宋慧,秦倪,于彩霞,師朵,劉雯

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,山東 青島 266071)

EB病毒(EBV)是一種普遍存在的γ皰疹病毒，世界上絕大多數(shù)人都曾感染EBV并獲得適應(yīng)性免疫。1964年，EBV首先在伯基特淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤相關(guān)，包括霍奇金淋巴瘤、未分化的鼻咽癌以及10%左右的胃癌[2]。EBV在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)多種潛伏基因，其中EBV編碼的核抗原1(EBNA1)是唯一一個(gè)在所有EBV相關(guān)腫瘤細(xì)胞中都表達(dá)的潛伏基因。EBNA1可以與多種細(xì)胞蛋白相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，并且對(duì)維持EBV的潛伏感染狀態(tài)起著重要作用。2014年，癌癥基因組圖譜(TCGA)將胃癌分為了4種分子亞型：EB病毒相關(guān)胃癌(EBVaGC)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)、染色體不穩(wěn)定型(CIN)和基因組穩(wěn)定型(GS)等[3]。EBVaGC的單獨(dú)分類顯示其具有獨(dú)特的致癌機(jī)制，并提供了將EBV用作靶向治療胃癌的新生物標(biāo)志物的機(jī)會(huì)。

E2F轉(zhuǎn)錄因子于1986年被首次發(fā)現(xiàn)，可與腺病毒E2啟動(dòng)子相互作用[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)8個(gè)E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員(E2F1～8)，其中大多數(shù)與控制細(xì)胞周期有關(guān)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞分化、凋亡和DNA損傷等也發(fā)揮重要作用。E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)是第一個(gè)被鑒定的E2F家族成員，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRB)可與 E2F1相結(jié)合，進(jìn)而抑制其活性[5]。多項(xiàng)研究顯示，E2F1在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，如肺癌、乳癌、前列腺癌等[6-8]。E2F1的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。然而，在胃癌中EBV對(duì)E2F1的調(diào)控及其作用機(jī)制，以及E2F1在胃癌中發(fā)揮的作用目前尚不明確。本文構(gòu)建EBNA1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型，檢測(cè)EBVaGC細(xì)胞、EBV陰性胃癌細(xì)胞(EBVnGC)及EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中E2F1的表達(dá)，探討E2F1在EBVaGC中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究采用了EBVaGC細(xì)胞系GT38、GT39和SNU719以及EBVnGC細(xì)胞系SGC7901、AGS和BGC823。所有的細(xì)胞系均加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清以及10 g/L青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含有體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自德國(guó)Invitrogen公司；RIPA裂解液、SDS-loading buffer購(gòu)自北京康為世紀(jì)科技有限公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；FastStart Essential DNA Green Master購(gòu)自德國(guó)Roche公司；Anti-EBNA1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；Anti-E2F1抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Anti-β-actin抗體、HRP標(biāo)記的兔IgG和鼠IgG抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Light Cycler 96熒光定量PCR儀(SN10700型，瑞士Roche公司)；SDS-PAGE垂直板型電泳儀、濕式蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Quantum-ST5型(凝膠成像系統(tǒng)，法國(guó)Vilber Lourmat公司)。

1.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EBNA1的細(xì)胞模型

選取EBVnGC細(xì)胞系BGC823和SGC7901，采用Lipofectamine 2000試劑分別轉(zhuǎn)染EBNA1重組質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒(NC)，轉(zhuǎn)染24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。待細(xì)胞匯合度至90%左右時(shí)，采用1 g/L的嘌呤霉素(Puromycin)篩選穩(wěn)定表達(dá)EBNA1的細(xì)胞，直至熒光細(xì)胞含量90%以上。收集細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)EBNA1蛋白表達(dá)水平。EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞模型分別命名為BGC823-EBNA1及其對(duì)照BGC823-NC、SGC7901-EBNA1及其對(duì)照SGC7901-NC。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)EBNA1和E2F1 mRNA表達(dá)

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，使用First Strand cDNA合成試劑盒，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用FastStart Essential DNA Green Master對(duì)cDNA進(jìn)行qRF-PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL，其內(nèi)含有：Faststart Essential DNA Green Master Mix 10.0 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，RNase free water 8.0 μL，cDNA 1.0 μL。引物及其序列見表1。所有反應(yīng)均在LightCycler?96系統(tǒng)進(jìn)行。采用2-△△Ct法分別計(jì)算EBNA1和E2F1基因相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組，2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)差異的倍數(shù)。

表1 qRT-PCR引物及其序列

1.5 Western blotting方法檢測(cè)EBNA1和E2F1蛋白表達(dá)

用含有體積分?jǐn)?shù)0.10的苯甲磺酰氟(PMSF)和體積分?jǐn)?shù)0.10的廣譜磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白與5×的SDS-PAGELoading Buffer混合后沸水煮5 min。然后以每孔25 μg的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜上。用50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉2 h后，應(yīng)用TBST洗3次，一抗孵育4 ℃過(guò)夜。將孵育盒取出，一抗平衡室溫30 min后，應(yīng)用TBST洗3次,室溫二抗孵育2 h，以ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各種細(xì)胞EBNA1和E2F1表達(dá)比較

qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)顯示，所有EBVaGC細(xì)胞均表達(dá)EBNA1，而EBVnGC細(xì)胞不表達(dá)；E2F1mRNA在EBVaGC細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于EBVnGC細(xì)胞，差異有顯著性(t=13.60,P<0.01)；而E2F1蛋白在EBVaGC和EBVnGC細(xì)胞的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.757,P>0.05)。見圖1、表2。

圖1 細(xì)胞系中EBNA1和E2F1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

表2 細(xì)胞系中EBNA1和E2F1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

2.2 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞鑒定

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，EBNA1蛋白在BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而對(duì)照組細(xì)胞則不表達(dá)，證明EBNA1穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞模型已經(jīng)成功建立。見圖2、表3。

表3 細(xì)胞模型EBNA1蛋白表達(dá)水平

圖2 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中EBNA1蛋白的表達(dá)檢測(cè)

2.3 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中E2F1的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1的mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有顯著性(t=9.939、14.080,P<0.01)。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，BGC823-EBNA1組和SGC7901-EBNA1組E2F1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(t=6.222、4.681,P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中E2F1蛋白的表達(dá)檢測(cè)

表4 EBNA1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中E2F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討 論

EBV是第一種被確定的人類腫瘤相關(guān)的病毒，在不同的腫瘤中具有不同的潛伏感染狀態(tài)并表達(dá)不同的潛伏期基因。普遍認(rèn)為EBVaGC中EBV介于Ⅰ型和Ⅱ型潛伏之間[9]，其中確定表達(dá)的病毒潛伏基因包括EBNA1和EBERs，也有部分病例可能表達(dá)LMP1或LMP2A[10-11]。EBNA1是第一個(gè)被報(bào)道的EBV潛伏期蛋白，并在所有類型的潛伏細(xì)胞中都表達(dá)，對(duì)EBV基因組的穩(wěn)定存在起著重要的作用[12]，并通過(guò)與病毒附加體中特定DNA序列的相互作用激活其他EBV潛伏基因的表達(dá)。EBNA1也可以與多種細(xì)胞蛋白相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和腫瘤形成，提示EBNA1對(duì)EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用。EBVaGC約占胃癌病例的10%，是所有EBV相關(guān)腫瘤中病人數(shù)量最多的疾病[13]。EBVaGC具有獨(dú)特的分子特征，例如較高的DNA超甲基化發(fā)生率、程序性死亡配體1(PD-L1)的過(guò)表達(dá)、PIK3CA和ARID1A突變顯著增加和免疫浸潤(rùn)增加等[14]。多項(xiàng)研究表明，EBV感染的胃癌細(xì)胞中EBNA1表達(dá)為宿主細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)能力和轉(zhuǎn)化潛能提供了便利，包括逃避免疫監(jiān)視、降低對(duì)DNA損傷的反應(yīng)或通過(guò)抑制野生型P53蛋白表達(dá)降低凋亡應(yīng)激刺激敏感性等[15]。但是，EBNA1在EBVaGC中發(fā)揮的作用及其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

E2F轉(zhuǎn)錄因子是多種細(xì)胞事件的重要參與者，包括細(xì)胞周期、DNA合成、DNA修復(fù)和核轉(zhuǎn)錄等。E2F1是E2F家族中研究最多的成員，其通過(guò)調(diào)節(jié)編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[16-17]。有趣的是，E2F1可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境不同作為癌基因或者抑癌基因來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生[18-19]。E2F1的激活是致癌病毒促進(jìn)細(xì)胞增殖的常見策略，并且其在EBV中已經(jīng)得到證實(shí)。1991年，腺病毒E1A基因的產(chǎn)物被證明與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白(Rb)相互作用[20]。此后研究也表明，Rb可與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合[21]。在鑒定了所有不同形式的E2Fs后[22]，E2F1被認(rèn)為是主要的Rb結(jié)合細(xì)胞蛋白[23]。E2F1蛋白的功能受視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白R(shí)b的調(diào)節(jié)。當(dāng)Rb為非高磷酸化形式時(shí)，它通過(guò)其口袋結(jié)構(gòu)域與E2F1結(jié)合，并抑制E2F1的序列特異性DNA結(jié)合[24-25]。在伯基特淋巴瘤中，在核糖體活性失調(diào)的情況下，EBNA1可通過(guò)激活E2F1來(lái)恢復(fù)核糖體的活性，而不依賴于pRb[25]。EBNA3C也可以在非Rb依賴性途徑中，通過(guò)募集E2F6到E2F1的啟動(dòng)子來(lái)下調(diào)E2F1的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖[26]。另外有研究結(jié)果證明，EBNA3C可促進(jìn)S18-2與pRb的結(jié)合，提高游離E2F1水平[27]。有研究顯示，胃癌病人E2F1表達(dá)顯著增加，E2F1可促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展，且其高表達(dá)與胃癌病理分期差、腫瘤變大及預(yù)后更差呈正相關(guān)[28]。基于以上研究，本文在EBVaGC細(xì)胞中進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)探討EBNA1和E2F1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果顯示，EBVaGC細(xì)胞中E2F1的mRNA表達(dá)較EBVnGC細(xì)胞增高，但蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性；與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)EBNA1后E2F1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)。表明胃癌細(xì)胞中外源性EBNA1表達(dá)可促進(jìn)E2F1的轉(zhuǎn)錄及翻譯，并可能通過(guò)影響E2F1表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤形成。EBVaGC細(xì)胞和EBVnGC細(xì)胞中E2F1蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性，這可能是多種因素共同作用的結(jié)果，EBNA1對(duì)其表達(dá)的調(diào)控只是其中一個(gè)方面，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，EBNA1可能通過(guò)上調(diào)E2F1的表達(dá)，從而促進(jìn)EBVaGC的發(fā)生發(fā)展。闡明EBV介導(dǎo)的腫瘤生成的具體機(jī)制，有助于E2F1高表達(dá)胃癌病人的臨床治療，擴(kuò)大治療效益。因此，EBNA1對(duì)E2F1表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制以及E2F1在胃癌中的生物學(xué)功能有進(jìn)一步研究的意義。對(duì)EBV編碼EBNA1調(diào)控E2F1表達(dá)的研究可能為EBV相關(guān)腫瘤的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。