何 棣，王 昊，梅文莉，袁靖喆，楊 理，魏艷梅，宋希強，戴好富*

紅土沉香中5,6,7,8-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮類化合物的研究

何 棣1, 2，王 昊2，梅文莉2，袁靖喆2，楊 理2，魏艷梅2，宋希強1，戴好富2*

1. 海南大學(xué)林學(xué)院，海南 ?？?570228 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所 海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南 海口 571101

研究紅土沉香中的化學(xué)成分。采用硅膠、凝膠、高效液相色譜等多種色譜技術(shù)分離純化得到單體化合物，通過質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代波譜學(xué)方法鑒定其結(jié)構(gòu)。從紅土沉香乙醇提取物得到11個化合物，分別是(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（1）、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（2）、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(3-羥基-4-甲氧基)苯乙基] 色酮（3）、沉香四醇（4）、異沉香四醇（5）、5α,6β,7α,8β-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮（6）、5α,6β,7α,8β-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（7）、aquilarone D（8）、aquilarone C（9）、aquilarone A（10）、aquilarone B（11）。化合物1為新化合物，以上5,6,7,8-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮類化合物（1～11）均首次從紅土沉香分離得到。抗炎活性測試結(jié)果表明化合物均無抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生一氧化氮的活性。

紅土沉香；柯拉斯那沉香；5,6,7,8-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮；抗炎活性；(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮；沉香四醇

沉香為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬Lam. 或擬沉香屬Gaertn.植物含有樹脂的木材，是天然香料和名貴的傳統(tǒng)藥材，在醫(yī)藥、香文化、日化等方面廣泛使用。健康的沉香樹不會產(chǎn)生沉香，只有受到外界傷害，才會在傷口處分泌出樹脂形成沉香。目前，已從沉香中分離鑒定400余個化合物，主要為倍半萜和2-(2-苯乙基) 色酮兩類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，沉香中的化學(xué)成分具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、降血糖、抗腫瘤、抗菌和抗炎等作用[2-3]。本研究組前期對白木香(Lour.) Spreng.、絲沉香(Oken) Merr.、柳葉擬沉香Ridl. 以及柯拉斯那沉香Pierre ex Lecomte的化學(xué)成分進行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的倍半萜和2-(2-苯乙基) 色酮類化合物[4-6]。

紅土沉香主要產(chǎn)自越南，為柯拉斯那沉香倒地后被埋于紅土中緩慢形成，表面紅褐色或土黃色，色澤暗淡，木心紫褐色，油脂分布明顯，質(zhì)地硬，較難切割。紅土沉香結(jié)香方式特殊，不同于普通柯拉斯那沉香，其珍貴稀有，素有“千年沉香，萬年紅土”之說，價格可與高品質(zhì)沉香奇楠相媲美[7]。目前，尚未見關(guān)于紅土沉香的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。本課題組對紅土沉香的乙醇提取物進行了系統(tǒng)的研究，首次分離鑒定了11個5,6,7,8-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮類化合物（圖1），分別為(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮[(5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone，1]、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮 [(5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl) ethyl]- 5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone，2]、(5,6,7,8)-5,6,7,8-四羥基-2-[2-(3-羥基-4-甲氧基)苯乙基] 色酮 [(5,6,7,8)-2-[2-(3-hydroxy- 4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8- tetrahydrochromone，3]、沉香四醇（agarotetrol，4）、異沉香四醇（isoagarotetrol，5）、5α,6β,7α,8β-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮（5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2- [2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone，6）、5α,6β,7α,8β-四羥基-2-[2-(4-甲氧基)苯乙基] 色酮（5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl) ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone，7）、aquilarone D（8）、aquilarone C（9）、aquilarone A（10）、aquilarone B（11）。其中，化合物1為新化合物。本研究為紅土沉香的標準制定和開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

圖1 化合物1～11的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

安捷倫1260分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；安捷倫1260半制備型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁儀（德國Bruker公司）；質(zhì)譜儀（Bruker amazon SL公司）；紫外光譜儀（UV-2550 Shimadzu）；紅外光譜儀（Nicolet 380美國Thermo公司）；旋光儀MCP 5100（奧地利Anton Paar有限公司）；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；BSA-100A自動部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph Laborota公司）；METTLER TOLEDO ME204精密和分析天平［萬分之一，梅特勒-托力多儀器（上海）公司］；超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ELX-800酶標儀（美國寶特公司）；色譜硅膠板G，柱色譜硅膠G、H（200～300、60～80目，青島海洋化工廠）；ODS（20～45 μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司）；Sephadex LH-20（德國Merck公司）。小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）購買于中國科學(xué)院干細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（賽默飛世爾科技公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Griess試劑、槲皮素、四甲基偶氮唑藍（美國Sigma公司）。

紅土沉香樣品于2017年購于廣西憑祥，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定其基原植物為柯拉斯那Pierre ex Lecomte，標本（YNHT201711）樣本保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取與分離

紅土沉香樣品（1.6 kg）粉碎后超聲提取6次（每次加入95%乙醇5.0 L，超聲45 min），減壓濃縮得到浸膏（330.6 g）。隨后將浸膏分散至水中，依次用石油醚（5 L×3）、醋酸乙酯（5 L×3）和正丁醇（5 L×3）萃取。濃縮后將醋酸乙酯相浸膏（131.0 g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜進行分離，以氯仿-甲醇系統(tǒng)（1∶0～0∶1）梯度洗脫，濃縮后經(jīng)TLC薄層色譜檢測，合并得26個流分（Fr. 1～26）。Fr. 25（12.0 g）經(jīng)ODS柱色譜，以甲醇-水（3∶10～1∶0）為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)HPLC分析后，合并得到8個流份（Fr. 25-1～25-8）。Fr. 25-4（471.8 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）洗脫，得到Fr. 25-4-1～25-4-2。Fr. 25-4-2（124.9 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜（C18柱，乙腈-水（15∶85），等度洗脫；體積流量4 mL/min；檢測波長254、210 nm）分離純化得到化合物1（2.0 mg，R＝26.5 min）、2（13.0 mg，R＝23.5 min）、3（1.0 mg，R＝8.5 min）、4（5.0 mg，R＝21.5 min）、5（1.0 mg，R＝28.5 min）、6（1.4 mg，R＝17.0 min）、7（1.9 mg，R＝32.0 min）、8（2.2 mg，R＝10.5 min）、9（4.3 mg，R＝36.0 min）、10（3.0 mg，R＝11.5 min）、11（2.1 mg，R＝34.0 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)(500/125 MHz, CD3OD)

Table 1 1H- and 13C-NMR spectral data of compound 1 (500/125 MHz, CD3OD)

碳位δCδH 2171.4, C 3114.2, CH6.10 (s) 4180.7, C 564.2, CH4.83 (d, J = 3.9 Hz) 671.8, CH3.46 (dd, J = 10.5, 3.9 Hz) 773.2, CH3.95 (dd, J = 10.5, 7.7 Hz) 873.0, CH4.35 (d, J = 7.7 Hz) 9165.1, C 10121.7, C 1′133.1, C 2′130.4, CH7.12 (d, J = 8.6 Hz) 3′115.0, CH6.81 (d, J = 8.6 Hz) 4′160.0, C 5′115.0, CH6.81 (d, J = 8.6 Hz) 6′130.4, CH7.12 (d, J = 8.6 Hz) 7′36.5, CH22.89 (m) 8′32.8, CH22.95 (m) 4′-OCH355.6, CH33.74 (s)

圖2 化合物1的關(guān)鍵2D NMR相關(guān)信號

圖3 化合物1的計算ECD圖譜與實測ECD圖譜對比

4 抗炎活性測試

采用LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7模型測試化合物的抗炎活性[18-21]。RAW264.7細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞按1×105個/mL接種于96孔板中，分別設(shè)對照組（不加LPS）、LPS誘導(dǎo)組、陽性藥槲皮素（3 mmol/L）組和受試藥物高、中、低劑量（50、25、12.5 mg/L）組，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中貼壁24 h后，取100 μL于新的96孔板中，之后向每孔加入100 μL（40 mg/mL）Griess試劑，混勻后于酶標儀540 nm波長下測定各孔的吸光度（）。按公式計算NO抑制率。最后利用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)，求得化合物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7產(chǎn)生NO的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。

抑制率＝(2－1)/(2－0)

0、1、2分別為540 nm下測得的對照組、藥物組、LPS誘導(dǎo)組的值

實驗結(jié)果顯示，化合物1～11均無抑制LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的活性。

5 討論

目前已從普通柯拉斯那沉香中發(fā)現(xiàn)了9個倍半萜類化合物[22-24]，30個2-(2-苯乙基) 色酮類化合物[24-31]，3個2-(2-苯乙烯基) 色酮[28]，18個2-(2-苯乙基) 色酮二聚體[27,32-35]，9個2-(2-苯乙基) 色酮與倍半萜二聚體[35-36]，僅分離得到4個5,6,7,8-四羥基- 2-(2-苯乙基) 色酮[26,30]以及5個環(huán)氧5,6,7,8-四氫- 2-(2-苯乙基) 色酮[27,30,37]。本實驗從紅土沉香中分離鑒定出11個5,6,7,8-四羥基-2-(2-苯乙基) 色酮類化合物，并且均是首次從柯拉斯那沉香中分離得到，其中化合物1為新化合物。紅土沉香中的化合物類型不同于普通柯拉斯那沉香，原因可能是結(jié)香方式不同影響了所產(chǎn)沉香的化學(xué)成分，需要進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on 5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone derivatives of red soil agarwoodfrom Vietnam

HE Di1, 2, WANG Hao2, MEI Wen-li2, YUAN Jing-zhe2, YANG Li2, WEI Yan-mei2, SONG Xi-qiang1, DAI Hao-fu2

1. College of Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China 2. Hainan Key Laboratory of Research and Development of Natural Product from Li Folk Medicine, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China

To investigate the chemical constituents from red soil agarwood () from Vietnam.All compounds were purified by using various chromatographic techniques, including silica gel, Sephadex LH-20, high performance liquid chromatography (HPLC) and so on. Their structures were elucidated based on modern spectroscopic methods, such as mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).Eleven tetrahydro-2-(2-phenylethyl) chromones were isolated from ethanol extract of red soil agarwood from Vietnam and identified as (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]- 5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone (1), (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8- tetrahydrochromone (2), (5,6,7,8)-2-[2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone (3), agarotetrol (4), isoagarotetrol (5), 5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(2-hydroxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone (6), 5α,6β,7α,8β-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone (7), aquilarone D (8), aquilarone C (9), aquilarone A (10), and aquilarone B (11).Compound 1 is a new compound. All compounds were isolated from red soil agarwood for the first time. The results of anti-inflammatory activity assay showed that these compounds did not inhibit the NO production in mouse mononuclear macrophages RAW264.7 induced by LPS.

red soil agarwood;Pierre ex Lecomte;5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone; anti-inflammatory activity; (5,6,7,8)-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone; agarotetrol

R284.1

A

0253 - 2670(2022)01 - 0018 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.01.004

2021-04-29

海南省重點研發(fā)計劃項目（ZDYF2020160）；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項（1630052021014，1630052017003）

何 棣（1996—），男，在讀碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail: hedinpc@126.com

戴好富（1974—），男，博士，研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail: daihaofu@itbb.org.cn

[責任編輯 王文倩]