封明軍 ，雷富臣 ，豆靜，王新建 *

(1塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

（2南疆特色果樹高效優(yōu)質栽培與深加工技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

蘋果（Malus pumila）屬薔薇科蘋果屬植物，是世界上五大果樹（柑橘、蘋果、葡萄、香蕉、梨）之一，主要分布于北溫帶，橫跨歐亞大陸和北美洲，緯向幅度寬達30°（20°～50°N），栽培歷史悠久［1-3］。如今，世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展呈矮化栽培的趨勢，選擇適宜的矮栽品種是實現(xiàn)矮化栽培的關鍵。蘋果組培技術的成熟逐漸為蘋果矮化砧木快繁提供了技術保障［4］，目前建立的蘋果矮化砧木快繁體系主要包括‘M9’‘M26’‘八棱海棠’等［5-7］。近年來，矮化自根砧‘T337’作為世界各國應用最廣泛、最成功的脫毒矮化砧木，具有主干性強、易成花、豐產(chǎn)性好以及適應性廣等特點，被大量運用于矮化密植園中［8］。當前‘T337’組培快繁報道均以莖尖和莖段作為外植體［7,9］，未見以休眠芽為外植體的誘導研究。同時愈傷組織在植株再生、分子機理和轉基因等方面研究中被作為重要的試驗材料［10-12］，由于研究目的不同所需愈傷組織類型不同，通過不同培育條件能夠獲取目標所需愈傷組織。本試驗研究不同外植體類型和消毒時間，探究不同激素組合對啟動誘導、增殖培養(yǎng)和愈傷組織誘導的影響，以及葉片暗處理時間與愈傷形成的關系，以期建立‘T337’較優(yōu)組培誘導方法和葉片再生體系，為推進優(yōu)化蘋果矮化砧組織培養(yǎng)技術提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料于3～4月中旬采自新疆生產(chǎn)建設兵團第一師10團苗圃基地（81°18′E，40°35′N）蘋果矮化自根砧‘T337’枝條，將剪下的枝條用保鮮膜包裹帶回實驗室，插入自來水中培養(yǎng)一周待葉芽飽滿接近萌動，使用時將其剪成2～3 cm帶單芽的莖段或幼嫩莖尖。

1.2 方法

1.2.1 外植體類型及消毒時間的篩選

試驗以單芽莖段和幼嫩莖尖為外植體，通過消毒試驗進行篩選適宜的外植體類型。

單芽莖段消毒先用75%酒精處理30 s，后用2%次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗3次，用手術刀將休眠芽鱗片及周圍白色絨毛剝去，切下休眠芽進行二次消毒，設置不同消毒時間處理組合，75%酒精三個處理時間（5 s、7 s、9 s），1%的次氯酸鈉三個浸泡處理時間（1 min、3 min、5 min），共9個處理組合。

幼嫩莖尖僅采取一次消毒，設置不同消毒時間處理組合，75%酒精三個處理時間（10s、20s、30s），2%次氯酸鈉兩個浸泡處理時間（10 min、15 min），共6個處理組合，無菌水沖洗3次，接種在誘導培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1）上。每個處理接種30個外植體，重復3次，接種后置于培養(yǎng)室，溫度（25±2）℃，光照強度2000 lx，光照時間14 h/d（后續(xù)培養(yǎng)條件皆與此相同），接種30 d后統(tǒng)計污染率、死亡率和褐化率。

污染率=外植體污染數(shù)∕外植體接種數(shù)×100%

死亡率=外植體死亡數(shù)∕（外植體接種數(shù)-外植體死亡數(shù)）×100%

褐化率=外植體褐化數(shù)∕外植體接種數(shù)×100%

1.2.2 啟動誘導培養(yǎng)基的篩選

選擇6-BA與NAA的激素組合，以MS為基本培養(yǎng)基，加入30 g·L-1蔗糖、6.5 mg·L-1瓊脂、不同濃度的6-BA（1.00 mg·L-1、1.50 mg·L-1、2.00 mg·L-1）和 NAA（0.10 mg·L-1、0.30 mg·L-1、0.50 mg·L-1），pH值為5.8，以空白MS培養(yǎng)基為對照，共10個處理組合，每個處理接種30個外植體，重復3次，30 d后統(tǒng)計各處理的芽誘導率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

將前期誘導獲得的幼苗進行增殖培養(yǎng)，以MS為基本培養(yǎng)基，內附加不同濃度的6-BA（0.50 mg·L-1、0.75 mg·L-1、1.00 mg·L-1）和 IBA（0.30 mg·L-1、0.50 mg·L-1），每個處理接種30個外植體，重復3次，30 d后統(tǒng)計各處理芽的增殖系數(shù)和平均芽高。

1.2.4 愈傷組織的誘導

選取長勢一致的組培苗，用剪刀將葉片剪成大小約0.5 cm2，遠軸面朝上接種在培養(yǎng)基上，以MS為基本培養(yǎng)基，設置附加2,4-D與6-BA的組合和6-BA與NAA組合的8個處理，見表1，每個組合接種10瓶，從中選取最優(yōu)的愈傷組織誘導組合，設置不同的暗培養(yǎng)天數(shù)（0 d、7 d、14 d、21 d、28 d），統(tǒng)計愈傷組織誘導情況。

表1 蘋果‘T337’葉片愈傷組織誘導組合

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft office Excel 2010和DPS 7.05統(tǒng)計軟件進行方差分析和Duncan多重比較分析差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同外植體類型及消毒時間對‘T337’誘導的影響

從表2可知，隨著酒精和次氯酸鈉處理時間的延長，休眠芽和莖尖培養(yǎng)的污染率呈下降趨勢，死亡率和褐化率呈上升趨勢，污染率最高的為休眠芽酒精處理5 s，次氯酸鈉浸泡1 min，污染率為58.89%，原因可能是酒精處理時間過短未能使消毒劑次氯酸鈉充分滲入消毒造成，但休眠芽消毒褐化率整體結果較低（圖1a），且長勢較好（圖1b、圖1c）。死亡率最高的為莖尖酒精處理30 s，次氯酸鈉浸泡15 min，死亡率為64.41%，雖然其污染率較低，但同時褐化率也是最高的為70.00%（圖1d）。相比兩種外植體生長及消毒處理表現(xiàn)，以莖尖作為外植體組培時死亡率和褐化率遠高于休眠芽，且宜長愈傷組織不利于芽的誘導（圖1e、圖1f），說明休眠芽更適宜作為‘T337’組培的外植體材料，綜合比較，最優(yōu)的消毒處理方法為酒精處理5 s，次氯酸鈉處理5 min，污染率、死亡率和褐化率都相對較低。

表2 不同外植體類型及消毒時間處理下污染率、死亡率和褐化率的比較

圖1 外植體消毒試驗

2.2 不同激素配比組合對休眠芽組培誘導的影響

初代培養(yǎng)選用休眠芽作為外植體，由表3可知，當6-BA濃度為1.00 mg·L-1，NAA濃度為0.30 mg·L-1時，休眠芽誘導率最高為63.33%，休眠芽在接種6 d左右開始萌動。在空白MS培養(yǎng)基中，外植體約16 d才有萌發(fā)跡象，且萌發(fā)后長勢較弱。在同一NAA濃度下，誘導率隨著6-BA濃度的提升而逐漸下降，在同一6-BA濃度下，誘導率隨著NAA濃度的提高而整體趨向于升高?！甌337’休眠芽誘導最適宜的激素組合為6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.30 mg·L-1，其次為6-BA 1.50 mg·L-1+NAA 0.50 mg·L-1。

表3 不同激素配比對休眠芽萌動與誘導的影響

2.3 不同激素配比組合對組培苗增殖培養(yǎng)的影響

增殖試驗結果見表4，在6-BA濃度逐漸增加時，增殖系數(shù)整體呈先上升后降低的趨勢，在6-BA濃度為 0.75 mg·L-1，IBA 為 0.50 mg·L-1時增殖系數(shù)為2.60，平均芽高為2.41 cm，均達到最高值，且組培苗生長旺盛，葉片翠綠(圖2a)，其增殖系數(shù)除了與6-BA 0.50 mg·L-1+IBA 0.30 mg·L-1(圖2b)激素組合無顯著差異外，均顯著高于其他濃度處理；平均芽高除了與 6-BA 0.75 mg·L-1+IBA 0.30 mg·L-1激素組合無顯著差異外(圖2c)，均顯著高于其他濃度處理。綜合考慮，適宜‘T337’增殖培養(yǎng)的6-BA添加量為0.75 mg·L-1，IBA添加量為0.50 mg·L-1，其生長狀態(tài)最理想。

圖2 組培苗增殖試驗

表4 不同激素配比對組培苗從生芽誘導的影響

2.4 不同處理對愈傷組織形成的影響

2.4.1 不同激素處理對‘T337’葉片愈傷組織形成的影響

由表5可知，含有2,4-D激素的組合(圖3a～圖3d)，除了處理1外均能高效地誘導愈傷組織，且愈傷組織發(fā)生較快，最快的為7天，愈傷組織特征均較為致密，且誘導率隨著6-BA濃度的上升而增加。含有6-BA和NAA的組合(圖3e～圖3h)，誘導的愈傷組織整體較疏松，愈傷開始發(fā)生的時間也較晚，在6-BA濃度加倍情況下，愈傷組織也能比較有效地形成，但顏色和質地較含有2,4-D的組合差，且各處理間愈傷形成差異較大。說明愈傷組織的形成在2,4-D和NAA一定范圍濃度下可以產(chǎn)生類似的組織，而在僅使用6-BA和NAA時愈傷組織形成會較明顯受到濃度變化的影響。綜上，最佳的激素組合為處理4，愈傷組織發(fā)生時間為7 d，誘導率為69.33%

表5 不同激素配比對葉片愈傷組織形成的影響

圖3 葉片愈傷組織誘導試驗

2.4.2 不同暗培養(yǎng)天數(shù)對愈傷組織形成的影響

選取最優(yōu)的愈傷組織誘導組合2,4-D 2.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1的培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)。由表6可知，全光照培養(yǎng)條件下基本無愈傷組織形成，且形成的少數(shù)愈傷組織質地較差，最終會逐漸變褐死亡。最佳的暗培養(yǎng)天數(shù)以7～14 d為宜，形成的愈傷組織轉入光照培養(yǎng)后增殖速度快，顏色鮮艷有光澤；若超過14 d暗培養(yǎng)時間，愈傷組織增殖速度慢，且逐漸呈灰白色、底部變褐。因此說明‘T337’葉片愈傷組織的誘導需要7～14 d的黑暗條件來啟動，而后應盡快轉入光照條件下進行后續(xù)的生長分化。

表6 不同暗培養(yǎng)天數(shù)對愈傷組織形成的影響

3 討論

蘋果組織培養(yǎng)過程中外植體的建立尤為重要，選取合適的外植體類型直接影響無菌苗的獲取效率。理論上植物細胞具有全能性，任一部位都能誘導出完整的植株，但各個部位所誘導的結果存在差異［13］。在以往有關‘T337’組培誘導的研究中外植體材料均為莖段和莖尖［7,9］，以休眠芽為外植體的研究在果樹中報道較少，在有關柿［14-15］的組織培養(yǎng)中也少有報道。通過對比莖尖和休眠芽兩種外植體消毒結果，說明休眠芽更適合作為外植體材料，進行二次消毒的方法能有效避免將莖尖作為外植體時褐化率過高，同時使死亡率和污染率保持較低水平。另外，消毒時間直接影響外植體的建立，同屬不同種的不同外植體器官所需消毒時間也存在一定的差異，本試驗表明隨著消毒時間的延長，外植體組織所受毒害越重［16］，褐化率死亡率越高，造成誘導效果不理想的結果與成思瓊等［7］對‘T337’的消毒試驗研究結果一致。

在外植體啟動階段，植物外植體生長發(fā)育情況受到不同植物生長調節(jié)劑種類、配比和濃度的影響［17］，試驗在同一NAA濃度下，隨著6-BA濃度的增加，誘導率逐漸降低，在6-BA濃度為1.00 mg·L-1時，其誘導率最高，這與馬榮群等［18］研究結果一致，在啟動培養(yǎng)基中添加6-BA1.00 mg·L-1和NAA0.01 mg·L-1的萌芽誘導效果較好。在增殖培養(yǎng)中，增殖系數(shù)是衡量增殖效果的重要指標，成思瓊等［7］和韓秀清［9］對‘T337’繼代培養(yǎng)研究表明，6-BA和IBA濃度在0.50～0.75 mg·L-1之間增殖系數(shù)和平均芽高均保持較高水平，本研究與其結果相似。在培養(yǎng)基上添加不同濃度的6-BA、NAA和IBA來觀察外植體啟動誘導和增殖培養(yǎng)的變化，為優(yōu)化‘T337’組織培養(yǎng)方法和再生體系提供理論基礎，但其他種類和濃度的植物生長調節(jié)劑對‘T337’組織培養(yǎng)誘導體系的影響和作用有待進一步深入研究。

葉片愈傷組織的誘導中通過不同配比及濃度的外源激素能夠獲得目標所需且質地優(yōu)良的類型，高兵等［19］在“嘎拉”蘋果葉片愈傷組織誘導中發(fā)現(xiàn)含2,4-D的組合都能比較高效地誘導愈傷組織的形成，但隨著2,4-D濃度的變化，愈傷組織的特征變化也較大，這與本試驗結果存在部分差異，可能是由于基因型不同產(chǎn)生愈傷組織形態(tài)特征及所需的激素種類和濃度也存在差異。外界環(huán)境因素，如溫光等都能夠明顯影響蘋果植株組織培養(yǎng)的過程，而其中暗培養(yǎng)是誘導葉片愈傷形成的關鍵步驟之一。王瑞敏等［20］對‘高原之火’北美海棠的葉片進行愈傷誘導發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)下葉片無愈傷產(chǎn)生，而轉入暗培養(yǎng)第7 d可誘導出生活力旺盛的幼嫩白色愈傷，至15 d時大量的愈傷組織長出。本試驗完全光照培養(yǎng)的葉片愈傷組織誘導率極低，而經(jīng)過7～14 d暗培養(yǎng)形成的愈傷組織轉入光照培養(yǎng)后增殖速度快，顏色鮮艷有光澤，說明適宜天數(shù)的黑暗條件能夠有效地誘導出愈傷組織。這與孫克聰［10］的研究結果一致，‘T337’葉片愈傷組織誘導需要暗培養(yǎng)天數(shù)為14 d。崔美等［21］在‘國光’‘富士’蘋果葉片愈傷組織誘導及達克東等［22］在‘千秋’蘋果葉片愈傷組織誘導上均有同樣的結論。目前關于蘋果矮化砧‘T337’組培快繁的研究較少，葉片愈傷組織的誘導及再生體系的構建有待進一步地深入研究。

4 結論

本試驗結論表明，‘T337’最佳外植體類型為休眠芽，且采取二次消毒，先用75%酒精處理30 s，2%次氯酸鈉處理10 min，然后二次消毒為75%酒精處理5 s，1%次氯酸鈉處理5 min。最適宜的啟動誘導激素組合為 6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.30 mg·L-1，在第6 d芽就開始萌發(fā)，誘導率高達63.33%。增殖培養(yǎng)在6-BA 0.75 mg·L-1+IBA 0.50 mg·L-1培養(yǎng)基中增殖數(shù)最多為2.60且平均芽高最高為2.41 cm。葉片愈傷組織的誘導在含有2,4-D的培養(yǎng)基中誘導的愈傷組織較致密且生長較快，激素組合為2,4-D 2.00 mg·L-1+6-BA 0.50 mg·L-1時愈傷組織誘導率最高為69.33%，暗培養(yǎng)最佳時間為7～14 d。