王梓冰，甘春莉，浦益瓊, 2*，張 彤*

微孔濾膜對3種常用中藥指標成分HPLC測定結果的影響

王梓冰1，甘春莉1，浦益瓊1, 2*，張 彤1*

1. 上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 2012032. 上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心，上海 201203

研究采用不同尺寸和材質針式微孔濾膜處理中藥飲片，對其中指標性成分野黃芩苷、黃芩苷和甘草酸銨HPLC定量檢測結果的影響，以確定最適用的微孔濾膜類型。以中藥飲片半枝蓮、黃芩、甘草為研究對象，采用安譜、津騰、泰坦、島津等不同品牌尼龍、聚四氟乙烯（PTFE）等不同材質及0.45、0.22 μm等不同尺寸的有機相微孔濾膜濾過以及高速離心進行樣品前處理，對3種中藥成分（野黃芩苷、黃芩苷、甘草酸銨）分別按《中國藥典》2020年版方法進行HPLC定量測定；同時還測定了經上述不同方法處理的不同質量濃度水平（低、中、高）對照品溶液，得到的相應色譜峰的響應值。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進行統(tǒng)計分析，比較采用不同微孔濾膜的處理方式對各定量測定結果的影響。與經高速離心處理后的樣品測定結果相比，不同樣品前處理的對照品溶液峰面積均呈現(xiàn)不同程度的降低。微孔濾膜對3種指標成分均具有不同程度的吸附作用；采用PTFE濾膜處理后的含量結果、峰面積結果與高速離心法更接近，對定量測定結果影響更小，更適用于進樣前樣品（對照品、供試品）溶液的濾過處理。

微孔濾膜；黃芩苷；野黃芩苷；甘草酸銨；尼龍；聚四氟乙烯；HPLC；材質；中藥；半枝蓮；黃芩；甘草；主成分分析；高速離心

中藥成分的定量測定是中藥學研究中的重要組成部分，樣品溶液的前處理過程則是成分定量測定關鍵環(huán)節(jié)之一[1]。目前應用較廣泛的含量測定方法包括HPLC法、氣相色譜法、超臨界液相色譜法等，其中HPLC法的應用最為廣泛[2-3]。采用HPLC法測定中藥中的有效成分時，制備完成的樣品（對照品、供試品）溶液在注入液相色譜儀之前，一般均需采用微孔濾膜濾過或高速離心法去除溶液中的不溶性粒子，以免堵塞色譜系統(tǒng)，同時有效消除雜質干擾，獲得理想的色譜分離結果[4-5]。

本課題組前期實驗研究[6]發(fā)現(xiàn)，微孔濾膜處理飲片供試品溶液時對黃芩苷具有一定吸附性，而且不同材質的吸附性有所差異；同時，本項目組在依照《中國藥典》測定部分飲片品種（半枝蓮、黃芩、甘草）中的指標性成分野黃芩苷、黃芩苷或甘草酸銨的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，上述對照品溶液在經不同有機相針式濾器（微孔濾膜）濾過后，濾膜對這些成分亦會呈現(xiàn)不同程度的吸附，且與高速離心處理（不濾過）相比，所得的峰面積響應值有較大差異。

因此，為了考察不同（材質、尺寸）濾膜對上述成分在HPLC定量測定時的影響作用，本研究采用不同品牌（安譜、津騰、泰坦、島津）的不同材質［尼龍（Nylon）、聚四氟乙烯（PTFE）］、不同濾膜尺寸（0.45、0.22 μm）的有機相針式微孔濾膜以及高速離心（不濾過）法，處理含上述中藥指標成分（野黃芩苷、黃芩苷、甘草酸銨）的對照品溶液及對應中藥飲片（半枝蓮、黃芩、甘草）的供試品溶液進行相應處理，并將處理后的樣品（供試品、對照品）溶液進行HPLC定量測定，評價這些影響因素對定量結果（以高速離心處理樣品所得結果為參比值）的影響。本研究旨在探究不同類型（尺寸或材質）有機相針式微孔濾膜對中藥有效成分的影響作用，為相關中藥飲片樣品的前處理操作規(guī)范提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 Series高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；XS105DU型電子天平（十萬分之一）、XS104型電子天平（萬分之一），瑞士梅特勒-托利多公司；Multifuge X1R型離心機，美國Thermo Scientific公司；超聲波清洗機，上海科導超聲儀器有限公司。

1.2 飲片

黃芩（H1～H3，批號分別為190215、2006059、191101266）購于四川新荷花中藥飲片有限公司，甘草（G1～G3，批號分別為181221、2005072、191101056）購于上海虹橋中藥飲片有限公司，半枝蓮（B1～B3，批號分別為170909、160728、171211）購于上海虹橋中藥飲片有限公司。上述飲片均經上海中醫(yī)藥大學中藥學院張紅梅博士鑒定，黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根，半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮D. Don的干燥全草；甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。

1.3 試劑與藥物

對照品黃芩苷（批號110715-201821，質量分數(shù)95.4%）、野黃芩苷（批號110842-201709，質量分數(shù)91.7%）、甘草酸銨（批號110731-202021，質量分數(shù)96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院。微孔濾膜信息見表1。甲醇、乙腈為色譜純，美國Honeywell公司；無水乙醇、磷酸、醋酸均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

迪馬-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。野黃芩苷：以甲醇-水-醋酸（35∶61∶4）為流動相；體積流量為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為335 nm。黃芩苷：以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動相；體積流量為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為280 nm。甘草酸銨：以乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～8 min，19%乙腈；8～35 min，19%～50%乙腈；35～36 min，50%～100%乙腈；36～40 min，100%～19%乙腈；40～45 min，19%乙腈；體積流量為1 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，檢測波長為237 nm。

表1 微孔濾膜信息

Table 1 Information on usedmillipore filters

編號尺寸/μm材質生產商 ①0.22、0.45尼龍、PTFE上海安譜實驗科技股份有限公司 ②0.22、0.45尼龍、PTFE天津津騰實驗設備有限公司 ③0.22、0.45尼龍、PTFE上海泰坦科技股份有限公司 ④0.22、0.45尼龍、PTFE日本島津公司

2.2 半枝蓮、黃芩和甘草飲片中相關成分含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 參照《中國藥典》2020年版[7]一部“半枝蓮”“黃芩”“甘草”含量測定項下規(guī)定，分別取野黃芩苷、黃芩苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成80.1 μg/mL的野黃芩苷對照品溶液、60.4 μg/mL的黃芩苷對照品溶液；加70%乙醇制成204.6 μg/mL的甘草酸銨對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取半枝蓮飲片（B1～B3）參照《中國藥典》2020年版一部“半枝蓮”含量測定項下規(guī)定處理，即得半枝蓮供試品溶液。取3批黃芩飲片（H1～H3），參照《中國藥典》2020年版一部“黃芩”含量測定項下規(guī)定處理，即得黃芩供試品溶液。取3批甘草飲片（G1～G3），參照《中國藥典》2020年版一部“甘草”含量測定項下規(guī)定處理，即得甘草供試品溶液。

2.2.3 樣品處理及測定 將制備后的各對照品溶液和各供試品溶液，分別采用不同品牌的不同尺寸（0.22、0. 45 μm）和不同材質（尼龍、PTFE）微孔濾膜進行濾過處理；同時采用高速離心處理（10 000 r/min，離心半徑5 cm，10 min）作為對照；分別注入高效液相色譜儀中進行測定，并計算各批中藥飲片中相關成分含量。

2.3 微孔濾膜對不同質量濃度對照品溶液的影響

取野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成不同質量濃度水平的對照品溶液，質量濃度分別約為0.005 mg/mL（低）、0.050 mg/mL（中）和0.500 mg/mL（高）；取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成不同質量濃度水平的對照品溶液，質量濃度分別約為0.005 mg/mL（低）、0.050 mg/mL（中）和0.500 mg/mL（高）；取甘草酸銨對照品適量，加70%乙醇制成不同質量濃度水平的對照品溶液，質量濃度分別約為0.01 mg/mL（低）、0.20 mg/mL（中）和0.40 mg/mL（高）。將上述對照品溶液分別采用不同品牌的不同尺寸（0.22、0.45 μm）和不同材質（尼龍、PTFE）的4種微孔濾膜進行濾過處理；同時采用高速離心處理（10 000 r/min，離心半徑5 cm，10 min）作為對照處理，分別注入高效液相色譜儀中定量測定。

2.4 統(tǒng)計分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是最常用的多指標線性降維壓縮和多變量分析方法，具有可信度高、靈活性強，側重于綜合評價信息的貢獻影響力的特點[8-10]。本研究的PCA利用SIMCA 14.1軟件（Umetrics，瑞典）完成。分別對采用不同微孔濾膜濾過的處理方式與高速離心法（無濾過處理，作為參照處理法）得到的飲片含量、對照品溶液的峰面積響應值依次進行PCA，提取出特征值大于1的主成分，累積貢獻率均大于85%，可以解釋原始數(shù)據的大部分信息。

3 結果

3.1 飲片中相關成分含量測定結果及分析

采用不同處理方式的3種飲片的不同批次樣品（半枝蓮飲片B1～B3；黃芩飲片H1～H3；甘草飲片G1～G3）含量測定結果的PCA結果，見圖1～3。經不同處理方式的3種指標成分（野黃芩苷、黃芩苷、甘草酸銨）含量測定結果的PCA得分圖，見圖1～3。

結果顯示，采用0.22 μm PTFE微孔濾膜、0.45 μm PTFE微孔濾膜與高速離心處理的結果接近，提示這3個處理方式之間差異較小，即采用PTFE濾膜濾過與高速離心處理的飲片含量結果接近；采用0.22 μm尼龍微孔濾膜、0.45 μm尼龍微孔濾膜與高速離心處理的結果有差異，提示這3個處理方式之間差異較大，即采用尼龍濾膜濾過與高速離心處理的飲片含量結果有差異。將經不同處理方式的3種指標成分含量測定結果的PCA結果（圖1～3）匯總分析，結果顯示不同批次（各3批）的3種飲片含量測定結果，均呈現(xiàn)上述情況。

3.2 相關對照品含量測定結果及分析

采用不同處理方式的3種不同質量濃度對照品溶液（野黃芩苷0.005、0.050、0.500 mg/mL；黃芩苷0.005、0.050、0.500 mg/mL；甘草酸銨0.01、0.20、0.40 mg/mL）峰面積響應值的PCA得分圖見圖4～6。結果顯示，采用0.22 μm PTFE微孔濾膜、0.45 μm PTFE微孔濾膜與高速離心處理的結果接近，提示這3個處理方式之間差異較小，即采用PTFE濾膜濾過與高速離心處理的對照品溶液的響應值接近；采用0.22 μm尼龍微孔濾膜、0.45 μm尼龍微孔濾膜與高速離心處理的結果差異偏大，提示這3個處理方式之間存在較大差異，即采用尼龍濾膜過濾與高速離心處理的對照品溶液的響應值有差異。

●0.22 μm尼龍微孔濾膜 ▲0.22 μm PTFE微孔濾膜 ◆0.45 μm尼龍微孔濾膜 ★0.45 μm PTFE微孔濾膜 ■高速離心，下圖同

圖2 經不同處理方式的黃芩苷含量測定結果的PCA得分圖

圖3 經不同處理方式的甘草酸銨含量測定結果的PCA得分圖

將經不同處理方式的3種指標成分對照品峰面積值的PCA結果（圖4～6）匯總分析，結果顯示不同質量濃度水平（低、中、高）的3種對照品的峰面積測定結果，均呈現(xiàn)上述情況。

圖4 經不同處理方式的野黃芩苷對照品峰面積值的PCA得分圖

圖5 經不同處理方式的黃芩苷對照品峰面積值的PCA得分圖

圖6 經不同處理方式的甘草酸銨對照品峰面積值的PCA得分圖

綜上所述，采用PTFE濾膜處理的供試品溶液、對照品溶液較高速離心處理的結果而言，均相對更接近，提示該材質的微孔濾膜更適用于HPLC檢測前的樣品溶液的濾過操作。

4 討論

4.1 微孔濾膜對不同質量濃度對照品峰面積值的影響

本研究在現(xiàn)行《中國藥典》相關飲片項下“含量測定”方法的基礎上，分別考察了不同濾膜對定量測定結果的影響。結果顯示，將《中國藥典》2020年版一部中藥飲片含量測定項下規(guī)定的對照品質量濃度：半枝蓮中的野黃芩苷為80 μg/mL、黃芩中的黃芩苷為60 μg/mL、甘草中的甘草酸銨為0.2 mg/mL，采用不同濾膜處理后的峰面積結果有較大差異，因而計算得到的各個批次的飲片含量也均有較大不同。

基于上述研究結果，本研究還考察了3種成分對照品溶液的不同質量濃度與吸附作用之間的相關性。在《中國藥典》2020年版一部中，含量測定項下涉及到黃芩苷的藥材1種、提取物1種、復方制劑161種；涉及到野黃芩苷的藥材2種、提取物1種、復方制劑7種；涉及到甘草酸銨的藥材2種、提取物2種、復方制劑47種，分別參考藥典對上述品種的對照品溶液制備中的規(guī)定質量濃度范圍，本研究分別設置了“低、中、高”3個質量濃度：野黃芩苷0.005 mg/mL（低）、0.050 mg/mL（中）和0.500 mg/mL（高）；黃芩苷0.005 mg/mL（低）、0.050 mg/mL（中）和0.500 mg/mL（高）；甘草酸銨：0.01 mg/mL（低）、0.20 mg/mL（中）和0.40 mg/mL（高），作為質量濃度研究的基準，分別考察對照品溶液質量濃度對吸附作用的影響。

4.2 微孔濾膜對飲片含量測定結果的影響

與高速離心處理結果相比，不同材質的微孔濾膜對不同質量濃度水平的野黃芩苷、黃芩苷對照品溶液均有不同程度的吸附，特別是對0.005 mg/mL的低質量濃度吸附更為嚴重。而《中國藥典》2020年版一部半枝蓮飲片含量測定項下的“80 μg/mL”的對照品質量濃度較低，也存在相應吸附，由此計算得到的半枝蓮飲片中的野黃芩苷在0.53%～1.15%（B1）、0.53%～1.08%（B2）、0.94%～1.74%（B3）；黃芩飲片含量測定項下的“60 μg/mL”的對照品質量濃度較低，也存在相應吸附，由此計算得到的黃芩飲片中的黃芩苷在12.09%～19.25%（H1）、13.54%～22.12%（H2）、14.09%～21.82%（H3），同一批的飲片含量就存在較大差異，因此用藥典規(guī)定的由“較低質量濃度對照品溶液”計算藥材含量時，對飲片含量結果影響較大。

不同材質的微孔濾膜對不同質量濃度水平的甘草酸銨對照品溶液均有不同程度的較輕吸附。而《中國藥典》2020年版一部甘草飲片含量測定項下規(guī)定的是“0.2 mg/mL”的對照品質量濃度，由此計算得到的甘草飲片中的甘草酸在4.31%～4.88%（G1）、2.41%～2.61%（G2）、3.74%～4.01%（G3），同一批的飲片含量結果相近，但仍存在差異，因此用藥典規(guī)定的由“較高質量濃度對照品溶液”計算藥材含量時，對飲片含量影響較小。

經本研究的實驗研究和數(shù)據統(tǒng)計分析顯示，采用PTFE濾膜處理的供試品含量測定結果、對照品峰面積響應值均與高速離心處理的結果更接近，提示更適用于HPLC前處理的濾過處理環(huán)節(jié)。

在《中國藥典》2020年版中有關中藥飲片、復方制劑等的供試品溶液的制備的描述中均未涉及到具體的處理方式或濾膜性質，而在《香港中藥材標準》[11]中半枝蓮、黃芩、甘草、香附、當歸、人參等中藥飲片中供試品溶液的制備項下要求，明確寫到“0.45 μm微孔濾膜（PTFE）或0.45 μm微孔濾膜（nylon，尼龍）或0.2 μm微孔濾膜（PTFE）”。本研究結果提示，如能明確部分品種的濾膜材質或尺寸，可更加完善《中國藥典》相關品種的定量檢測方法。

4.3 微孔濾膜材料性質的特征分析

尼龍化學名為聚酰胺（PA）[12-14]，是分子主鏈上含有重復酰胺基團（-NHCO-）的雜鏈聚合物。由于分子中含有強極性的酰胺基團，具有較好的耐熱性、耐油性和耐有機溶劑性既可以作為氫鍵給體，也可以作為氫鍵受體，因此可以和含F(xiàn)、O和N的物質形成氫鍵，這類膜親水性好，較耐堿而不耐酸。

PTFE可以認為是聚乙烯（PE）分子中的氫原子全被氟原子取代所得的，呈長鏈狀，無支鏈[15-16]。另外，由于氟原子緊緊地排列在碳鏈周圍，且原子半徑較大會把主鏈遮擋起來，碳鏈較難被破壞，C-F鍵的強鍵能使其具備優(yōu)異的化學穩(wěn)定性、耐腐蝕性、高機械強度[17]。對大多數(shù)化學藥品和溶劑表現(xiàn)出惰性，能耐強酸強堿、水和各種有機溶劑，但由于PTFE分子中所含的C-F鍵能高、結構高度對稱，導致其材料具有較強的疏水性（約136°）和較低的表面能（約21.4 mN/m），從而限制了其在膜分離技術中的應用[18]。因此，近年來為了提高PTFE的表面能及其親水性，使其更好地發(fā)揮膜分離技術，對疏水的PTFE微孔膜進行了親水改性，如濕化學法、等離子體處理輻照、原子層沉積和高溫熔化等，以提高膜的親水性、防污性以及附加性能的功能化。改性技術的選擇取決于膜應用的要求[19-20]。在本研究中使用的PTFE微孔濾膜為親水性PTFE（依據生產產品說明上的標注“親水性PTFE”），既能夠發(fā)揮優(yōu)異的化學穩(wěn)定性、耐腐蝕性，又能對有效成分較少的吸附，更好地發(fā)揮膜分離技術。

本項目研究過程中，由于在規(guī)定了濾膜尺寸和濾膜材質后，不同品牌的濾膜具有一定的同質性，故在統(tǒng)計過程中忽略品牌的差異，以不同品牌的規(guī)定濾膜作為平行樣品處理。本研究中采用不同尺寸的“尼龍”“PTFE”材質的微孔濾膜進行考察，涉及的3種指標成分（野黃芩苷、黃芩苷和甘草酸銨）均含有吡喃葡萄糖基團，為半縮醛結構，含有酚羥基，顯示出弱酸性或酸性。當微孔濾膜材質為尼龍，會與其中的酰胺基團發(fā)生反應，產生較強的吸附作用，且由于對照品溶液與供試品溶液的吸附程度不同，對照品溶液的質量濃度越低吸附作用越強、濾膜尺寸越小吸附越嚴重。經相同材質的0.22 μm濾膜較0.45 μm濾膜的峰面積較小，提示吸附量較大。因此，采用微孔濾膜處理與高速離心處理的峰面積會有較大差異，從而導致藥材含量結果有差異。當微孔濾膜材質為PTFE，較高速離心處理的峰面積值接近，提示吸附量較小。因此，無論何種尺寸的PTFE微孔濾膜，均較適用于上述3種指標成分的濾過操作。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Influences of millipore filters on the determinations of three traditional Chinese medicine indicative components detected by HPLC

WANG Zi-bing1, GAN Chun-li1, PU Yi-qiong1, 2, ZHANG Tong1

1. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China2. Experiment Center for Teaching and Learning, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

To study the influence of millipore filters of different sizes and materials on the determination results of scutellarin, baicalin and ammonium glycyrrhizinate detected by HPLC, and to determine the most appropriate millipore filters applied in the filtration before injected into HPLC analyzers.Three kinds of traditional Chinese medicine (TCM) decoction pieces [Banzhilian (, SBH), Huangqin (, SR), Gancao (et, GRR)] were used as the investigated subjects. The millipore filters with different brands (Anpel, Jinteng, Titan, Shimadzu), with different materials (Nylon, PTFE) and different micropore sizes (0.45, 0.22 μm) were used to filter the sample solutions, with the high-speed centrifugation as the reference treatment, the contents of the indicative components (scutellarin, baicalin, ammonium glycyrrhizinate) in the corresponding decoction pieces (SBH, SR, GRR) were detected according to the respective content-determination methods listed in(2020 edition), respectively. Additionally, the response values of the corresponding peaks of the reference solutions with different concentration levels (low, medium, high) were obtained, which were treated with the above-mentioned different methods, respectively. Principal component analysis (PCA) was used for statistical analysis, and the influences of different millipore filters on the quantitative determination results were compared.Compared with the determination results of the samples treated by high-speed centrifugation, the peak areas of the reference solutions responded in HPLC, showed different degrees of reduction, which led to the simultaneous increase of the corresponding determination results of the decoction pieces.All the above microporous filters have different degrees of adsorption on the three index components. The results of content and peak area after the treatment with PTFE filters (0.22 μm or 0.45 μm), are closer to those treated by high-speed centrifugation, which indicate less influence of the filters on the quantitative determination results. PTFE millipore filters are more suitable for pre-treatment of the reference/test sample solutions in the HPLC determinations of the contents of scutellarin, baicalin or ammonium glycyrrhizinate.

millipore filter; baicalin; scutellarin; ammonium glycyrrhizinate; nylon; PTFE; HPLC; material; traditional Chinese medicine;;;et; principal component analysis; high-speed centrifugation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)01 - 0071 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.010

2021-08-12

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2019ZX09201004-002）；國家自然科學基金青年科學基金項目（82003962）；上海市科委“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥領域科技支撐項目（1841931400）

王梓冰（1997—），碩士研究生，主要從事中藥復方新藥研究。Tel: 18800318897 E-mail: 1343970767@qq.com

浦益瓊，副教授，主要研究方向為中藥新藥與新劑型的研究。Tel: (021)51323068 E-mail: puyiq@163.com

張 彤，教授，博士生導師，主要研究方向為中藥新藥研究。Tel: (021)51322318 E-mail: zhangtdmj@hotmail.com

[責任編輯 鄭禮勝]