付鈺茹，劉連芬，錢關(guān)澤

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城252059）

蘋果屬常見(jiàn)于北溫帶地區(qū)，隸屬于薔薇科(Rosaceae)，全球范圍內(nèi)該屬有38 個(gè)品種，廣泛分布于北美洲、亞洲和歐洲[1]。我國(guó)有30 個(gè)品種，其中有20 個(gè)為原產(chǎn)品種[2]，廣布于26 個(gè)省市和自治區(qū)，其中西部占比最大[3-4]，但日常生活中最常吃的綿蘋果（M.pumila Mill.）主要分布于山東[5]。在蘋果屬里，有些物種由于具有較高觀賞性，目前已作為我國(guó)重要的園林樹(shù)種，例如山荊子(M.baccata(L.)Borkh.)、垂絲海棠(M.halliana Koehne)和湖北海棠(M.hupehensis(Pamp.)Rehd.)等[1]。蘋果屬植物的繁殖方式主要有兩種，一種是通過(guò)種子進(jìn)行繁殖[6]，另一種是通過(guò)組織培養(yǎng)[1]，雖然前者應(yīng)用廣泛，但其優(yōu)良性狀難以保存，且繁殖效率較低，此時(shí)組織培養(yǎng)就大顯優(yōu)勢(shì)[7]，因?yàn)樗軌蝻@著地提高植物的繁殖系數(shù)，但如何進(jìn)一步優(yōu)化植物組織培養(yǎng)成為了現(xiàn)在最關(guān)心的問(wèn)題。反觀之，目前關(guān)于蘋果屬植物種子微形態(tài)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文將20 種蘋果屬植物種子置于掃描電鏡下，對(duì)其表面微形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)的研究，旨在為蘋果屬植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供可靠的理論依據(jù)。

分類學(xué)的研究歷程距今已超過(guò)250年[8]，雙名現(xiàn)象也日趨明顯。在各個(gè)種中，存在著普遍的不同作者使用不同名稱的現(xiàn)象，尤其本屬，僅蘋果這一個(gè)種就有100 多個(gè)學(xué)名[9]； 蘋果屬分類中的另一個(gè)難題是本屬普遍存在的種間雜交和無(wú)融合生殖現(xiàn)象，因此形成了多種中間類型，使本屬中的多份標(biāo)本無(wú)法具體到某一具體的種[10]。之前的鑒別方式主要通過(guò)對(duì)其表面形狀的描述來(lái)進(jìn)行，并沒(méi)有使用演化性狀來(lái)進(jìn)行，所以其中存在有很大的主觀因素，不能夠正確地反映屬內(nèi)類群的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系。以上所有難題都會(huì)對(duì)本屬植物的實(shí)際應(yīng)用和理論基礎(chǔ)造成嚴(yán)重的影響，同時(shí)還會(huì)阻礙本屬在商品價(jià)值方面的發(fā)展。

在2010年，章黎黎和楊曉紅通過(guò)對(duì)蘋果屬植物果實(shí)表皮微形態(tài)特征進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)蘋果屬果實(shí)表皮細(xì)胞間的長(zhǎng)寬比和間隙，以及共有的紋孔數(shù)量和寬度等，都會(huì)有不可忽略的差異，對(duì)其進(jìn)行分析后，推出了本屬植物系統(tǒng)演化的趨勢(shì)，由此證明果實(shí)表皮微形態(tài)特征在蘋果屬植物的分類上，能夠提供有清晰明確的分類依據(jù)[11]。不光可以通過(guò)果實(shí)表皮細(xì)胞微形態(tài)進(jìn)行分類，種子由于受環(huán)境的影響較小，所以它們的微形態(tài)特征也可以為植物系統(tǒng)的分類提供有理可依的證據(jù)[12]。然而卻很少有人報(bào)道微形態(tài)特征在蘋果屬的分類中所起到的重要作用。為此，本文對(duì)蘋果屬植物種皮的微形態(tài)特征進(jìn)行了詳細(xì)的比較研究，以期能夠?yàn)樵搶俚姆诸愄峁┬碌囊罁?jù)。

隨著種皮結(jié)構(gòu)逐漸多態(tài)性，已能夠?yàn)橹参锏姆诸愄峁┬碌挠行畔13-16]，并在20 世紀(jì)50年代時(shí)，已經(jīng)可以用在科、屬、種間進(jìn)行物種鑒定[17]。2015年，江丹丹和周晶等曾將種皮紋飾作為劃分繡線菊屬（Spiraea L.）植物的依據(jù)，在其研究的25 種植物中，共發(fā)現(xiàn)有4 種類型的紋飾，而且差異顯著，可作為區(qū)分不同種類及種下分類群的依據(jù)[18]。2018年，苑景淇，薛歡等人對(duì)5 種忍冬屬植物（Lonicera L.）的種子進(jìn)行了電鏡掃描，同樣是根據(jù)種皮紋飾進(jìn)行分類，共分為兩類，為以后的分類學(xué)研究奠定基礎(chǔ)[19]。種皮微形態(tài)在多個(gè)屬中均可為種系分類提供依據(jù)，同樣，在蘋果屬這樣一個(gè)“困難屬”中，也可為其分類提供基礎(chǔ)資料，并且暫無(wú)人將種皮微形態(tài)作為蘋果屬的分類依據(jù)，因此此研究具有重要的奠基作用； 在亞顯微水平上，研究種皮微形態(tài)能為傳統(tǒng)的分類依據(jù)提供額外的微觀證據(jù)，指示出其系統(tǒng)地位。

本文在種皮的微形態(tài)特征方面進(jìn)行研究，通過(guò)電鏡掃描和細(xì)致觀察，發(fā)現(xiàn)所研究的植物種皮細(xì)胞形狀主要有2 大類，短細(xì)胞和長(zhǎng)細(xì)胞，可細(xì)分為8 種不同的類型，即圓邊多邊形、正六邊形、斜長(zhǎng)方形、長(zhǎng)五邊形、多邊形、細(xì)柱狀、長(zhǎng)多邊形、細(xì)長(zhǎng)帶狀； 紋飾類型有3 種，即無(wú)紋飾、微紋飾、縱向條狀皺紋，通過(guò)對(duì)種皮細(xì)胞和紋飾的比較，發(fā)現(xiàn)不同種間的差異，并進(jìn)行分析討論，以期為本屬植物的分類提供新的依據(jù)，以此來(lái)區(qū)分屬內(nèi)類群的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系。

表1 蘋果屬植物種皮電鏡微形態(tài)實(shí)驗(yàn)材料憑證標(biāo)本Table 1 Specimen for the experiments of seeds coat of Malus

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所選種子分別來(lái)自江蘇省植物研究所標(biāo)本館(NAS)和南京林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館(NF)蠟葉標(biāo)本，使所選日期相接近，并成熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

先將材料置于超聲波下處理約1 min，然后在55℃下恒溫培養(yǎng)一夜，取出后，在表面噴金40 s，最后置于電子顯微鏡下對(duì)中皮表面微形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.2 觀察內(nèi)容

分別在350(或500)、1000、2000、3000、4000、5000、10000 倍下拍照，所選部分應(yīng)具有代表性并潔凈無(wú)污染。

2 結(jié)果

(1)臺(tái)灣林檎M.doumeri: 多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)不規(guī)則形，中間向內(nèi)凹陷(應(yīng)為外突，內(nèi)凹現(xiàn)象可能是高位掃描頭的顯示誤差)，凹陷程度或淺或深，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate I: Figure 1—2)。

(2)尖嘴林檎M.melliana: 多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)為不規(guī)則形，向外突出不均勻，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate I: Figure 3—5)。

(3)花冠海棠M.coronaria: 正六邊形，向外突出，突出程度較為均勻，少數(shù)地方有凹陷，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate I: Figure 6)。

(4)河南海棠M.honnanensis: 斜長(zhǎng)方形，形狀邊界略微模糊，細(xì)胞壁表面輕微皺紋(Plate I: Figure 7)。

(5)西蜀海棠M.prattii: 六邊形，中間有輕微凹陷，整體比較平坦，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate I: Figure 8)。

(6)滇池海棠M.yunnanensis: 短長(zhǎng)方形或長(zhǎng)五邊形，邊界清晰，中間向內(nèi)凹陷，長(zhǎng)寬比約為2:1，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate II: Figure 1—2)。

(7)保山海棠M.baoshanensis: 形狀不定，多變，外層表皮細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中首先發(fā)生破裂，形成管狀，然后由向內(nèi)的第二層細(xì)胞逐步形成新的種皮，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate II: Figure 3—5)。

(8)隴東海棠M.kansuensis: 長(zhǎng)方形，整體平坦，長(zhǎng)寬比約為3:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，呈縱向排列，條狀(Plate II: Fig.6—8, Plate III: Figure 1—2 )。

(9)變?nèi)~海棠M.toringoides: 長(zhǎng)方形，似長(zhǎng)線，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，整體來(lái)看平坦，細(xì)胞壁表面有皺紋，較少，縱向分布，條狀(Plate III: Figure 3—6 )。

(10)花葉海棠M.transitoria: 長(zhǎng)方形，排列不整齊，邊界往同一方向翹起，長(zhǎng)寬約為2:1 或3:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，數(shù)量較少，條狀(Plate III: Figure 7—8 )。

(11)小金海棠M.xiaojinensis: 長(zhǎng)方形，中間凹陷較深，邊界明顯，長(zhǎng)寬比多數(shù)約為2:1，有些是1:1，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾(Plate IV: Figure 1—2 )。

(12)三葉海棠M.toringo: 斜長(zhǎng)方形，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，整體平坦，細(xì)胞壁表面皺紋，數(shù)量較少，縱向條狀(Plate IV: Figure 3—4 )。

(13)沙金海棠M.sargentii: 細(xì)長(zhǎng)條狀，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，整體平坦，細(xì)胞壁表面有皺紋，縱向排列(Plate IV: Figure 5—8)。

(14)山荊子M.baccata: 細(xì)長(zhǎng)條狀，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，縱向排列(Plate V:Figure 1—2)。

(15)毛山荊子M.mandshurica subsp.: 細(xì)長(zhǎng)長(zhǎng)方形，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，細(xì)胞壁有少量縱向條狀皺紋(Plate V: Figure 3—4)。

(16)麗江山荊子M.rockii: 細(xì)長(zhǎng)條狀，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，縱向排列，少許褶皺有輕微扭曲(Plate V: Figure 5—6)。

(17)湖北海棠M.hupehensis: 神農(nóng)架所產(chǎn)種皮細(xì)胞長(zhǎng)條狀，極細(xì)，整體平坦，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，縱向排列，皺紋上有星星點(diǎn)點(diǎn)的不規(guī)則突起(Plate V: Figure 7—8)；而產(chǎn)于江蘇的細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)長(zhǎng)寬比較小，邊界更為明顯，其上僅有少量皺紋，縱向排列，而無(wú)突起(Plate VI: Figure 1—3)。

Plate V.Figure 1 山荊子M.baccata 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 1 小金海棠M.xiaojinensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 1 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 1 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 1 臺(tái)灣林檎M.doumeri 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 2 山荊子M.baccata 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 2 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 2 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 2 滇池海棠M.yunnanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 2 臺(tái)灣林檎M.doumeri 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 3 三葉海棠M.toringo 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 3 毛山荊子M.mandshurica subsp.種皮紋飾圖

Plate III.Figure 3 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 3 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 3 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 4 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 4 三葉海棠M.toringo 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 4 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 4 毛山荊子M.mandshurica subsp.種皮紋飾圖

Plate I.Figure 4 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 5 保山海棠M.baoshanensis 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 5 麗江山荊子M.rockii 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 5 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 5 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 5 尖嘴林檎M.melliana 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 6 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 6 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 6 變?nèi)~海棠M.toringoides 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 6 麗江山荊子M.rockii 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 6 花冠海棠M.coronaria 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 7 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 7 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 7 花葉海棠M.transitoria 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 7 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 7 河南海棠M.honnanensis 種皮紋飾圖

Plate IV.Figure 8 沙金海棠M.sargentii 種皮紋飾圖

Plate II.Figure 8 隴東海棠M.kansuensis 種皮紋飾圖

Plate III.Figure 8 花葉海棠M.transitoria 種皮紋飾圖

Plate V.Figure 8 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate I.Figure 8 西蜀海棠M.prattii 種皮紋飾圖

(18)多花海棠M.floribunda: 細(xì)長(zhǎng)柱狀，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，整體平坦，細(xì)胞壁有縱向條紋，局部區(qū)域條紋上有顆粒狀突起(Plate VI: Figure 4—5)。

Plate VI.Figure 1 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 2 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 3 湖北海棠M.hupehensis 種皮紋飾圖

Plate VI.Figure 5 多花海棠M.floribunda 種皮紋飾圖

3 分析與討論

根據(jù)蘋果屬種皮微形態(tài)顯示，其表面沒(méi)有形成復(fù)雜的特化結(jié)構(gòu)，而是直接以細(xì)胞的形式組成種皮，這樣可以更為直觀的觀察通過(guò)電鏡到種皮細(xì)胞的形狀和大小。類型主要有兩大類： 長(zhǎng)寬等比的短細(xì)胞和長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)超10:1 的長(zhǎng)細(xì)胞，由短細(xì)胞演變?yōu)殚L(zhǎng)細(xì)胞，體現(xiàn)了蘋果屬植物發(fā)展的不同趨勢(shì)，越原始的細(xì)胞長(zhǎng)度越短；同樣，越進(jìn)化的細(xì)胞長(zhǎng)度也相對(duì)會(huì)更長(zhǎng)。原始細(xì)胞的長(zhǎng)寬比通常有固定數(shù)值，主要為原始蘋果亞屬、滇池海棠組、花楸蘋果組的部分種所有； 山荊子組的種皮細(xì)胞則呈長(zhǎng)條狀或長(zhǎng)帶狀。

（1）綠海棠組：僅檢測(cè)花冠海棠，種皮細(xì)胞呈正六邊形，向外突出，突出程度較為均勻，少數(shù)地方有凹陷，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾。

（2）多勝海棠組：檢測(cè)兩種，臺(tái)灣林檎和尖嘴林檎。臺(tái)灣林檎多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)不規(guī)則形，中間向內(nèi)凹陷(應(yīng)為外突，內(nèi)凹現(xiàn)象可能是高位掃描頭的顯示誤差)，凹陷程度或淺或深，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾。尖嘴林檎多數(shù)為圓邊多邊形，少數(shù)為不規(guī)則形，向外突出不均勻，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾。共同點(diǎn)是均呈現(xiàn)近圓形的多邊形，每邊長(zhǎng)度基本相等（等邊型），上組與之類似，在進(jìn)化上都處于極為原始的形態(tài)。

（3）滇池海棠組：此時(shí)種皮細(xì)胞的長(zhǎng)寬比逐漸加大，成為倍邊型，保山海棠頂面觀為近正五邊形，等邊型，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾，屬于較為原始的類群；西蜀海棠種皮細(xì)胞六邊形，但各邊不完全等長(zhǎng)，有些邊稍微延長(zhǎng)，但長(zhǎng)寬比控制在兩倍以內(nèi)，未超過(guò)等邊型的范疇，因此與前者一樣，均為較為原始的類群，同樣也無(wú)紋飾；滇池海棠短長(zhǎng)方形或長(zhǎng)五邊形，邊界清晰，中間向內(nèi)凹陷，長(zhǎng)寬比約為2:1，已超過(guò)等邊型的范疇，完全屬于倍邊型，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾，比前兩者的進(jìn)化程度都要高，更近一層；河南海棠斜長(zhǎng)方形，長(zhǎng)寬比超過(guò)兩倍，形狀邊界略微模糊，細(xì)胞壁表面輕微皺紋，比滇池海棠更為進(jìn)化，屬于本組最進(jìn)化的種。這一結(jié)果與形態(tài)、葉表皮微形態(tài)分析的結(jié)果相似。

（4）花楸蘋果組：本組細(xì)胞比前一組的長(zhǎng)度更長(zhǎng)，前組長(zhǎng)寬比超過(guò)兩倍的不多，而本組則全部超過(guò)兩倍，處于3～5 倍的水平，但仍屬于倍邊型范圍。隴東海棠長(zhǎng)方形，整體平坦，長(zhǎng)寬比約為3:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，呈縱向排列，條狀。小金海棠也是長(zhǎng)方形，中間凹陷較深，邊界明顯，長(zhǎng)寬比多數(shù)約為2:1，有些是1:1，細(xì)胞壁表面無(wú)紋飾，小金海棠與變?nèi)~海棠雖然都是長(zhǎng)方形，但變?nèi)~海棠的長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10 倍，因此將小金海棠歸為變?nèi)~海棠顯的并不是很合理，歸為隴東海棠反而更合適，長(zhǎng)寬比相接近，并且也都是長(zhǎng)方形；變?nèi)~海棠長(zhǎng)方形，似長(zhǎng)線，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，整體來(lái)看平坦，細(xì)胞壁表面有皺紋，較少，縱向分布，條狀，遠(yuǎn)超倍邊型的范圍，與山荊子組較為相似；花葉海棠長(zhǎng)方形，排列不整齊，邊界往同一方向翹起，長(zhǎng)寬約為2:1 或3:1，仍屬于倍邊型的范疇內(nèi)，細(xì)胞壁表面有皺紋，數(shù)量較少，條狀，由此可知，變?nèi)~海棠與花葉海棠的關(guān)系并不是很近，分子系統(tǒng)學(xué)以及化學(xué)分類學(xué)分析的結(jié)果與此相符，因此二者間的關(guān)系還有待研究。

（5）山荊子組：該組種皮細(xì)胞均為細(xì)長(zhǎng)帶形或長(zhǎng)條形，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)超10 倍，是最進(jìn)化的類群。由于形狀、特征相似，所以難以區(qū)分，無(wú)法細(xì)分到具體的種。只有湖北海棠能分為兩種，神農(nóng)架所產(chǎn)種皮細(xì)胞長(zhǎng)條狀，極細(xì)，整體平坦，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)大于10:1，細(xì)胞壁表面有皺紋，縱向排列，皺紋上有星星點(diǎn)點(diǎn)的不規(guī)則突起；而產(chǎn)于江蘇的細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)長(zhǎng)寬比較小，邊界更為明顯，其上僅有少量皺紋，縱向排列，而無(wú)突起；多花海棠局部區(qū)域條紋上有顆粒狀突起。

傳統(tǒng)的分類學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，綠海棠組和多勝海棠組處于最原始的狀態(tài)，滇池海棠組和花楸蘋果組則處于中間位置，山荊子組是最為進(jìn)化的類群，以上均與本研究結(jié)果相一致，因此，種皮細(xì)胞微形態(tài)能夠?yàn)樘O果屬植物的分類提供有效的依據(jù)。種皮細(xì)胞由等徑開(kāi)始，然后長(zhǎng)寬比的倍數(shù)逐漸加大，最后長(zhǎng)寬比可達(dá)10 倍以上，可知物種是在不斷進(jìn)化的，長(zhǎng)寬比倍數(shù)越大，進(jìn)化越快，可見(jiàn)種皮細(xì)胞能體現(xiàn)各組間的演化關(guān)系。在紋飾方面，對(duì)于等邊型的類群來(lái)說(shuō)，紋飾多呈向心狀或無(wú)紋飾，隨著長(zhǎng)寬比逐漸加大，其紋飾也越來(lái)越明顯，多呈縱向條狀排列，由紋飾也能夠看出各組間的演化關(guān)系。不只能夠作為分類的依據(jù)，還能夠解決分類學(xué)上的一些疑難問(wèn)題。綜上，本研究能夠?yàn)樵搶僦参锏南到y(tǒng)發(fā)育和分類研究提供新依據(jù)，為之后種皮微形態(tài)的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究所拍攝的種皮紋飾并不是非常完美，還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。