王 碩 張博倫 郭 彪 ① 姜 濤 陳 衛(wèi) 楊 健 高 燕 曾祥茜

(1. 天津市水產(chǎn)研究所 天津 300457；2. 天津市海洋牧場技術(shù)工程中心 天津 300457；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 江蘇 無錫 214081)

魚類在生長發(fā)育過程中，水體中的CaCO3在耳石上沉積的同時，其他微量元素也被沉積在耳石中，由于它的非細(xì)胞性和代謝惰性，一般不會發(fā)生分解或重吸收，這種元素的信息可以一直保存下來，成為記錄魚類生活史的元素指紋(elemental fingerprints)(李秀啟等, 2017)。目前，在魚類耳石中已檢測出的元素種類有50多種(熊瑛等, 2015)，且主要來源于魚類生活的水環(huán)境和食物(郭弘藝等, 2015; 熊瑛等, 2015)。水環(huán)境或食物的元素通過吸收進(jìn)入血液，再由血液進(jìn)入內(nèi)耳淋巴液；最終通過結(jié)晶作用將元素沉積在耳石中(Sturrock et al, 2012)。但由于各種元素的性質(zhì)不同，耳石對不同環(huán)境元素的響應(yīng)有所差別(郭弘藝等, 2015;熊瑛等, 2015)。鍶(Sr2+)作為一種硬酸元素，水體環(huán)境中和耳石中Sr2+的濃度具有顯著的正相關(guān)性(Walther et al, 2006)。因此，耳石Sr/Ca比分析一直以來被作為魚類生境重建和種群鑒定的重要技術(shù)手段(王玉堃等,2016; 李孟孟等, 2017a)，并逐步在增殖放流效果評估中得以研究應(yīng)用(李秀啟等, 2017; 司飛等, 2019a)。

目前，增殖放流魚類標(biāo)記方法中，掛牌標(biāo)記和被動整合式雷達(dá)標(biāo)要求魚苗體長較大且適合小規(guī)模標(biāo)記(Waldman et al, 1990; Navarro et al, 2007; 周輝霞等, 2017)，而分子標(biāo)記需要清晰的親本遺傳信息(童愛萍等, 2015)。但目前國內(nèi)魚類增殖放流的現(xiàn)狀是放流的苗種以小規(guī)格苗種為主，放流數(shù)量較大、放流企業(yè)較多且存在魚苗遺傳背景信息不清的情況。而耳石Sr2+標(biāo)記具有成本低、標(biāo)記方法簡便易操作、對苗種無損傷、一旦標(biāo)記不受外界影響, 可以對小規(guī)格苗種進(jìn)行大規(guī)模標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，是魚類標(biāo)記放流技術(shù)研究的一個新熱點(diǎn)問題(司飛等, 2019a)。

與淡水及河口魚類耳石Sr/Ca比和生境中的Sr/Ca比直接相關(guān)不同，海水中的Sr/Ca比不是影響海水魚類耳石Sr/Ca比的主要因素(Brown et al,2009)，海水魚類耳石Sr/Ca比可能受到海水環(huán)境中的Sr和Ca的相對濃度、魚類種類特性、水溫、鹽度和魚類生理狀態(tài)的影響(熊瑛等, 2015)。因此，海水中的Sr2+濃度對海水魚類耳石Sr/Ca比的影響，需分種類加以區(qū)別研究。(Liza haematocheila)作為我國增殖放流的重要品種(楊文波等, 2009)和天津市魚類增殖放流量最大(7347.302萬尾)的一個品種，全面、科學(xué)地評估其增殖放流效果，是保證放流工作有效開展的基礎(chǔ)(羅剛等, 2015)。放流個體標(biāo)記回捕法作為目前海洋漁業(yè)生物增殖放流效果評估的主要方法(劉璐等, 2014)，研究大規(guī)模標(biāo)記小規(guī)格苗種的方法是十分有必要的。本研究擬比較不同濃度Sr2+浸泡下，的耳石標(biāo)記效果，并嘗試對的耳石進(jìn)行雙環(huán)標(biāo)記，以探討耳石Sr2+標(biāo)記的可行性和不同放流群體識別的可能性，為大規(guī)模耳石Sr2+標(biāo)記放流提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚的來源及暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用魚為河北省黃驊市宏潤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司繁育的體長為3 cm左右的幼魚。3000尾幼魚運(yùn)回后，暫養(yǎng)于天津興盛海淡水養(yǎng)殖有限責(zé)任公司養(yǎng)殖車間的2個養(yǎng)殖池中，養(yǎng)殖池規(guī)格為6.0 m×6.0 m×1.3 m，每個養(yǎng)殖池盛水約為30 m3。暫養(yǎng)期間，每天投喂配合飼料2～3次，日換水量為30%，每周倒池1次。暫養(yǎng)海水為自然海水，鹽度為21～23、水溫為21℃～22℃、pH為7.83～8.03。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

通過向海水中添加SrCl2·6H2O將海水中Sr2+質(zhì)量濃度分別提升至50、100、200和400 mg/L，其中Sr2+質(zhì)量濃度為400 mg/L的海水Sr2+濃度處于過飽和狀態(tài)，海水呈乳白色。

將Sr2+質(zhì)量濃度為50、100、200和400 mg/L的海水分別注入50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱中，作為不同Sr2+質(zhì)量濃度標(biāo)記組，分別以L5M50、L5M100、L5M200和 L5M400表示；同時，將無添加 SrCl2·6H2O的自然海水單獨(dú)注入1個50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱，作為對照組，用L5M0表示。

挑選體長為5 cm左右健康的幼魚500條，均勻分配到4個標(biāo)記組和一個對照組，開始實(shí)驗(yàn)。整個標(biāo)記期間，不換水，每天正常投喂2～3次。標(biāo)記48 h后，分別將每個處理組中全部幼魚單獨(dú)轉(zhuǎn)移到一個網(wǎng)箱中進(jìn)行后期飼養(yǎng)。網(wǎng)箱規(guī)格為 1.5 m×1.5 m×1.3 m。待幼魚長至約10 cm左右時，每個處理組隨機(jī)挑選5尾用于耳石微化學(xué)分析。后期飼養(yǎng)期間，養(yǎng)殖用水和養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)，每天觀察幼魚的死亡狀況，并記錄。

1.3 雙環(huán)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前，海水中Sr2+質(zhì)量濃度經(jīng)電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP MS)測定，為7.9 mg/L。通過向海水中添加SrCl2·6H2O將海水中Sr2+質(zhì)量濃度分別提升至 100和 200 mg/L。

將Sr2+質(zhì)量濃度為200 mg/L的海水注入到2個50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱中，并隨機(jī)挑選體長為3 cm左右健康的幼魚200尾，均分到2個實(shí)驗(yàn)水族箱中。幼魚在Sr2+質(zhì)量濃度為200 mg/L的海水中標(biāo)記96 h后，將所有標(biāo)記幼魚轉(zhuǎn)移到2個網(wǎng)箱中繼續(xù)暫養(yǎng)。標(biāo)記幼魚的暫養(yǎng)網(wǎng)箱規(guī)格同1.2，網(wǎng)箱置于養(yǎng)殖池中，網(wǎng)箱為透水網(wǎng)衣，網(wǎng)箱中的海水可與養(yǎng)殖池的海水自由交換。標(biāo)記幼魚暫養(yǎng)條件同其他幼魚暫養(yǎng)一致。暫養(yǎng)30 d后，標(biāo)志幼魚長至5 cm左右，開始第2次標(biāo)記。將Sr2+質(zhì)量濃度為100 mg/L的海水注入2個50 L的實(shí)驗(yàn)水族箱中，并隨機(jī)從第1次標(biāo)記的幼魚中挑選體長為5 cm左右健康幼魚100尾，移入其中一個實(shí)驗(yàn)水族箱中進(jìn)行二次48 h標(biāo)記；同時挑選體長為5 cm左右未進(jìn)行標(biāo)記的健康幼魚100尾，移入另一個實(shí)驗(yàn)水族箱中標(biāo)記48 h。將200 mg/L的海水標(biāo)記、雙環(huán)標(biāo)記和100 mg/L的海水標(biāo)記幼魚分別單獨(dú)轉(zhuǎn)移到一個網(wǎng)箱中繼續(xù)暫養(yǎng)。分別用SL3、DL3-5和SL5表示200 mg/L的海水標(biāo)記、雙環(huán)標(biāo)記和100 mg/L的海水標(biāo)記。整個標(biāo)記期間，不換水，每天正常投喂2～3次。待幼魚長至約為10 cm左右時，隨機(jī)挑選5尾用于耳石微化學(xué)分析。

1.4 耳石檢測方法

1.4.1 耳石摘取及前處理 利用剪刀、尖頭鑷等工具將一對矢耳石取出，剔除有機(jī)質(zhì)，分別用去離子水、無水乙醇清洗，置于48孔盒中干燥備用。從一對矢耳石中隨機(jī)選取一塊用于前處理和微化學(xué)分析，前處理參照李孟孟等(2017b)的方法。先將耳石用Epofix環(huán)氧樹脂進(jìn)行固定包埋，38℃烘干12 h以上。然后，將包埋塊用AB膠粘貼于干凈的載玻片上，凝固2 h后，使用金剛石磨輪的碾磨機(jī)(Discoplan-TS型，Struers公司, 丹麥)切割碾磨。粗磨階段用500目金剛砂輪碾磨至耳石微露，接著用1200目砂紙精磨至耳石核心暴露，然后用磨拋機(jī)(Labo Pol-35, 丹麥Struers公司)裝備織布機(jī)拋光盤配合拋光液拋光，至耳石表面無明顯劃痕。最后，將樣品放入Milli-Q水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空鍍膜機(jī)(JEE-420, 日本電子株式會社)蒸鍍碳膜(36A, 25 s)。

1.4.2 耳石的 EPMA 分析 耳石的電子探針顯微分析(electron probe microanalysis, EPMA)參考司飛等(2019a)和楊健等(2010)的方法，利用X射線電子探針微區(qū)分析儀((JXA-8100型EPMA，日本電子株式會社)從耳石核心沿耳石最長徑至耳石邊緣呈直線進(jìn)行耳石Sr2+元素定量線分析。標(biāo)準(zhǔn)樣品使用CaCO3和SrTiO3。定量線分析EPMA的參數(shù)設(shè)定：加速電壓為15 kV，電子束電流為 2.0×10-8A；束斑直徑為 3 μm，每點(diǎn)駐留時間為15 s；以間距10 μm連續(xù)進(jìn)行打點(diǎn)測定。所有耳石線分析完后，用電子束在耳石矢狀面表面掃描進(jìn)行面分析。其 EPMA加速電壓和電子束電流分別為 15 kV 和 5.0×10-7A，束斑直徑為 3 μm，像素為 6 μm×6 μm，每點(diǎn)駐留時間為 30 ms。由于耳石中Sr含量遠(yuǎn)小于Ca含量，按照國際慣例將Sr/Ca比標(biāo)準(zhǔn)化，即統(tǒng)一用Sr含量/Ca含量×103表示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010和 SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著；利用Excel 2010和SigmaPlot 1.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

對50、100、200和400 mg/L浸泡組和對照組Sr2+元素在耳石上沉積的面分布進(jìn)行上機(jī)分析。4個標(biāo)記濃度處理組均出現(xiàn)明顯的“高Sr2+標(biāo)記環(huán)”(圖1)。

圖1 不同Sr2+濃度處理后耳石Sr2+元素面分布結(jié)果Fig.1 Mapping analysis of Sr in the otoliths of L. haematocheila marked with Sr solutions of different concentrations

通過定量線分析可知，50、100、200和400 mg/L浸泡組的Sr/Ca比均在距核1100 μm附近出現(xiàn)增高階段(圖 2)。線性分析結(jié)果顯示，Sr2+質(zhì)量濃度為 50～400 mg/L，標(biāo)記時長為 48 h，均被成功標(biāo)記。

圖2 不同處理組耳石樣品定量線分析結(jié)果Fig.2 The line transect analysis in the marked otoliths of L. haematocheila in different treatments

表1 不同處理組耳石Sr/Ca比變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Chang of Sr/Ca ratio in the marked otoliths of L. haematocheila in different treatments (Mean±SE)

表1 不同處理組耳石Sr/Ca比變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.1 Chang of Sr/Ca ratio in the marked otoliths of L. haematocheila in different treatments (Mean±SE)

注：Ⅰ為Sr/Ca比平穩(wěn)階段，Ⅱ?yàn)镾r/Ca比顯著變化階段，Ⅲ為Sr/Ca比極大值。同一列數(shù)值上不同字母表示差異顯著(P＜0.05)Note: Ⅰdenotes stationary stage, Ⅱ denotes stages of Sr/Ca ratio significantly changed in otoliths, Ⅲ denotes peak value of Sr/Ca ratio. Different letters in the same column indicate significant differences among different treatments (P＜0.05)

組別Treatments Ⅰ階段Sr/Ca比Sr/Ca ratio of stageⅠⅡ階段Sr/Ca比Sr/Ca ratio of stageⅡⅢ階段Sr/Ca比Sr/Ca ratio of stageⅢ標(biāo)記環(huán)寬度Width of marking ring/μm Sr2+峰區(qū)均值 為正常均值的倍數(shù)Multiples of mean values of high Sr2+ area to average value of normal Sr2+峰值 為正常均值的倍數(shù)Multiples of peak value of Sr2+ to average value of normal L5M06.458 2±0.266 0 L5M506.330 2±0.156 8 18.029 1±1.415 5a 27.856 7±1.428 6a54.00±10.29a 2.86±0.25a 4.42±0.27a L5M1006.251 7±0.129 0 20.442 9±1.691 2a 45.420 2±4.000 2b78.00±4.90bc3.29±0.32a 7.32±0.77b L5M2006.191 6±0.293 7 34.137 1±3.791 3b 81.842 4±5.789 7c76.00±7.48ab5.49±0.45b 13.29±0.99c L5M4006.471 1±0.307 0 29.720 8±1.214 4b 109.663 6±5.848 9d100.00±4.08c4.65±0.39b 17.04±1.18d

2.3 雙環(huán)標(biāo)記耳石上Sr2+元素EPMA分析結(jié)果

圖3 雙環(huán)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)耳石Sr2+元素面分布Fig.3 Sr2+ concentrations of mapping analysis in the marked otoliths of L. haematocheila in double ring marking experiment

線性分析結(jié)果顯示，Sr2+質(zhì)量濃度為200 mg/L，標(biāo)記時長為 96 h，體長為 3 cm 的的Sr/Ca比均在距核550 μm附近出現(xiàn)增高階段。體長為5cm的在Sr2+質(zhì)量濃度100 mg/L的海水中標(biāo)記時長為48 h，Sr/Ca比均在距核1100 μm附近出現(xiàn)增高階段(圖4)。雙環(huán)標(biāo)記組2次峰值出現(xiàn)明顯，彼此間幾乎沒有影響。

圖 4 雙環(huán)實(shí)驗(yàn)耳石樣品定量線分析Fig.4 The line transect analysis in the marked otoliths of L. haematocheila in double ring marking experiment

表2 雙環(huán)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)耳石Sr/Ca比變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.2 Change of Sr/Ca ratio in the marked otoliths of L. haematocheila in double ring marking experiment (Mean±SE)

表2 雙環(huán)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)耳石Sr/Ca比變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.2 Change of Sr/Ca ratio in the marked otoliths of L. haematocheila in double ring marking experiment (Mean±SE)

注：Ⅰ為Sr/Ca比平穩(wěn)階段，Ⅱ?yàn)镾r/Ca比顯著變化階段，Ⅲ為Sr/Ca比極大值；同一行數(shù)值上不同字母表示差異顯著(P＜0.05)Note: Ⅰdenotes stationary stage, Ⅱ denotes stages of Sr/Ca ratio significantly changed in otoliths, Ⅲ denotes peak value of Sr/Ca ratio. Different letters in the same row indicate significant differences among different treatments (P＜0.05)

SL3-5組別Treatments SL3第1次標(biāo)記SL5 First marking 第2次標(biāo)記Second marking Ⅰ階段 Sr/Ca比 Ratio of stageⅠ6.511 5±0.201 16.274 1±0.119 66.274 1±0.119 66.251 7±0.129 0Ⅱ階段 Sr/Ca比 Ratio of stageⅡ32.809 8±1.423 9a32.734 8±1.934 0a20.584 6±1.612 9b 20.442 9±1.691 2bⅢ階段 Sr/Ca比 Ratio of stageⅢ97.027 8±3.514 7a96.949 7±3.180 8a45.340 2±3.735 8b 45.420 2±4.000 2b標(biāo)記環(huán)寬度 Width of Marking ring/μm 225.50±13.77a217.50±16.52a 78.00±4.90b80.00±3.16b Sr2+峰區(qū)均值為正常均值的倍數(shù)Multiples of mean values of high Sr2+ area to average value of normal 14.97±0.84a 15.61±0.82a 7.27±0.71b7.32±0.77b Sr2+峰值為正常均值的倍數(shù) Multiples of peak value of Sr2+ to average value of normal 32.81±1.42a 32.73±1.93a 20.58±1.61b20.44±1.69b

3 討論

由于耳石是一種具有新陳代謝惰性的鈣化結(jié)構(gòu)(Campanaet al, 1985)，沉積在耳石中的生境元素能永久性保存，其可很好地記錄魚類生境的變遷(Elsdonet al, 2008)。因此，耳石微化學(xué)分析一直以來均作為一種重要的技術(shù)手段，用于魚類的生境重建和種群鑒定(王玉堃等, 2016; 李孟孟等, 2017a)。隨著學(xué)者們對大規(guī)模小規(guī)格魚類標(biāo)記方法的探索，耳石Sr2+標(biāo)記技術(shù)逐步由標(biāo)記淡水魚類(李秀啟等, 2017)向標(biāo)記海水魚類(張輝等, 2015; 司飛等, 2019a)發(fā)展。本研究中，4個標(biāo)記濃度處理組耳石Sr/Ca比均出現(xiàn)一個顯著的上升階段，耳石EPMA面分析也出現(xiàn)明顯的“高Sr2+標(biāo)記環(huán)”。這說明通過人為向海水中添加一定濃度Sr2+對耳石進(jìn)行微化學(xué)標(biāo)記是可行的。

魚類的耳石隨著魚類的生長而不斷生長(鄧維德等, 2010)，隨著耳石的總重量不斷增加，一些特定環(huán)境如Sr2+標(biāo)記在耳石中沉積的特定元素相對含量逐漸下降(Yamada et al, 1979; Schroder et al, 1995)。由于原子吸收光譜法(AAS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等檢測方法只能檢測均一化后的整體耳石樣品(司飛等, 2019b)，故非常容易出現(xiàn)Sr2+標(biāo)記隨著魚類生長而消失的假象。與之相比，EPMA可精確分析耳石剖面上不同位置的Sr2+含量沉積情況，從而不受標(biāo)記魚生長等限制，可避免上述局限，同時也為開展小規(guī)格大規(guī)模標(biāo)記提供了可能。在雙環(huán)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，耳石Sr2+元素面分布結(jié)果出現(xiàn)層次分明的雙環(huán)，且雙環(huán)標(biāo)記組耳石線性分析結(jié)果與對照組基本一致。這說明通過Sr2+標(biāo)記次數(shù)來進(jìn)行不同放流群體識別是可行的。

外源Sr2+在耳石內(nèi)沉積量響應(yīng)性變化存在著一定時滯性(邱晨等, 2019)，不同的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)其時滯性有所不同(王臣等, 2015; 李秀啟等, 2017; 邱晨等,2019)。本研究中，2次實(shí)驗(yàn)間隔時間約為20 d，2次標(biāo)記環(huán)之間層次分明。但雙環(huán)標(biāo)記時間是否可以進(jìn)一步縮短，需要結(jié)合時滯現(xiàn)象與耳石結(jié)構(gòu)、Sr2+沉積機(jī)制及魚體生長階段特征等相關(guān)性進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，耳石Sr2+標(biāo)記技術(shù)可實(shí)現(xiàn)小規(guī)格大規(guī)模標(biāo)記，也可通過多環(huán)標(biāo)記實(shí)現(xiàn)不同放流群體的識別，但是多環(huán)標(biāo)記過程中，不同標(biāo)記時間所需的最短時間間隔需要通過進(jìn)一步的研究確定。