫色時(shí)載樣量為5%～10％，過(guò)濾分離，得到二級(jí)處理液；二級(jí)處理液濃縮得到中間品CBD濃縮粗油；

7)分子蒸餾：將步驟(6)得到的CBD濃縮粗油在90～170 ℃條件下進(jìn)行短程分子蒸餾，使粗油中的CBDA充分脫羧轉(zhuǎn)化為CBD，得到CBD質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～35%的CBD全譜油；

8)工業(yè)制備色譜分離純化：將步驟(7)的CBD全譜油輸送到樣品罐，用1∶1的無(wú)水乙醇調(diào)配，然后上高壓色譜層析柱，載樣量30～50 mg CBD·mL-1，解析洗脫液采用體積分?jǐn)?shù)為50%～85%的乙醇溶液，壓力為2～4 MPa；通過(guò)工業(yè)制備高效液相色譜系統(tǒng)精準(zhǔn)分離，先用40%～60％的乙醇溶液平衡，再用50%～85%乙醇溶液洗脫5～10倍柱體積，然后再用50%～85%的乙醇溶液洗脫5～10倍柱體積洗脫目標(biāo)成分，收集富含目標(biāo)成分的洗脫液，得到CBD組分富集液；根據(jù)洗脫液中CBD圖譜，準(zhǔn)確把前雜、CBD組分富集液切到不同的儲(chǔ)罐；

9)真空濃縮：將步驟(8)的CBD組分液真空減壓濃縮，得到CBD質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～60%的大麻葉提取物。

1.2.2 女士護(hù)理液的制備

女士護(hù)理液的配方如表1所示。其中，丁二醇和苦參提取物的混合水溶液是丁二醇：苦參提取物：水質(zhì)量比為2∶3∶5的混合水溶液；防腐劑為質(zhì)量比為21∶10∶5∶4的丙二醇、苯氧乙醇、1，2-己二醇和辛酰羥肟酸的混合物；芳香劑為質(zhì)量比為1∶1的薄荷醇乳酸酯和薄荷氧基丙二醇的混合物。

該護(hù)理液制備的主要步驟如下：

1)準(zhǔn)確稱取A相各原料，依次投入到清潔消毒好的攪拌鍋中，開啟攪拌，常溫?cái)嚢?～5 min；

2)將稱好的B相原料中的水投入攪拌鍋中，然后將B相原料的芳香劑、大麻葉提取物、香檸檬果油和薰衣草油依次分散溶解在PEG-40氫化蓖麻油中后加入攪拌鍋，攪拌均勻，靜置消泡，然后加入乳酸調(diào)節(jié)pH至6.3～6.5，最后加入銀，攪拌均勻，直至護(hù)理液為透明溶液，檢測(cè)合格后出料，即得含大麻葉提取物的女士護(hù)理液。

表1 女士護(hù)理液配方

2 結(jié)果

2.1 抑菌效果評(píng)價(jià)

抑菌效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)菌株選擇金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌(ATCC 25922)和白色念珠菌(ATCC 10231)。選用以上菌種代數(shù)為3～5代，并用含0.03 mol·L-1PBS配置菌懸液。參照2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行試驗(yàn)，用該護(hù)理液原液，作用時(shí)間2、5、10、20 min，試驗(yàn)試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)溫度22 ℃。結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，含大麻葉提取物的女士護(hù)理液能有效抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌。

表2 護(hù)理液不同作用時(shí)間的抑菌率

2.2 安全性檢驗(yàn)

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）對(duì)送檢樣品進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，主要檢測(cè)項(xiàng)目為微生物檢驗(yàn)和理化檢驗(yàn)，結(jié)果如表3和表4所示。

表3 護(hù)理液微生物檢驗(yàn)結(jié)果

表4 護(hù)理液理化檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，含大麻提取物的女士護(hù)理液的菌落總數(shù)、耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌總數(shù)項(xiàng)目符合規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)要求；汞、鉛、砷、二噁烷項(xiàng)目符合規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 討論

3.1 大麻葉提取物的抗炎作用

在配方中，大麻葉提取物為皮膚調(diào)理劑，即具有抗炎、抗菌作用，又能夠降低對(duì)陰道黏膜的刺激，在使用過(guò)程中起到保護(hù)女性陰道黏膜的作用。護(hù)理液中所含大麻葉提取物的CBD含量在30%～60％之間。CBD已被證明能夠調(diào)控炎癥因子水平、控制干擾素的產(chǎn)生起到代謝和免疫調(diào)節(jié)作用，還能抑制免疫細(xì)胞增殖、活化、成熟、遷移和抗原呈遞[9]。體外研究發(fā)現(xiàn)CBD能誘導(dǎo)靶基因HMOX1（Hemeoxygenase1）的表達(dá)，促進(jìn)抗炎和抗氧化作用[10]。大麻葉提取物除含CBD外，還富含其他大麻素、黃酮、萜烯類等，可能比CBD單獨(dú)使用發(fā)揮更強(qiáng)大的協(xié)同抗炎作用。楊來(lái)成等[11]使用3D表皮模型(Epikutis?)也證明了大麻葉提取物通過(guò)抑制炎性因子IL-1α、TNF-α及IL-8分泌，抑制皮膚炎癥反應(yīng)，從而在皮膚屏障損傷方面具有修復(fù)作用。

3.2 大麻葉提取物的抑菌作用

CBD及大麻葉提取物的抑菌作用備受關(guān)注。CBD對(duì)葡萄糖菌的抑制作用在20世紀(jì)70年代就被發(fā)現(xiàn)，尤其是對(duì)超級(jí)細(xì)菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐喹諾酮金黃色葡萄球菌具有抗菌活性[12]。雋惠玲等[13]采用乙醇做溶液對(duì)大麻葉和莖進(jìn)行提取并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有明顯的抑制作用。CBD具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的選擇性高于革蘭氏陰性桿菌[14]。Martinenghi等[15]證實(shí)CBD對(duì)MRSA USA300和S. aureus ( ATCC 25923 )具有很強(qiáng)的殺菌作用，殺菌作用迅速，其殺滅革蘭氏陽(yáng)性菌的機(jī)制可能與改變細(xì)菌滲透性有關(guān)。而殺滅革蘭氏陰性菌的機(jī)制可能與肽聚糖有關(guān)。哺乳動(dòng)物和人類試驗(yàn)顯示對(duì)上皮細(xì)胞溶血作用極小，即使口服量達(dá)到6 000 mg·d-1，依然未觀察到毒副作用，安全可靠[16]。

4 結(jié)束語(yǔ)

含大麻葉提取物的女士護(hù)理液具有良好的抗菌抗炎作用，安全可靠，具有良好應(yīng)用開發(fā)前景。同時(shí)本文還提供了一種制備含高純度CBD的大麻葉提取物方法，適用于大麻葉提取物的工業(yè)化生產(chǎn)，為我國(guó)大麻的藥用價(jià)值開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供思路。

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Preparation and Function Effect Ladies’ Nursing Solution Containing Hemp Leaf Extract

1,2,2,314

（1. Datong Hemp Biotechnology Research Institute Co., Ltd., Qingdao Shandong 266500, China;2. Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong 266011, China; 3.Qingdao Huanghai University, Qingdao Shandong 266427, China; 4. Department of Pharmacy, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong 266000, China）

To provide an industrialized clean method for preparing lip moisturizing gel containing hemp leaf extract, the industrial hemp leaves were pretreated and dried. After ethanol extraction, they were concentrated under vacuum pressure, dewaxed under ultra-low temperature, and decolorized. After molecular distillation, the cannabidiol (CBD) full spectrum oil with 25%～35% mass fraction was obtained. The industrial preparation of high performance liquid chromatography system was used for accurate separation. First 40% ～ 60% ethanol solution was used to balance, then 50% ～ 85% ethanol solution was used to elute 5 ～ 10 times column volume, and then 50% ～ 85% ethanol solution was used to elute 5 ～ 10 times column volume to elute target components. The eluent rich in target components was collected, and the CBD component enrichment solution was obtained. According to the CBD map of the eluent, the enrichment solutions of the fore miscellaneous and CBD components were accurately cut into different tanks. CBD enrichment solution was obtained. Refined CBD broad-spectrum oil with 40%～60% CBD mass fraction was obtained by vacuum distillation. All raw materials were weighed according to the ratio of raw materials. The A-phase raw materials and B-phase raw materials were put into the stirring pot step by step, and stirred to transparent solution. After qualified testing, the ladies’ nursing solution containing hemp leaf extract was obtained. The ladies’ nursing solution containing cannabis leaf extract prepared by this method has good antibacterial effect against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The method can be used to prepare ladies’ nursing solution containing hemp leaf extract successfully. The method is simple and suitable for large-scale industrial production.

Hemp leaf extract; Cannabidiol; Nursing solution

2021-09-22

吳大志（1982-），男，碩士，山東省青島市人，研究方向：從事新藥研發(fā)技術(shù)工作。

倪倍倍（1988-），女，主管藥師，碩士，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。

TQ91

A

1004-0935（2021）12-1799-04