時(shí)慧 ，汪河濱 ，連培涵 ，楊玲*

(1塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

（2塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（3天水師范學(xué)院，甘肅 天水 741001）

金屬-有機(jī)骨架（metal-organic framework，MOF）作為一種有序結(jié)晶結(jié)構(gòu)且含有雜化晶態(tài)的配位聚合物多孔材料［1-2］，應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛［3］。其中類(lèi)沸石咪唑酯金屬骨架是MOFs材料中的一個(gè)重要分支［4］，在藥物遞送領(lǐng)域最具代表性的類(lèi)沸石咪唑酯金屬骨架是ZIF-8，其有較高的藥物負(fù)載率、生物易降解性、多功能性和良好的生物相容性［5］。

黃芩素是高活性黃酮類(lèi)化合物，能夠通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌，增加胰島素的敏感度從而降低血糖水平，同時(shí)也具備抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、抗氧化等多種藥理作用［6-7］。但黃芩素半衰期短、水溶性差且體內(nèi)易分解、生物利用率低等缺點(diǎn)，導(dǎo)致黃芩素在生物體內(nèi)的使用受到制約［8-9］。

本研究以金屬離子Zn2+和有機(jī)配體2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MI）制備不同粒徑的ZIF-8納米顆粒［10-13］，并探討鋅鹽種類(lèi)、參與反應(yīng)原料之間的摩爾比例、反應(yīng)的溫度對(duì)產(chǎn)物形貌及結(jié)構(gòu)方面的影響，對(duì)比篩選出結(jié)晶度高、晶型好的反應(yīng)條件來(lái)制備載體。通過(guò)藥物分子和金屬離子之間的靜電相互作用將BA包裹于ZIF-8中形成新型納米給藥體系，解決黃芩素在溶液中易氧化，在堿性［14］條件下易降解的問(wèn)題。用ZIF-8負(fù)載黃芩素后增加對(duì)酸環(huán)境的響應(yīng)性釋放功能，在體內(nèi)緩慢釋放，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，從而減少用藥頻率避免藥物突釋后不能被及時(shí)有效吸收造成的浪費(fèi)。同時(shí)ZIF-8作為載藥材料又具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性低及簡(jiǎn)單易制備等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于納米給藥系統(tǒng)［15-19］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

甲醇（AR）和無(wú)水乙醇（AR）購(gòu)自天津市鑫鉑特化工有限公司；六水合硝酸鋅（AR，99%）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二水合乙酸鋅（AR，98%）和2-甲基咪唑（98%）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Apreo-S場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，賽默飛世爾科技有限公司；D8 Advance型X射線(xiàn)多晶衍射儀，德國(guó)Bruker公司，測(cè)試電壓40 kV，電流40 mA，輻射源Cu Kα，λ=0.15418 nm，步長(zhǎng)0.02°，測(cè)試速度0.1 s/step，掃描范圍2θ=5°～80°；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津儀器有限公司，測(cè)試掃描范圍200～800 nm，精準(zhǔn)度1 nm；ZEN3700型Zeta電位儀，英國(guó)Malvern有限公司；Frontier型紅外光譜儀，Perkin Elmer有限公司，測(cè)量波長(zhǎng)范圍是4000～450 cm-1，精準(zhǔn)度1 cm-1。

測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪制分析，掃描電鏡圖用Adobe Photoshop 2021軟件處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ZIF-8的制備

分別采用硝酸鋅、乙酸鋅作為金屬源，稱(chēng)取1 mmol鋅鹽溶解于10 mL甲醇，形成溶液A；按不同摩爾比稱(chēng)取2-甲基咪唑溶解于30 mL甲醇，形成溶液B。將溶解后的A、B溶液快速混合，密封攪拌12 h，高速離心收集沉淀，用甲醇洗滌3次除去未反應(yīng)的原料和雜質(zhì)。在80℃烘箱中放置6 h干燥后研磨得到白色的固體粉末即為ZIF-8。對(duì)比探究不同金屬陰離子、反應(yīng)物摩爾比例、溫度對(duì)產(chǎn)物的影響，如表1所示。采用SEM觀察其形貌及大小，采用FTIRXRD對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

表1 不同反應(yīng)條件設(shè)置表

1.2.2 藥物的裝載

按質(zhì)量比為1∶4稱(chēng)取黃芩素與ZIF-8分別加入適量無(wú)水乙醇，超聲至藥物完全溶解、ZIF-8分散均勻，混合后密封遮光，室溫?cái)嚢?4 h，用無(wú)水乙醇反復(fù)離心洗至上清液無(wú)色后，低溫冷凍干燥得到BA＠ZIF-8。采用掃描電鏡觀察其形貌及大小。

1.2.3 載藥率和包封率計(jì)算

配置1 mg/mL的黃芩素?zé)o水乙醇溶液作為儲(chǔ)備液，分別取不同體積的儲(chǔ)備液于10 mL的容量瓶中，定容后得到 17 μg/mL、15 μg/mL、13 μg/mL、11 μg/mL、9 μg/mL、7 μg/mL、5 μg/mL的黃芩素溶液，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)量各溶液在325 nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

將經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥的BA＠ZIF-8粉末于10 mL容量瓶中，加入30 μL的1 mol/L鹽酸和5 mL無(wú)水乙醇振蕩混勻3 min，至溶液呈澄清透明的淡黃色無(wú)沉淀后定容，在325 nm處測(cè)得溶液OD值，使用以下公式計(jì)算其包封率（EE）和載藥率（DLC）：

式（1）、式（2）中：mA為復(fù)合物中黃芩素的質(zhì)量，mg；mB為BA＠ZIF-8復(fù)合物的總質(zhì)量，mg；mC為稱(chēng)取的黃芩素總質(zhì)量，mg。

1.2.4 黃芩素的穩(wěn)定性

用移液槍吸取5 mL上述黃芩素貯備液分別溶于45 mL不同pH值 (pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2)的磷酸緩沖溶液和無(wú)水乙醇中，用封口膜密封后于暗處磁力攪拌，當(dāng)攪拌0.2 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h時(shí)，分別取樣1 mL于容量瓶中用乙醇稀釋定容并測(cè)量325 nm處的OD值，計(jì)算溶液中黃芩素的量。

1.2.5 BA＠ZIF-8的藥物釋放

將稱(chēng)取的20 mg BA＠ZIF-8均勻分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的磷酸緩沖溶液中，密封后于暗處攪拌，當(dāng)攪拌0.25 h、1 h、2 h、4 h、6 h、14 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h時(shí)，分別取樣2 mL離心后倒掉上清液保留沉淀，加入30 μL的1 mol/L鹽酸溶解，釋放出材料中剩余的黃芩素，用無(wú)水乙醇稀釋定容后測(cè)量325 nm處的OD值以計(jì)算剩余黃芩素的質(zhì)量，并繪制BA釋放量曲線(xiàn)。

式（3）中：mB為BA＠ZIF-8復(fù)合物的總質(zhì)量，mg；mD為復(fù)合物中剩余的黃芩素質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZIF-8多孔納米載體材料的制備工藝

制備不同粒徑、形貌的ZIF-8，SEM如圖1所示。由圖1（a）分析可知，采用乙酸鋅作為金屬源制備的ZIF-8，顆粒表面比較粗糙近似球形，大小不均勻。由圖1（b）分析可知，采用硝酸鋅作為金屬源制備的材料呈十二面體形貌，尺寸均一且邊緣棱角明顯，說(shuō)明物質(zhì)的結(jié)晶較好。由圖1（c）分析可知，采用硝酸鋅作為金屬源，在40℃下攪拌4 h制備出的ZIF-8，粒徑均低于100 nm。通過(guò)改變不同的反應(yīng)條件對(duì)比發(fā)現(xiàn)提高2-甲基咪唑與鋅離子的反應(yīng)比例和提高反應(yīng)溫度都可以使晶體粒徑變小，提高反應(yīng)比例是在形成晶核后通過(guò)在晶核表面吸附過(guò)量的中性配體從而減緩晶核的增長(zhǎng)，而提高反應(yīng)溫度可以加快晶體的成核速度，相比之下提高溫度的效果更顯著，且避免了試劑的浪費(fèi)。

圖1 不同粒徑、形貌的ZIF-8的SEM圖

分別以硝酸鋅、乙酸鋅作為金屬源與2-甲基咪唑采用1∶8配比室溫?cái)嚢?2 h制備的ZIF-8樣品XRD如圖2（a）所示，樣品測(cè)得多個(gè)彼此獨(dú)立且很窄的“尖峰”，這些特征衍射峰與文獻(xiàn)中衍射峰一致［15］，依 次 對(duì) 應(yīng) (001)、(002)、(112)、(022)、(013)、(222)晶面。由此證明硝酸鋅與乙酸鋅作為金屬源均能成功制備出ZIF-8。不同金屬源和物料比制備出的ZIF-8載體材料的衍射峰強(qiáng)度存在很大區(qū)別，其中硝酸鋅制備ZIF-8的衍射峰相對(duì)更強(qiáng)，說(shuō)明其晶型好、結(jié)晶度高。由圖2（b）分析可知，硝酸鋅與 2-甲基咪唑分別采用 1∶4、1∶6、1∶8 配比制備出ZIF-8的XRD圖發(fā)現(xiàn)其在小角區(qū)的衍射峰，即（001）晶面的峰位隨物料比增大而向大角度偏移，且峰強(qiáng)度減弱，說(shuō)明晶體尺寸減小。綜合考慮，后續(xù)反應(yīng)條件選擇硝酸鹽（1∶4）室溫?cái)嚢?2 h制備的ZIF-8為藥物載體材料。

圖2 不同金屬源與2-甲基咪唑反應(yīng)得到ZIF-8的XRD圖

2.2 載藥ZIF-8納米粒的表征

采用SEM觀測(cè)制備的ZIF-8、BA＠ZIF-8形貌，如圖3（a）、圖3（b）所示。晶體形貌皆呈規(guī)則性的菱形十二面晶體形態(tài)，與文獻(xiàn)［20-21］中的形貌相符，且粒徑大小較為均一。負(fù)載黃芩素后材料表面變粗糙，但整體形貌變化不大。

圖3 （a）ZIF-8與（b）BA＠ZIF-8的SEM圖

對(duì)比黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品、ZIF-8和BA＠ZIF-8載藥系統(tǒng)的FTIR如圖4所示，分析可知，由于黃芩素含有豐富的羥基，導(dǎo)致在3411 cm-1處形成較大的特征吸收峰，與BA＠ZIF-8中3428 cm-1處的特征峰類(lèi)似，而ZIF-8中并不存在O—H鍵伸縮振動(dòng)。同時(shí)BA＠ZIF-8載藥系統(tǒng)中在1448～1629 cm-1處也同樣出現(xiàn)了黃芩素由于苯環(huán)骨架振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，ZIF-8中1578 cm-1處的峰歸屬于C＝N伸縮振動(dòng)峰，在BA＠ZIF-8中藍(lán)移至1580 cm-1處，由此可以證明黃芩素確實(shí)與ZIF-8成功復(fù)合。

圖4 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的FTIR圖

使用Zeta電位分析儀分別檢測(cè)了BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的去離子水分散膠體溶液，分析膠體微粒的電位情況，以此來(lái)判斷藥物負(fù)載是否成功。如圖5所示，BA材料的Zeta電位為-47.4 mV、ZIF-8的Zeta電位為22 mV，同時(shí)ZIF-8的負(fù)載藥物BA后的Zeta電位由于ZIF-8表面的負(fù)電性被BA的負(fù)載部分所中和導(dǎo)致其顯著降低至-21.4 mV，由此證明ZIF-8材料成功負(fù)載黃芩素。

圖5 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的Zeta電位

2.3 藥物裝載與釋放

2.3.1 載藥率及包封率

為計(jì)算BA＠ZIF-8中黃芩素的包封率與載藥率，精準(zhǔn)繪制黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：A=0.04864C-0.05921（r2=0.99955）。如圖6所示黃芩素溶液在5～17 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。取10 mg BA＠ZIF-8，將其放置于容量瓶中并添加1 mol/L鹽酸搖勻使其分解后定容，在325 nm處檢測(cè)吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到其載藥率為14.89%，包封率為74.45%。

圖6 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3.2 藥物的穩(wěn)定性

黃芩素的結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)酚羥基，其化學(xué)性質(zhì)并不穩(wěn)定，在溶液中容易發(fā)生化學(xué)降解。含有羥基的黃酮易被氧化為醌類(lèi)衍生物，相關(guān)文獻(xiàn)［14］對(duì)黃芩素降解產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，主要有黃芩素的化學(xué)合成前體木蝴蝶素、6，7位鄰醌衍生物、苯甲酸苯酯類(lèi)衍生物等。為了探究BA＠ZIF-8中黃芩素穩(wěn)定性是否提高，測(cè)定了游離黃芩素在不同pH條件下的穩(wěn)定性。如圖7所示，溶解在無(wú)水乙醇溶液中黃芩素在1 h后有少量分解，這是由于輕微氧化的原因，在偏酸性環(huán)境下(pH 5.4、pH 6.8)黃芩素相對(duì)穩(wěn)定降解較少，在12 h后剩余約86.16%、84.53%的黃芩素，穩(wěn)定性較好。在弱堿性條件下(pH 7.2)黃芩素穩(wěn)定性差［22］，可以看到黃芩素在前1 h內(nèi)快速降解，剩余37.87%，6 h后剩余黃芩素的降解趨于平緩，剩余33.47%。

圖7 不同pH條件下和無(wú)水乙醇中黃芩素隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)

2.3.3 BA＠ZIF-8在不同pH條件下的藥物釋放

由于胃腸道周?chē)h(huán)境呈弱酸性，而ZIF-8是一種具有酸響應(yīng)性的框架材料，在酸性條件下，ZIF-8結(jié)構(gòu)會(huì)崩塌并釋放出包載的藥物。為了探究在酸性環(huán)境下BA＠ZIF-8中黃芩素的釋放行為，對(duì)BA＠ZIF-8的酸響應(yīng)釋放行為進(jìn)行測(cè)試。將BA＠ZIF-8分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的PBS溶液中，每隔一段時(shí)間取出少量溶液離心保留沉淀，加入1 mol/L鹽酸分解ZIF-8，對(duì)于載體中剩余黃芩素含量持續(xù)觀測(cè)96 h，繪成曲線(xiàn)如圖8所示，證明BA＠ZIF-8包載的黃芩素的釋放行為具有明顯的pH響應(yīng)性。在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2環(huán)境下黃芩素在前4 h釋放速率較快，釋放量分別為57.01%、38.97%、28.10%，4 h后釋放速率逐漸變小，96 h后在pH 5.4和pH 6.8環(huán)境下的釋放量達(dá)到87.81%、85.53%，而pH 7.2環(huán)境下累計(jì)釋放量為74.39%，表明酸性條件下更有利于藥物BA的釋放。出現(xiàn)這種情況是因?yàn)檩^多的黃芩素大部分堆積在ZIF-8接近外表面的孔道中，進(jìn)入內(nèi)部中心孔道的量相對(duì)較少。可見(jiàn)BA＠ZIF-8具有酸響應(yīng)釋放的功能，能夠有針對(duì)性的釋放所包載的黃芩素。

圖8 BA＠ZIF-8在不同pH條件下黃芩素隨時(shí)間變化的釋放曲線(xiàn)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常溫?cái)嚢璺ㄔO(shè)計(jì)合成了一種負(fù)載黃芩素的ZIF納米材料BA＠ZIF-8。首先制備出結(jié)晶度高、形貌好的三維納米載體材料，進(jìn)一步合成BA＠ZIF-8復(fù)合納米粒，通過(guò)對(duì)BA＠ZIF-8納米粒的多種表征確定，黃芩素不是簡(jiǎn)單吸附在材料表面而是被封裝在ZIF-8框架材料的孔道中，其表面形貌與未負(fù)載藥物的ZIF-8一致，為十二面體結(jié)構(gòu)，適宜的黃芩素添加量并不影響ZIF-8的晶型。藥物釋放實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果充分的證明了BA＠ZIF-8具有較高的包封率和載藥率，其在酸環(huán)境中也具有響應(yīng)行為。在酸性條件下BA＠ZIF-8會(huì)緩慢釋放其包載的黃芩素，96 h后在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2環(huán)境下黃芩素的累積釋放量分別達(dá)到87.81%、85.53%、74.39%。采用ZIF-8作為黃芩素載體在藥物負(fù)載的同時(shí)具有一定的選擇性，能有針對(duì)性地作用于身體的某一特定部位，有利于實(shí)現(xiàn)裝載黃芩素的pH響應(yīng)性釋放。