王海濤，宛柏杰，董 巖，王 滿，徐秋芳,3，周益軍

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-國家重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014；2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城 224002；3.江蘇大學生命科學研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

水稻黑條矮縮病是由呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus）中的成員水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）侵染引起的一種病害[1-3]。RBSDV除可侵染水稻外，還可以侵染小麥、玉米、大麥、燕麥和高粱等禾本科作物，是制約東亞地區(qū)糧食生產(chǎn)的重要植物病毒[1,3]。RBSDV基因組由10條線性雙鏈RNA組成，可編碼6個結構蛋白和7個非結構蛋白[4]。其中，由基因S10編碼的P10是病毒主要的外層衣殼蛋白[5]。RBSDV主要由介體灰飛虱（Laodelphax striatellusFallén）以持久性、增殖型的方式進行傳播，侵染引起水稻植株矮縮、葉片濃綠僵直、不抽穗或穗小，在葉背和莖基部有白色至褐色瘤狀突起[1]。

由病原微生物侵染引起的植物體內(nèi)激素的變化，可以促進或抑制病原物對植物的侵染，使植物表現(xiàn)出更為嚴重或變輕的病癥[6-7]。水稻受病毒侵染后通常表現(xiàn)為植株矮小，但仍可進行分蘗，可能與水稻體內(nèi)激素水平的改變有關。目前，關于RBSDV侵染水稻后如何調(diào)控植株內(nèi)源激素相關的信號通路，進而影響其侵染的報道已較為詳細，如：RBSDV的侵染可以激活水稻茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號通路，抑制其油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BRs）途徑，進而抑制病毒對水稻的侵染[8]；RBSDV侵染水稻后引起脫落酸（abscisic acid，ABA）含量的增加，進而通過抑制JA信號途徑調(diào)節(jié)水稻內(nèi)活性氧水平來負調(diào)控水稻對RBSDV的防御[9-10]；抑制生長素（auxin）信號，可以促進水稻對RBSDV的敏感性，導致更為嚴重矮化的癥狀[11]；等等。然而目前仍有一些基礎問題尚不明確，如關于水稻黑條矮縮病毒在水稻不同分蘗內(nèi)的絕對含量仍不清楚。此外，病株不同分蘗上介體灰飛虱的獲毒性差異亦不明確。為此，本研究擬測定水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)及根部的病毒含量，旨在更進一步增強對RBSDV侵染水稻的認識，為研究因病毒侵染而引起的植物生理學上的變化奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

灰飛虱采集自江蘇省海安市水稻田（119.02°E、33.62°N），經(jīng)篩選后長期飼養(yǎng)于實驗室。RBSDV水稻病株由帶毒灰飛虱傳毒獲得，長期保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植保所實驗室。接種水稻為遲熟中粳淮稻5號，該品種高感水稻黑條矮縮病?；绎w虱常規(guī)飼養(yǎng)選用遲熟中粳武育粳3號水稻苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰飛虱的飼毒及傳毒。將2齡期無毒灰飛虱若蟲在清洗干凈的RBSDV水稻上飼喂2 d，后轉(zhuǎn)移至健康無毒的武育粳3號水稻苗上飼養(yǎng)12 d，隨后采用Elisa方法對灰飛虱帶毒率進行檢測。按每棵苗2頭的有效接種蟲量，將體內(nèi)RBSDV度過循回期的灰飛虱接種到淮稻5號幼苗上。以無毒灰飛虱接種淮稻5號作為對照處理。接種3 d后，將水稻苗種植于田間水泥池內(nèi)，記錄種植日期，噴施吡蟲啉，覆蓋防蟲網(wǎng)。

1.2.2 總RNA的提取。接種RBSDV 40 d后，取RBSDV侵染的水稻病株5株，根據(jù)分蘗數(shù)量，莖葉部 分 別 標 記 為RB1-L1至RB1-L5、RB2-L1至RB2-L6、RB3-L1至RB3-L5、RB4-L1至RB4-L5、RB5-L1至RB5-L5；根部分別對應標記為RB1-R、RB2-R、RB3-R、RB4-R和RB5-R。根據(jù)TaKaRa公司RNAiso Plus（9109）試劑說明書提取樣品總RNA，利用NanoDrop 2000（Eppendorf）分光光度計測定RNA濃度，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成及熒光定量PCR。參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑（RR047A）使用說明書合成水稻及灰飛虱cDNA。設計RBSDV外殼蛋白P10基因部分序列PCR引物（F端引物：CATTGTCAAATCGCCCCACG，R端引物：TACCGCGCTCCAAGTTTGTT）對RBSDV毒株帶毒率進行分析。以RBSDV水稻不同分蘗的cDNA為模板，利用RBSDV-P10定量特異性PCR引物[12]（F端引物：GCCCCACGTTGCATCTTC，R端引物：TGTTGGGCAAAGTGCTAGTTTC），參照TaKaRa公司熒光定量試劑（RR066A）說明書，配制20μL反應體系，在IQTM5熒光定量PCR儀內(nèi)進行3步法PCR反應。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均利用SPSS 19.0進行分析。多組數(shù)據(jù)間采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)間采用t檢驗進行差異性統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 水稻黑條矮縮病株的分蘗數(shù)

將接種了RBSDV的淮稻5號水稻種植于田間水泥池內(nèi)，40 d后各取5株無毒灰飛虱接種的水稻及表現(xiàn)出典型RBSDV病害癥狀的水稻（圖1-A），利用RBSDV特異性引物進行PCR檢測。結果顯示，與對照相比，在表現(xiàn)出典型RBSDV病害癥狀的水稻內(nèi)可以檢測到1條清晰的條帶，表明RBSDV成功侵染水稻（圖1-B）。

圖1 RBSDV侵染水稻后的癥狀及PCR檢測

接著，對RBSDV侵染40 d后水稻的分蘗數(shù)進行分析，每組3株，各處理取5組。t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染后水稻分蘗數(shù)沒有顯著性差異（表1），表明RBSDV侵染后對水稻的分蘗數(shù)無影響。

表1 相同生育期內(nèi)健康水稻和RBSDV水稻分蘗數(shù)

2.2 標準曲線的制定

為明確水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)病毒的絕對含量，本研究首先將RBSDV外殼蛋白P10基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）克隆至pEASY-Blunt Zero載體（全式金公司），篩選后將陽性克隆送至生物公司測序，取測序正確、無突變的質(zhì)粒（質(zhì)量濃度為358 ng/μL），將該質(zhì)粒稀釋為6個濃度梯度（358×10-3、358×10-4、358×10-5、358×10-6、358×10-7、358×10-8ng/μL），以不同濃度的質(zhì)粒為模板進行熒光定量PCR，獲得不同濃度對應的Ct值（表2）。以質(zhì)粒濃度為橫坐標，Ct值為縱坐標，獲得標準曲線：y=-3.374 9x+33.622，其中相關系數(shù)R2=0.995，且當x=0時，Ct值為33.622，表明該標準曲線較合理，可以滿足后續(xù)試驗（圖2）。根據(jù)以下公式計算不同濃度質(zhì)粒對應的絕對含量（表2）：

表2 不同稀釋倍數(shù)對應的Ct值

圖2 根據(jù)稀釋倍數(shù)和Ct值制定的標準曲線

2.3 水稻黑條矮縮病株中不同分蘗內(nèi)病毒的絕對定量

選取RBSDV病株不同分蘗的部分葉部和莖部（標記為L）、根部（標記為R）（圖3），根據(jù)熒光定量PCR得到的Ct值，結合絕對定量計算公式和標準曲線公式，計算出各病株不同分蘗內(nèi)及根部病毒的絕對含量（表3）。

圖3 RBSDV水稻病株分蘗數(shù)標記及取樣部位

利用單因素方差分析，對各病株平均病毒含量進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，接種RBSDV 40 d后，5棵RBSDV病株的平均病毒含量無顯著性差異（3.83×105±1.48×105、4.23×105±9.15×104、4.17×105±1.50×105、6.28×105±1.89×105、3.41×105±1.23×105，均在105個copy/μg RNA），該結果表明同批次RBSDV的接種效率基本一致，對后續(xù)開展飼毒試驗的影響較小。5棵病株不同分蘗內(nèi)的病毒絕對滴度在104～106個copy/μgRNA，表明病毒在不同分蘗內(nèi)存在一定的侵染差異，其中一級分蘗（L3）內(nèi)的病毒含量（1.59×105±2.56×104copy/μgRNA）顯著低于整株病毒含量的平均值（4.38×105±6.39×104copy/μg RNA）（P=0.000 78），該結果表明病毒更容易在側(cè)分蘗內(nèi)積累，導致分蘗更矮。此外，從表3中可以得出，RBSDV侵染水稻后，利用獨立樣本t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，病毒在水稻根部的絕對含量（7.83×105±1.36×105copy/μgRNA）顯著高于莖葉部的病毒含量（3.71×105±5.39×104copy/μgRNA）（P=0.035）。

表3 水稻黑條矮縮病株不同分蘗內(nèi)病毒的絕對含量

3 討論與結論

截至目前，我國先后報道了11種水稻病毒病[13]，它們在不同時期對我國的糧食生產(chǎn)帶來了巨大的威脅。其中，有10種病毒由介體飛虱或葉蟬以持久增殖型的方式進行傳播，6種來自于呼腸孤病毒科，2種來自于彈狀病毒科，2種來自于白細病毒科。在這11種水稻病毒中，有8種侵染水稻后出現(xiàn)典型的矮化癥狀。研究表明，病毒侵染后引起植物內(nèi)源激素發(fā)生變化，進而促進病毒侵染，導致植株矮化，如水稻矮縮病毒（rice dwarf virus，RDV）的結構蛋白P2與赤霉素合成關鍵蛋白貝殼杉烯氧化酶互作，抑制赤霉素的合成從而導致植物矮縮[14]。部分病毒侵染后引起水稻分蘗增多，如由水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）引起的水稻草矮病，病株分蘗急劇增多，呈雜草狀。有研究報道RGSV侵染后引起的分蘗增多可能與獨腳金內(nèi)酯（strigolactones，SL）和生長素（indoleacetic acid，IAA）等激素變化相關[15-16]，然而目前關于RGSV分蘗增多的具體的機制仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與無毒灰飛虱接種后的水稻相比，RBSDV侵染淮稻5號40 d后，水稻分蘗數(shù)沒有明顯增多或減少，推測RBSDV侵染水稻后未引起SL的變化。

接種RBSDV 40 d后，水稻植株明顯矮縮。通過計算發(fā)現(xiàn)，隨機5棵RBSDV病株內(nèi)病毒含量基本一致，表明同一批次接種RBSDV的效率相對一致，該結果對后續(xù)開展水稻黑條矮縮病的抗性鑒定、介體灰飛虱與病毒的互作研究具有一定的指導意義。病株不同分蘗內(nèi)病毒的絕對滴度存在一定差異，其中一級分蘗內(nèi)的病毒含量顯著低于整株的病毒含量，病毒在水稻不同分蘗內(nèi)積累的機制值得深入探究。水稻分蘗的產(chǎn)生過程包括分蘗芽的形成以及分蘗芽的伸長[17]，RBSDV如何侵染分蘗芽，以及在何時侵染新生分蘗組織尚不清楚。水稻分蘗芽頂端分生組織是否具有干細胞重要調(diào)節(jié)因子WUSCHEL（WUS）[18]，進而抑制病毒對分生組織的侵染，也值得進一步深入研究。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染水稻后，病毒在根部的絕對含量高于整株的平均病毒含量，推測RBSDV從莖葉部轉(zhuǎn)移至根部后，更容易在水稻根部復制和增殖，然而這其中的機制尚不明確。中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）僅可在相對低溫時成功侵染煙草，而在24℃卻不能侵染；Andika等研究發(fā)現(xiàn)，沉默煙草根部特異表達的RNA依賴的RNA聚合酶（NbRDR6）后，僅可以在根部檢測到CWMV，且NbRDR6可以抑制CWMV的積累以及抑制病毒源小RNA的產(chǎn)生[19]。RBSDV侵染水稻后根部的某些基因是否被誘導，進而有利于病毒的侵染，值得進一步探究。植物根部通常位于地表下面，負責吸收土壤中的水分和無機鹽，具有支持、繁殖、貯存合成有機物的作用，大量病毒在根細胞內(nèi)積累勢必會引起根發(fā)生一系列的生理變化。然而RBSDV如何影響水稻根部正常的生理功能，進而影響水稻的生育周期，目前仍不清楚。本研究揭示了RBSDV在水稻不同分蘗及根部的絕對滴度，可以加深人們對RBSDV侵染水稻的認識，有望為研究病毒與寄主植物的互作提供一定的理論依據(jù)。