叢旭日 李秀啟 ① 董貫倉(cāng) 王亞楠 孫魯峰 客 涵 楊 健 姜 濤

(1. 山東省淡水漁業(yè)研究院 山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 濟(jì)南 250013；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 無(wú)錫 214081)

刀鱭(Coilianasus)是一種極為名貴的洄游性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。20世紀(jì)60年代黃河刀鱭年產(chǎn)量可達(dá)1500 t (蔡德霖等, 1980)，是黃河下游的重要物種，但受過(guò)度捕撈、水利工程、黃河斷流等影響，山東東平湖產(chǎn)卵場(chǎng)已被嚴(yán)重破壞，黃河口及河段很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)已無(wú)刀鱭分布。近年來(lái)，根據(jù)山東省淡水漁業(yè)研究院對(duì)黃河口漁獲物調(diào)查數(shù)據(jù)及對(duì)當(dāng)?shù)貪O民的走訪發(fā)現(xiàn)，黃河刀鱭再一次在黃河下游出現(xiàn)，但資源量依然較低。隨著刀鱭經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提高，相關(guān)針對(duì)資源保護(hù)的科研工作正在開(kāi)展，但多數(shù)集中于長(zhǎng)江河段。近日，黃河流域生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展已上升為國(guó)家戰(zhàn)略，漁業(yè)資源的合理開(kāi)發(fā)和保護(hù)顯得尤為重要，但黃河河段刀鱭研究依然空白，相關(guān)工作嚴(yán)重滯后。

耳石微化學(xué)分析能有效地反演洄游性魚(yú)類(lèi)的“履歷”，在耳石中，Sr、Ca元素沉積變化被用作研究不同鹽度海、淡水生境條件的“指紋”(竇碩增等, 2011；楊健等, 2010;姜濤，2014;姜濤等,2016)，結(jié)果具有獨(dú)特的生境相關(guān)性及客觀性的優(yōu)勢(shì)，即使僅有1尾樣本也能有效把握其生境狀態(tài)(徐鋼春等, 2014)。姜濤等(2013)通過(guò)分析鄱陽(yáng)湖刀鱭耳石微化學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，鄱陽(yáng)湖內(nèi)存在2種不同生活史的刀鱭群體；盧明杰等(2015)研究大遼河口紅狼牙虎魚(yú)(Odontamblyopus rubicundus)生活史類(lèi)型后發(fā)現(xiàn)，其可以適應(yīng)廣鹽度水體。近幾年來(lái)，該技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用到大水面放流效果評(píng)價(jià)中。李秀啟等(2017)驗(yàn)證了耳石鍶標(biāo)記技術(shù)在識(shí)別鳙(Aristichthy snobilis)放流個(gè)體的可行性并提出了最佳標(biāo)記濃度；司飛等(2019)探究了耳石微化學(xué)技術(shù)在牙鲆(Paralichthysolivaceus)增殖放流過(guò)程中的應(yīng)用。為更好地保護(hù)黃河口刀鱭，本研究依托EPMA技術(shù)，對(duì)黃河刀鱭進(jìn)行耳石微化學(xué)分析，以探究其生活史，為刀鱭種質(zhì)資源的保護(hù)、資源量的提高、漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展提供可行性建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

刀鱭于2016年5月采自黃河墾利段(圖1)，主要捕撈網(wǎng)具為刺網(wǎng)。共取得刀鱭 5尾(表1)，捕獲后置于-20℃冷凍待用。解剖后取出矢耳石，為降低誤差，統(tǒng)一使用左矢耳石進(jìn)行分析，使用去離子水清洗耳石表面雜質(zhì)及薄膜，置于室溫晾干待用。

圖1 刀鱭采樣地點(diǎn)Fig.1 The sampling sites of C. nasus

表1 刀鱭采樣資料Tab.1 Sample details of C.nasus from the Kenli section of the Huanghe River

耳石樣品使用環(huán)氧樹(shù)脂包埋固定制成樹(shù)脂塊，然后將樹(shù)脂塊固定于載破片上，凝固后切去多余樹(shù)脂部分。使用Discoplan-TS研磨機(jī)進(jìn)行粗磨至耳石剛要暴露，再用1200目的砂紙精磨至耳石核心完全暴露，最后采用Roto Pol-35磨拋機(jī)配合拋光液拋光至耳石表面無(wú)劃痕。處理好的耳石置于Milli-Q超純水中超聲清洗5 min，于烘箱內(nèi)38℃過(guò)夜烘干。

1.2 耳石微化學(xué)分析

參考Yang等(2006)的方法，使用X射線EPMA電子探針微區(qū)分析儀(JXA-8100，日本)分析耳石樣品。自耳石核心沿最長(zhǎng)徑至耳石邊緣的一條直線進(jìn)行定量線分析(line transect analysis)。EPMA 加速電壓和電子束電流分別為 15 kV 和 2×10-8A，束斑直徑為 5 μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間為15 s，以10 μm為間隔連續(xù)打點(diǎn)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)樣品取用碳酸鈣(CaCO3)和鈦酸鍶(SrTiO3)。定量線分析完成后，再對(duì)耳石樣品進(jìn)行面分布分析(mapping analysis)。此時(shí)，EPMA加速電壓和電子束電流分別為 15 kV 和 5×10-7A，束斑直徑為 5 μm，像素為 7 μm×7 μm，每點(diǎn)駐留時(shí)間為 30 ms。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U-test)。引入進(jìn)行格局轉(zhuǎn)變(Regime shifts)分析的STARS方法(Sequential T-test Analysis of Regime Shifts)，當(dāng)多于1個(gè)連續(xù)點(diǎn)出現(xiàn)顯著變化(基于數(shù)據(jù)方差和t檢驗(yàn)的P值)，將視為“轉(zhuǎn)變”，生成新的移動(dòng)平均(Rodionov,2004; Rodionovet al, 2005)。本研究設(shè)定截?cái)嚅L(zhǎng)度為10，Huber權(quán)重為1，置信度P為0.1，按照慣例Sr/Ca值標(biāo)準(zhǔn)化為Sr/Ca×103。

2 結(jié)果

2.1 定量線分析比較

定量線分析結(jié)果顯示(表2)，每尾刀鱭生長(zhǎng)階段不盡相同。本研究中，根據(jù)Sr/Ca值可分為不同生活史階段，且相鄰不同階段差異顯著(P＜0.05, Mann-Whitney U-test)(表2)。個(gè)體D1的Sr/Ca值可分為4個(gè)階段，分別為從核心沿矢狀面像邊緣至240 μm耳石徑的低值區(qū)域，平均值為 3.63±0.61；241～1320 μm 區(qū)域，平均值為2.24±0.72；1321～1960 μm 區(qū)域，平均值為3.57±0.68；1961～2310 μm 區(qū)域，平均值為 4.90±0.69。個(gè)體D4可分為3個(gè)階段，0～1180 μm區(qū)域，平均值為 1.90±0.76；1181～1570 μm 區(qū)域 ， 平均值為3.83±0.74；1571～2190 μm 區(qū)域，平均值為 4.82±0.77。個(gè)體D5可分為3個(gè)階段，0～1080 μm區(qū)域，平均值為 2.15±0.78；1081～1520 μm 區(qū)域，平均值為5.61±0.75；1521～1930 μm 區(qū)域，平均值為 4.74±0.70。個(gè)體D6可分為3個(gè)階段，0～660 μm區(qū)域，平均值為2.13±0.77； 661～1120 μm 區(qū)域，平均值為 6.17±0.99；1121～1440 μm區(qū)域，平均值為 4.84±0.76。圖 2以折線圖的形式表現(xiàn)不同類(lèi)型黃河刀鱭與東平湖刀鱭耳石矢狀面從核心(0 μm)到邊緣定量線分析Sr/Ca值變化對(duì)比。個(gè)體D2線分析顯示，生活史無(wú)規(guī)律，故不做階段劃分。

表2 刀鱭耳石鍶鈣比微化學(xué)Tab.2 Fluctuation of Sr and Ca microchemistry in otoliths of C.nasus

圖2 耳石矢狀面二維Sr含量分布Fig.2 Two-dimensional imaging using mapping analysis of the Sr in otoliths of C.nasusSr：鍶；Conc：Sr濃度；Area/%：面積占比；Ave：Sr濃度表平均值Sr：Strontium; Conc: Concentration of Sr;Area/%: The area proportion;Ave: The average concentration of Sr

2.2 面分析比較

面分析的結(jié)果更能直觀清晰地顯示出黃河刀鱭個(gè)體的生境履歷。Yang等(2011)關(guān)于長(zhǎng)江刀鱭的研究表明，刀鱭對(duì)應(yīng)淡水、淡咸水、海水生境的Sr/Ca有十分明顯的微化學(xué)特征，具體表現(xiàn)為＜3(藍(lán)色)、3～7(黃綠色)、＞7(黃紅色)，Ⅲ類(lèi)水體中，Sr/Ca×103值平均為海水區(qū)8.3±4.5、河口區(qū)5.6±1.1、淡水區(qū)2.7±1.5(Sectoret al, 2000; Yanget al, 2011)。個(gè)體 D2核心區(qū)域表現(xiàn)為藍(lán)色，隨著個(gè)體的生長(zhǎng)，黃色、藍(lán)色交替出現(xiàn)；個(gè)體D1、D4核心區(qū)表現(xiàn)為藍(lán)色，外緣區(qū)域表現(xiàn)為藍(lán)綠色；個(gè)體D5、D6核心區(qū)域表現(xiàn)為Sr值較低的藍(lán)色區(qū)域，隨著刀鱭生長(zhǎng)，耳石外圍逐漸形成較為明顯的黃色圓環(huán)，表明其已經(jīng)進(jìn)入Sr值較高的生活環(huán)境。

3 討論

耳石中元素Sr和Ca濃度比值的變化在國(guó)內(nèi)外研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)生活史中(Wellset al, 2000;Gillanderset al, 2005; Araiet al, 2006; 陳婷婷等, 2016;熊瑛等, 2014; 叢旭日等, 2019)，但有關(guān)黃河刀鱭的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。蔡德霖等(1980)研究表明，黃河刀鱭的生活史特征較為單一，成魚(yú)每年 4—5月沿黃河溯河洄游至東平湖，6—7月產(chǎn)卵，等孵化后于次年初進(jìn)入黃河口海域。由此可見(jiàn)，歷史上黃河墾利段是刀鱭重要的洄游通道，東平湖是主要產(chǎn)卵場(chǎng)，黃河口海域?yàn)樗黟D場(chǎng)、越冬場(chǎng)。對(duì)于現(xiàn)階段黃河刀鱭是否為洄游型刀鱭的爭(zhēng)論較大，有的學(xué)者認(rèn)為，黃河墾利段已不存在洄游型刀鱭，其再次出現(xiàn)是由于東平湖內(nèi)定居型刀鱭被動(dòng)進(jìn)入黃河所致，但此觀點(diǎn)缺乏充足論據(jù)。本研究從耳石微化學(xué)的角度出發(fā)，獲得的結(jié)果客觀真實(shí)地反映出黃河墾利段刀鱭的生境利用情況，為證明“三場(chǎng)一通道”依然分布洄游型刀鱭及其生活史多樣性提供了理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，黃河墾利段刀鱭的生境履歷具有復(fù)雜性的特點(diǎn)。Brown等(2009)研究表明，海水的Sr/Ca×103值相對(duì)穩(wěn)定(8.17～8.87)，而河流(0.27～19.18)和淡水湖泊波動(dòng)較大(0.20～5.02)。然而，孫珊等(2019)和徐江玲(2007)研究表明，受調(diào)水、調(diào)沙的影響，黃河口區(qū)域鹽度的時(shí)空變化較為劇烈，調(diào)水、調(diào)沙前后表層鹽度變化范圍約為6～25，垂直方向亦波動(dòng)較大，故不能通過(guò)傳統(tǒng)研究方法判斷黃河刀鱭是否到達(dá)鹽度較高的海水區(qū)域。本研究的個(gè)體可分為2種類(lèi)型。個(gè)體D2屬于第Ⅰ類(lèi)型，其生活史較復(fù)雜，淡水孵化后其生長(zhǎng)軌跡多次往返于淡水—半咸水生境，格局發(fā)生多次轉(zhuǎn)變，不具備洄游型刀鱭應(yīng)有的規(guī)律性特征，此外，耳石邊緣Sr/Ca值反映樣品被捕獲時(shí)的環(huán)境條件，個(gè)體 D2耳石邊緣 Sr/Ca值(＜3)較其他個(gè)體低，這是因?yàn)镾r/Ca值變化存在時(shí)滯效應(yīng)，表明個(gè)體 D2進(jìn)入此水域的時(shí)間較短，耳石尚未響應(yīng)生境的變化。大麻哈魚(yú)(Oncorhynchusketa)耳石的此種效應(yīng)可持續(xù) 12 d (王臣等, 2015)；李孟孟等(2017)對(duì)長(zhǎng)江安慶江段刀鱭的研究也存在此種效應(yīng)。個(gè)體 D1、D4、D5和D6屬于第Ⅱ類(lèi)型，孵化和早期的生活均在鹽度較低的淡水中進(jìn)行，淡水生境履歷較長(zhǎng)。線分析顯示，個(gè)體D1和D4能達(dá)到的Sr/Ca最大值分別為6.50和6.29，并未達(dá)到海水區(qū)的平均值(8.3)。D5和D6個(gè)體Sr/Ca的最大值雖然達(dá)到8.44和8.63，但由于黃河口區(qū)域鹽度二維變化受調(diào)水、調(diào)沙影響較大，尚不能判斷其生境履歷已延伸到鹽度較高的海水區(qū)。此外，個(gè)體D5雖然進(jìn)入Sr/Ca值較高的區(qū)域生活，但停留時(shí)間較為短暫。STARS法計(jì)算顯示，個(gè)體D5沒(méi)有形成“轉(zhuǎn)變”，而個(gè)體D6形成了“轉(zhuǎn)變”(圖3)。

圖3 不同類(lèi)型刀鱭耳石矢狀面從核心(0 μm)到邊緣定量線分析Sr/Ca值的變化Fig.3 Fluctuation of otolith Sr/Ca concentration ratios along line transects from the core (0 μm) to the edge in otoliths of C. nasus

通過(guò)EPMA技術(shù)分析顯示，本研究首次直觀地了解黃河口刀鱭的生境履歷特征。以個(gè)體D1、D4、D5和D6為代表的群體孵化、育幼階段均在淡水中進(jìn)行，索餌階段進(jìn)入Sr/Ca值較高的河口區(qū)，個(gè)體的Sr/Ca值均有一個(gè)從低值階段(＜3)突然升高至高值階段(3～7)的變化，根據(jù)對(duì)長(zhǎng)江刀鱭多年研究，第Ⅰ階段到第Ⅱ階段突越性的變化(從淡水進(jìn)入半咸水生活)對(duì)洄游性刀鱭來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的(姜濤等, 2013)，個(gè)體D1、D4、D5和D6變化劇烈，都存在突越性變化，表明其主動(dòng)進(jìn)入鹽度較高的區(qū)域，符合洄游型刀鱭的特征。以個(gè)體D2為代表的群體生活史較為復(fù)雜，無(wú)規(guī)律，推測(cè)可能是由于當(dāng)年?yáng)|平湖汛期放水而被動(dòng)進(jìn)入黃河的定居型刀鱭，其生活史軌跡受黃河水流的影響較大，雖然該個(gè)體無(wú)洄游型刀鱭的明顯特征，但據(jù)徐鋼春等(2014)、李孟孟等(2017)對(duì)于長(zhǎng)江刀鱭的研究表明，長(zhǎng)頜鱭(Coilianasus)與短頜鱭(Coilia brachygnathus)均參與江海洄游，長(zhǎng)江安徽和縣江段的短頜鱭也存在洄游個(gè)體，而短頜鱭屬于湖泊定居型刀鱭，分子層面上基于Cyt b和D-loop序列的分子標(biāo)記亦不能區(qū)分洄游型刀鱭與定居型刀鱭(孫超等, 2018)，表明刀鱭具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，也表明汛期從東平湖進(jìn)入黃河的定居型刀鱭經(jīng)過(guò)自然演化，一旦具備條件也會(huì)進(jìn)行溯河洄游。此外，個(gè)體D1和D5核心區(qū)域的 Sr/Ca×103值較高(＞3)，D2、D4和 D6核心區(qū)域的 Sr/Ca×103值較低(＜3)，這也在某種程度上反映了存在個(gè)體起源于不同產(chǎn)卵場(chǎng)的可能性。姜濤(2014)研究發(fā)現(xiàn)，耳石的長(zhǎng)度與魚(yú)體的年齡有非常高的相關(guān)性，可以作為估算刀鱭生活史的時(shí)間尺度，姜濤(2014)的研究還表明，黃河刀鱭大約在1齡離開(kāi)淡水生活[區(qū)域?yàn)?980±111) μm]。本研究中，個(gè)體D1(1210 μm)、D4(1160 μm)和 D5(1080 μm)均符合這一特征,均在1齡或1齡+離開(kāi)淡水生活,但個(gè)體 D2(590 μm)和 D6(560 μm)在不到1齡就已經(jīng)離開(kāi)淡水生活。其中，推測(cè)個(gè)體D2受黃河水流的影響，尚未具備洄游特征，而個(gè)體D6顯示出黃河刀鱭可能來(lái)自不同的群體，也表明其較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，與Jiang等(2014)在2009年捕獲的10尾黃河刀鱭耳石微化學(xué)分析結(jié)果相似，視其來(lái)源于同一群體。但在本研究中，黃河刀鱭個(gè)體表現(xiàn)出不同的生活史特征，2013年南水北調(diào)東線正式通水至今，東平湖定居型刀鱭已成為當(dāng)?shù)刂饕?jīng)濟(jì)性魚(yú)類(lèi)，推測(cè)東平湖與黃河聯(lián)通河道不定期泄洪致使一部分定居型刀鱭進(jìn)入黃河，是黃河刀鱭的資源群體組成較為復(fù)雜、多樣的重要原因。

隨著黃河流域生態(tài)保護(hù)和高質(zhì)量發(fā)展國(guó)家戰(zhàn)略的提出，黃河流域漁業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展變得尤為重要。近年來(lái)，由于產(chǎn)卵場(chǎng)被破壞、閘壩工程的興建、過(guò)度捕撈等因素，黃河刀鱭的種群結(jié)構(gòu)及生活史演變較大。根據(jù)調(diào)查，黃河與東平湖之間的聯(lián)通河道大清河只有在每年夏季泄洪時(shí)才開(kāi)閘放水，目前，尚不能證明東平湖具備產(chǎn)卵場(chǎng)的條件，在今后的工作中，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)早期發(fā)育階段的刀鱭進(jìn)行基礎(chǔ)生物學(xué)及耳石微化學(xué)的分析，結(jié)合年齡結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)死亡參數(shù)及親體產(chǎn)卵狀況更為精確的掌握東平湖、黃河下游及河口地區(qū)刀鱭生活史，監(jiān)測(cè)其是否形成固定的洄游種群，從而驗(yàn)證歷史上東平湖、黃河山東段、黃河口是刀鱭洄游的“三場(chǎng)一通道”。相關(guān)部門(mén)也可以利用已有先例的河壩魚(yú)道技術(shù)，保護(hù)洄游通道及產(chǎn)卵場(chǎng)的生態(tài)功能，確保種群正常的繁衍。