楊 虎 ，徐興莉 ，饒榮海

（1.宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西 宜春 336000；2.宜黃縣桃陂鎮(zhèn)獸醫(yī)站，江西 撫州 344400）

JAZF1（Ju xtaposed with another zinc finger gene1）基因又名Tip27，ZNF802，最早由全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)的與人Ⅱ型糖尿病相關的基因，JAZF1基因對動物糖和脂肪代謝有重要調控作用。盧春敏等將JAZF1基因轉染到小鼠肝細胞，發(fā)現(xiàn)JAZF1基因過表達可以使SREBP1基因表達下調，而SREBP1基因表達產(chǎn)物是脂肪代謝調控的重要轉錄因子，這些轉錄因子的調控直接影響脂肪的合成。通過對小鼠研究發(fā)現(xiàn)，JAZF1基因過表達能夠顯著抑制肝臟的糖異生作用。這些研究表明JAZF1是體內(nèi)脂代謝和糖代謝的重要調控因子。JAZF1基因在動物體內(nèi)對脂肪代謝分子調控機制還不清楚，而脂肪含量特別是肌內(nèi)脂肪和肌間脂肪含量是評價動物肉質的重要指標。文章以肌內(nèi)脂肪含量適中的贛西兩頭烏豬為研究對象，克隆JAZF1基因的cDNA全長，并對該序列的組成、編碼蛋白質的特點進行了生物信息學分析，為探索JAZF1基因調控脂肪代謝機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

組織樣品取自贛西兩頭烏豬的背最長肌，且保存于-80 ℃，5'RACE和3'RACE克隆試劑盒分別購自Invitrogen公司和 Clontech 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA 合成

用反轉錄酶和特異性引物先合成cDNA第1鏈，然 后 用RNase Mix 對cDNA處理，最后再純化cDNA。

1.2.2 PCR擴增

根據(jù)GenBank提供的人JAZF1基因（登錄號：NM_175061）序列設計PCR引物（表1）擴增并克隆測序，即可獲得JAZF1基因部分CDS（coding domain sequence）序列。

表1 引物序列

1.2.3 RACE擴增

1）5'RACE擴增。首先對純化后的cDNA末端加上多聚C，再用試劑盒特異性引物對已經(jīng)加尾的cDNA進行第一輪擴增；再用特異性引進行第二輪擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物進行并回收，最后將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接，并進行測序，得到長度為684 bp的目的序列。2）3'RACE擴增。 使用試劑盒特異引物及合成的cDNA進PCR擴增，電泳檢測并回收，純化后的PCR產(chǎn)物與載體連接并克隆測序，最終得到420 bp的序列。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 JAZF1基因的序列分析

根據(jù)克隆測序結果，利用軟件DNAstar7.1 預測JAZF1基因的ORF（Open Reading Frame）并預測氨基酸序列。

1.3.2 豬JAZF1基因的蛋白結構與功能預測

分別預測JAZF1氨基酸的磷酸化位點（ http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、潛在的糖基化位點（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）及JAZF1蛋白的親水性（http://web.expasy.org/protscale/），利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析氨基酸序列的結構域。

2 結果與分析

本實驗成功克隆了兩頭烏豬JAZF1基因部分CDS序列，利用RACE技術成功獲得了該基因的5'末端序列和3'末端序列。電泳檢測5'RACE和3'RACE的兩個產(chǎn)物片段，結果如圖1所示，兩頭烏豬部分CDS序列產(chǎn)物長為 620 bp（圖1A），5'RACE 產(chǎn)物長 684 bp（圖1B），3'RACE 產(chǎn)物長420 bp（圖1C）， 回收條帶并克隆測序。 最后得到了JAZF1基因的cDNA全長序列，共1 098 bp，包括ORF 732 bp，編碼243個氨基酸，氨基酸序列見圖2（DNASTAR）。

圖1 豬JAZF1基因 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 豬JAZF1核苷酸序列及其推導的氨基酸序列圖

2.1 豬JAZF1蛋白結構分析

2.1.1 蛋白理化性質分析

豬JAZF1蛋白分子量為27 079.4 Da，等電點為8.63；JAZF1蛋白的氨基酸中，絲氨酸（Ser）含量為11.9%，所占比例最高，含量最低為蛋氨酸（Met），比例為2.1%。

2.1.2 JAZF1蛋白跨膜螺旋結構

TMPRED分析蛋白跨膜結構，顯示豬JAZF1蛋白有1個跨膜結構，且由內(nèi)向外，跨膜區(qū)的氨基酸殘基位置在8-25處,見圖3。

圖3 TMPRED軟件預測JAZF1蛋白跨膜結構

2.1.3 JAZF1潛在磷酸化位點和糖基化位點分析

在線分析JAZF1蛋白的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)2個蘇氨酸（Thr）、3個酪氨酸（Tyr）及18個絲氨酸（Ser）屬于蛋白激酶磷酸化位點（圖4）； 糖基化位點有19個（圖5）。

圖4 JAZF1蛋白磷酸化位點

圖5 JAZF1糖基化位點

2.1.4 JAZF1蛋白親疏水性分析

蛋白疏水性分析顯示，豬JAZF1基因編碼蛋白為水溶性蛋白，如圖6所示。JAZF1蛋白疏水性最小值為-2.700，,最大值為1.511，氨基酸序列內(nèi)大部分屬于親水性氨基酸。

圖6 JAZF1氨基酸親水性分析

2.1.5 蛋白結構域分析及功能預測

結構域顯示，豬JAZF1氨基酸殘基分別有3個 ZnF-C2H2 的結構域；JAZF1蛋白功能分析結果如表2所示，發(fā)現(xiàn)該蛋白在能量代謝、脂肪酸代謝的作用概率明顯高于其他功能，蛋白運載結合概率最高為2.030，說明JAZF1基因在脂肪酸代謝和轉運中發(fā)揮重要作用，可能對調節(jié)脂肪的沉積有重要影響。

表2 JZAF1蛋白功能預測結果

3 討論與結論

JAZF1作為一個新發(fā)現(xiàn)的基因，其對糖代謝和脂肪代謝的重要調控作用已經(jīng)得到證實。糖代謝方面，JAZF1的表達與人的二型糖尿病密切相關，其詳細調控機制目前尚不明晰。脂肪代謝方面主要是通過抑制脂肪形成和促進其分解來調控，有研究證實，JAZF1主要是通過抑制細胞內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的沉積，來提高肝臟脂肪酸的β氧化作用，進而促進脂肪分解。梁艷等研究發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增加，JAZF1基因在豬肌肉中的表達呈現(xiàn)下降趨勢，研究結果顯示JAZF1基因在肌肉發(fā)育和肌內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要調控作用；朱才業(yè)對不同品種羊全基因組關聯(lián)分析，證實JAZF1基因與脂肪形成密切相關。JAZF1的結構域顯示該蛋白含有鋅指家族中最為普遍的C2H2結構域類型，C2H2結構域根據(jù)含鋅指結構數(shù)量的多少可分為三類鋅指蛋白，含3個鋅指結構的C2H2型鋅指蛋白（tC2H2），含多個C2H2結構的鋅指蛋白（maC2H2）；鋅指成對間隔排列的 spC2H2 型。豬的JAZF1蛋白結構含有3個鋅指結構，屬于tC2H2型鋅指蛋白，每個鋅指由一個螺旋和2個折疊組成，鋅指間由接頭連接，接頭內(nèi)氨基酸具有保守性，3個鋅指在蛋白內(nèi)串聯(lián)排列均結合到DNA大溝內(nèi)。此類結構域通常作為重要的轉錄調控因子參與表達調控，所以JAZF1蛋白極有可能是參與肌內(nèi)脂肪沉積的重要調控因子。

蛋白質磷酸化糖基化是最常見、最重要的蛋白質翻譯后修飾方式之一，也是一種普遍的生命活動調節(jié)方式，在信號傳遞等過程中發(fā)揮重要作用。利用生物信息學軟件分析，發(fā)現(xiàn)JAZF1蛋白存在18個絲氨酸磷酸化位點，3個酪氨酸磷酸化位點，2個蘇氨酸磷酸化位點及19個糖基化位點， 這些位點可能在細胞的信號轉導、分化及細胞生長等多個生理過程中發(fā)揮著重要作用。JAZF1蛋白功能的預測表明該蛋白對脂肪酸代謝及能量代謝有重要的調節(jié)作用，JAZF1基因對脂肪的合成可能有重要影響。