馮云奎，王健，馬金亮，張柳明，李擁軍

揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009

0 引言

【研究意義】長江三角洲白山羊，是國內(nèi)外唯一能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)筆料毛的山羊品種，其頸脊部產(chǎn)出的毛發(fā)具有“毛色潔白、挺直有峰、彈性好”等優(yōu)良性狀，為制作高檔毛筆的獨(dú)特原料[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】毛發(fā)生長與毛囊發(fā)育之間存在著密切聯(lián)系，毛囊生長發(fā)育不僅僅影響著絨毛的生長，而且也影響著絨毛的質(zhì)量[3]。毛囊發(fā)育為一個循環(huán)的生物系統(tǒng)，包括生長期，退行期和休止期三個階段，并涉及基因調(diào)控的動態(tài)變化[4]。課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序篩選出促分裂原活化蛋白激酶的激酶 1（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1, MAP3K1），它是與優(yōu)質(zhì)筆料毛性狀相關(guān)的候選基因之一，在優(yōu)質(zhì)筆料毛中RPKM（reads per kilobase per million reads）值為8.7731，在非優(yōu)質(zhì)筆料毛個體中RPKM值僅為0.0345，log2Fold Change值為7.49[5]。MAP3K1，又稱MEKK1，是MAPK信號通路中的重要調(diào)控因子。已有的研究發(fā)現(xiàn)，MAP3K1除了參與免疫機(jī)制，損傷修復(fù)，腫瘤進(jìn)展和骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控外，還在毛發(fā)形成方面起著至關(guān)重要的作用[6]。microRNA 是一種短鏈（20—24 nt）非編碼 RNA，通過與靶基因的mRNA 3′UTR結(jié)合[7-8]進(jìn)而降解或抑制靶基因表達(dá)[9]。miRNAs參與多種生理進(jìn)程，包括組織發(fā)育、器官形成、細(xì)胞生長和凋亡等過程[10-12]。迄今為止，在毛囊發(fā)育過程中鑒定出許多 miRNAs，如 miR-203[13]、miR-let-7a[14]和 miR-196a[15]等對于調(diào)節(jié)毛囊的發(fā)育和再生至關(guān)重要。已有的研究指出，miR-31-5p是與腫瘤相關(guān)的miRNA，miR-31-5p在大腸癌、口腔癌、結(jié)腸腺癌中通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲等過程[7,16-17]，也有相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí) miR-31參與皮膚組織修復(fù)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、傷口愈合等[18]。最近研究表明，miR-31-5p可與RAS p21蛋白激活劑1（RAS p21 protein activator 1, RASA1）的3′UTR結(jié)合，RASA1是RAS / MAPK信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，然后激活RAS / MAPK（小鼠皮膚組織中的ERK1 / 2）通路，促進(jìn)細(xì)胞存活[19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于miR-31-5p在長江三角洲白山羊優(yōu)質(zhì)筆料毛形成過程中的作用和調(diào)控機(jī)制以及在毛囊干細(xì)胞中的功能知之甚少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過驗(yàn)證 miR-31-5p是否直接靶向 RASA1影響MAP3K1，進(jìn)而激活MAPK信號通路，然后調(diào)節(jié)長江三角白山羊優(yōu)質(zhì)筆料毛的形成，為長江三角洲白山羊的分子選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究于2019年6月至2020年9月在江蘇省揚(yáng)州大學(xué)動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)所用毛囊干細(xì)胞分離自江蘇海門種羊場120日胎齡的胎羊頸脊部皮膚組織樣，經(jīng)生理鹽水沖洗3次，75%酒精沖洗3次后，置于DMEM培養(yǎng)液中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步分離操作。

分離試驗(yàn)操作簡要如下：

1）用手術(shù)刀片將組織分割成2×2 mm2的組織塊，加入0.25%胰酶沒過組織塊，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱90 min。加入含 10%胎牛血清培養(yǎng)液替換胰酶消化液，在體視顯微鏡下使用外科神經(jīng)鑷從組織塊中挑出毛囊，并置于培養(yǎng)液中。

2）當(dāng)收集到肉眼可見的米粒大小時，1 200 r/min離心5 min棄上清，加入0.25%胰酶，37℃消化30 min，1 200 r/min 離心5 min棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，勻漿器勻漿后，過200目細(xì)胞篩，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后換液并觀察[20]。

1.1.2 主要儀器與試劑 主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；實(shí)時熒光定量PCR儀（美國 ABI 7500/7500 FAST）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司）；臺式高速離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）；微量紫外可見光度計（美國Thermo Scientific公司）多模式微孔板檢測系統(tǒng)（美國Perkinelmer公司）；流式細(xì)胞儀（中國貝克曼公司，細(xì)胞凋亡用）；FACSAria SORP流式細(xì)胞儀（美國BD公司，細(xì)胞周期用）。

主要試劑：Cell counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（日本同仁公司）；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（廣東銳博生物科技有限公司）；Trizol試劑盒、DNA限制性內(nèi)切酶（Hind Ⅲ、XbaⅠ、XhoⅠ和NotⅠ）、DNA連接酶（日本TaKaRa公司）；反轉(zhuǎn)錄和PCR熒光定量試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；Opti-MEM 培養(yǎng)液（美國 Gibco公司）；Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；試驗(yàn)所用抗體如下，英國Abcam公司：PCNA（29 kDa，稀釋比例 1∶1000），CDK1（34 kDa，稀釋比例 1∶1000），CCND2（33 kDa，稀釋比例 1∶1000）， Bax（21 kDa，稀釋比例1∶5000），β-actin（42 kDa，稀釋比例1∶500）；Bcl-2（26 kDa，稀釋比例 1∶1000，美國Proteintech公司）；MAP3K1（164 kDa，稀釋比例1∶1000，北京Bioss公司）；RASA1（110 kDa，稀釋比例 1∶2000，美國 Affbiotech公司）；二抗兔抗羊與羊抗兔抗體（稀釋比例1∶5000，南京Bioworld公司）；脫脂奶粉（上海生工生物工程公司）；蛋白Maker（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1×TBST緩沖液的配制：取50 mL 20×TBS（北京索萊寶公司），1 mL Tween-20（美國Diamond公司）加入1 L容量瓶中，超純水定容至1 L；8%分離膠配制（5 mL體系）：2.3 mL超純水，1.3 mL 30% Arc-Bis，1.3 mL 1.5 mol·L-1Tris-HCl，50 μL 10% SDS，50 μL 10% APS，3 μL 四甲基乙二胺；5%濃縮膠配制（5 mL體系）：3.4 mL超純水，0.83 mL 30%Arc-Bis，0.63 mL 1.0 mol·L-1Tris-HCl，50 μL 10% SDS，50 μL 10% APS，5 μL 四甲基乙二胺。

1.2 方法

1.2.1 與MAP3K1相作用的microRNAs的預(yù)測 利用生物信息學(xué)軟件 StrBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）、miRDB（http://mirdb.org/index.html）、TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72）和miR-Walk[21]（http://mirwalk.umm. uni-heidelberg.de/）、DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）、KEGG（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、RNA hybrid（https://bibiserv.cebitec.uni- bielefeld.de/rnahybrid/）預(yù)測與MAP3K1具有靶向關(guān)系的miRNAs，利用在線網(wǎng)站Venny 2.1繪制韋恩圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），進(jìn)一步篩選與MAP3K1相關(guān)的miRNA。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù) NCBI核酸數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）中公布的山羊MAP3K1（登錄號：XM_018065623.1）和RASA1（登錄號：XM_013965775.2）的mRNA序列，通過Primer 5.0 設(shè)計山羊MAP3K1-CDS區(qū)、RASA1- CDS區(qū)定量引物和MAP3K1-3′UTR、RASA1-3′UTR 引物。miR-31-5p引物采用莖環(huán)法設(shè)計，以 18S rRNA為miRNA內(nèi)參基因，GAPDH為基因內(nèi)參。引物及Mut-MAP3K1由上海生物工程股份有限公司合成。定量引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qPCR

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 按照DNA提取試劑盒說明書提取毛囊干細(xì)胞DNA，通過微量紫外可見光度計測定DNA的質(zhì)量和濃度。以DNA為模板，對miR-31-5p前體、MAP3K1-3′UTR和RASA1-3′UTR序列進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建載體引物序列見表2。MAP3K13′UTR突變型位點(diǎn)序列由TCTTGCCA 突變?yōu)?AGAACGGT，RASA1 3′UTR 突變型位點(diǎn)序列由 TCTTGCCA 突變?yōu)镚AGGTATA。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物分別通過Hind Ⅲ和Xba I、Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，之后通過T4連接酶連接到pcDNA 3.1(+)或psiCHECK2.0載體上，形成重組質(zhì)粒，將成功連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至Trans 5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱12—16 h。挑選酶連成功菌液，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序鑒定成功的重組質(zhì)粒分別命名為 Wild-MAP3K1、Wild-RASA1、Mut-RASA1、pre-miR-31-5p，其中Mut-MAP3K1由生工生物工程合成。

表2 構(gòu)建載體的引物序列Table 2 Primer sequences used in plasmid construction

將毛囊干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)到 60%—70%時，更換 Opti-MEM 培養(yǎng)液，使用Lipofectamine 3000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，每次試驗(yàn)至少設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞總RNA或蛋白。

計算機(jī)信息化教育已經(jīng)在我國初步發(fā)展起來，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。要想深化計算機(jī)信息化教育，我們的政府應(yīng)該詳細(xì)制定相關(guān)的政策并加強(qiáng)引導(dǎo)，支持建立專業(yè)計算機(jī)信息化教育機(jī)構(gòu)；學(xué)校與企業(yè)之間應(yīng)該加強(qiáng)合作；教師更應(yīng)該轉(zhuǎn)變現(xiàn)有的觀念，加強(qiáng)計算機(jī)信息化學(xué)習(xí)，改變教學(xué)方式。相信在不遠(yuǎn)的將來，計算機(jī)信息化教育必將成為我國教育的主流模式，提供更多的專業(yè)人才，使中國在世界科技之林中立于不敗的位置。

1.2.4 qPCR 與Western blot檢測相關(guān)基因表達(dá)水平將 1 μg總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，反應(yīng)體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各 0.6 μL，ddH2O 3.2 μL ，cDNA 0.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊筋A(yù)變性95℃ 30 s；第二步循環(huán)反應(yīng)95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)；第三步融解曲線 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。利用 2-ΔΔCt方法[22]計算相關(guān)基因的表達(dá)水平。

毛囊干細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后更換細(xì)胞生長液，培養(yǎng)48 h后參照高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液（索萊寶）說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定不同組間蛋白濃度，將上述蛋白樣品與 6×loading Buffer以5∶1比例混合，98℃變性10 min，每孔上樣量20 μg，經(jīng)割膠，轉(zhuǎn)膜（電流設(shè)置為300 mA，PCNA、CDK1、CCND2、Bax、Bcl-2、β-actin，轉(zhuǎn)膜時40 min；MAP3K1轉(zhuǎn)膜時長180 min；RASA1轉(zhuǎn)膜時長120 min）等步驟后，用含5%的脫脂奶粉的1×TBST封閉1 h，隨后一抗孵育過夜，1×TBST緩沖液潤洗3次，每次10 min；二抗孵育1 h，1×TBST緩沖液潤洗3次，每次10 min。用BIO-RAD顯影，Image Lab 分析蛋白灰度值。

1.2.5 CCK-8 與 EdU法檢測山羊毛囊干細(xì)胞增殖水平 將1×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔添加100 μL培養(yǎng)基，每組9個重復(fù)。37℃ 5% CO2培養(yǎng)，24 h后轉(zhuǎn)染，48 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔添加10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h用多模式微孔板檢測系統(tǒng)檢測450 nm處OD值。

取1×105個對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每組3個獨(dú)立重復(fù)。根據(jù)EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書，轉(zhuǎn)染6 h后，換成含有10 μmol·L-1EdU細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換細(xì)胞生長液，48 h之后進(jìn)行細(xì)胞固定、Apollo染色和 DNA染色。染色完成后立即使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀測，Image J軟件分析熒光圖片。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期與凋亡 細(xì)胞周期檢測：取1×106個對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，24 h進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)胰酶消化后收集到離心管中，室溫1 500 r/min，離心5 min，去上清，加入1 mL提前4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心去上清；在樣品管中加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，輕吹混勻，4℃固定24 h；4℃ 1 500 r/min 離心5 min去上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心去上清；根據(jù)樣品數(shù)量配制碘化丙啶染色液，每管細(xì)胞樣品加入500 μL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞，37℃避光孵育 30 min，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果使用Flowjo軟件分析。

細(xì)胞凋亡檢測：取1×106個對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，同期培養(yǎng)3個中皿用做流式細(xì)胞儀調(diào)節(jié)電壓（空白組，單染FITC，單染PI），24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞生長至48 h，把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管中，使用37℃預(yù)熱的PBS潤洗細(xì)胞一次，加入適量胰酶消化細(xì)胞 3 min，加入上步吸出的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1 500 r/min 離心5 min棄上清，用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)；取5—10萬重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入 5 μL Annexin V-FITC，輕吹混勻；加入 10 μL碘化丙啶染色液，輕吹混勻；室溫避光孵育 10—20 min，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果使用CytExpert軟件分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告試驗(yàn) 將HEK293T細(xì)胞接種在24孔板中，待細(xì)胞生長密度至60%—70%時，對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。試驗(yàn)分為2組，每組3個重復(fù)。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)ild-MAP3K1 3′UTR載體與pre-miR-31-5p，Wild-RASA1 3′UTR載體與pre-miR-31-5p為過表達(dá)組；共轉(zhuǎn)染W(wǎng)ild-MAP3K1 3′UTR載體與pcDNA 3.1 (+) ，Wild-RASA1 3′UTR 載體與 pcDNA 3.1 (+)為 Control組。轉(zhuǎn)染48 h后，使用試劑盒檢測熒光素酶的相對活性。

2 結(jié)果

2.1 與MAP3K1具有靶向關(guān)系的miRNAs的預(yù)測

使用 StrBase、miRDB、TargetScan和 miRWalk分別預(yù)測出與MAP3K1具有靶向關(guān)系的miRNAs，經(jīng)在線網(wǎng)站對4個數(shù)據(jù)庫中預(yù)測得到的miRNAs進(jìn)行交互繪制韋恩圖[23]，如圖1所示。4個數(shù)據(jù)庫中，StrBase中共預(yù)測到 33個 miRNAs，其中只有1個在StrBase被預(yù)測到，1個與TargetScan共同被預(yù)測到，9個與 miRDB共同被預(yù)測到。miRDB中共預(yù)測到262個miRNAs與MAP3K1具有靶向關(guān)系，其中有 89個在 miRDB中單獨(dú)被預(yù)測到，4個與TargetScan共同被預(yù)測到，137個與miRWalk共同被預(yù)測到。TargetScan中共預(yù)測到79個miRNAs，其中有 67個在 TargetScan被預(yù)測到，1個與miRWalk共同被預(yù)測到。miRWalk中共預(yù)測到1 641個miRNAs，其中有1 482個在miRWalk中單獨(dú)被預(yù)測到。3個miRNAs在4個數(shù)據(jù)庫中同時被預(yù)測到，分別是miR-31-5p、miR-21-5p和miR-9-5p。從數(shù)據(jù)庫中的評分以及結(jié)合現(xiàn)有miRNAs在皮膚和毛囊上的研究，最終確定并選用 miR-31-5p作為本試驗(yàn)的研究對象。

2.2 miR-31-5p直接靶向RASA1的3′UTR，進(jìn)而上調(diào)MAP3K1

將毛囊干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分別轉(zhuǎn)染空白組（Control組）、 pcDNA 3.1 (+)、pre-miR-31-5p，48 h后提取細(xì)胞總RNA，qPCR檢測過表達(dá)效率。由圖2-A可知，與Control組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1(+)組無差異（P＞0.05），轉(zhuǎn)染pre-miR-31-5p組顯著提高miR-31-5p表達(dá)量（P＜0.01），因此后續(xù)試驗(yàn)選用Control組和pre-miR-31-5p組進(jìn)一步研究。

由雙熒光素酶報告基因結(jié)果（圖 2-B）可知，過表達(dá)miR-31-5p后MAP3K1的熒光活性高于Control組（P＜0.01）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-31-5p與MAP3K1之間的聯(lián)系，結(jié)合生物信息學(xué)分析（TargetScan,DAVID, KEGG），發(fā)現(xiàn)在MAPK信號通路的上游存在一個與 miR-31-5p具有靶向關(guān)系的抑制因子RASA1，在山羊RASA1 mRNA的 3′UTR區(qū)也有一個保守的 miR-31-5p結(jié)合位點(diǎn)。與 Wild-RASA1 3′UTR載體與pcDNA 3.1 (+)組相比，RASA1 3′UTR載體與pre-miR-31-5p共轉(zhuǎn)染組的雙熒光素酶活性極顯著降低（P＜0.01，圖2-C）。

這些初步結(jié)果表明，miR-31-5p可以直接靶向RASA1的3′UTR，而不是MAP3K1的 3′UTR。在毛囊干細(xì)胞中進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-31-5p抑制了RASA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，升高了MAP3K1 mRNA和蛋白的表達(dá)（P＜0.01，圖2-D，E，F(xiàn)）。這些試驗(yàn)結(jié)果證實(shí) RASA1是 miR-31-5p的直接靶基因，抑制RASA1可上調(diào)MAP3K1的表達(dá)水平。

2.3 過表達(dá)miR-31-5p促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖

通過CCK-8、EdU、細(xì)胞周期等試驗(yàn)來進(jìn)一步探討過表達(dá)miR-31-5p對毛囊干細(xì)胞增殖功能的影響，結(jié)果如圖 3所示。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-31-5p后，細(xì)胞活力達(dá)到 1.1，顯著高于對照組（0.8）；另外通過 EdU法檢測細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-31-5p后，細(xì)胞增殖能力顯著提高（P＜0.05）（圖3-A, B, C）。利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Control組G1/G0、S、G2/M期細(xì)胞率分別為 56.81%、12.29% 和 23.88%（圖 3-D）；pre-miR-31-5p組G1/G0、S、G2/M期細(xì)胞數(shù)量分別為52.23%、14.38%和24.87%（圖3-E）。與Control組相比，G1/G0期細(xì)胞數(shù)量極顯著下降（P＜0.01），S和 G2/M 期細(xì)胞數(shù)量上升，但不存在顯著差異（P＞0.05，圖3-F），表明過表達(dá)miR-31-5p減緩毛囊干細(xì)胞在G1期的阻滯。以上結(jié)果表明，過表達(dá)miR-31-5p能促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖。

2.4 過表達(dá)miR-31-5p抑制毛囊干細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，pre-miR-31-5p組活細(xì)胞數(shù)量（93.8%，圖4-B）相比于Control組（90.1%，圖4-A）顯著上升，而細(xì)胞總凋亡率pre-miR-31-5p組（4.9%）相較于對照組（8.41%）差異極顯著降低（P＜0.01，圖4-C），表明過表達(dá)miR-31-5p能顯著抑制毛囊干細(xì)胞凋亡。

2.5 過表達(dá) miR-31-5p對增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

以GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用qPCR技術(shù)研究過表達(dá)miR-31-5p對毛囊干細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響。由圖5-A可知，與Control組相比，pre-miR-31-5p組的增殖相關(guān)基因 PCNA、CDK1、CCND2的mRNA表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），促凋亡基因（Bax）的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），抗凋亡基因（Bcl-2）的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。

結(jié)合Western blot試驗(yàn)，以β-actin為內(nèi)參探究過表達(dá)miR-31-5p對增殖和凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)量的影響。由圖5-B可知，與Control組相比，pre-miR-31-5p組的增殖相關(guān)基因（PCNA、CDK1、CCND2）的蛋白相對表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），促凋亡基因（Bax）的相對表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），抗凋亡基因（Bcl-2）的相對表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。由此可推測，過表達(dá)miR-31-5p能促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖，抑制毛囊干細(xì)胞凋亡。

3 討論

已有研究表明毛發(fā)的生長、脫落及修復(fù)依賴于毛囊干細(xì)胞增殖、分化和遷移，且皮膚組織的結(jié)構(gòu)狀態(tài)和毛囊性狀對羊毛品質(zhì)與產(chǎn)量有較大的影響[24]。因此，關(guān)于毛囊干細(xì)胞的生物學(xué)研究逐年增多。

MAP3K1是MAPK信號通路中的核心調(diào)控因子，在細(xì)胞生理過程中（如細(xì)胞增殖、分化，遷移和凋亡）起著重要作用[25]。MAP3K1可編碼磷酸化或激活絲氨酸/蘇氨酸激酶表達(dá)的MAPK激酶，活化的MAPK激酶刺激MAPK信號通路中下游因子，如ERK，MEK，JNK等促進(jìn)細(xì)胞存活[26]。此外，MAP3K1可用作潛在的乳腺癌易感基因座，并參與乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程[27]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)MAP3K1在優(yōu)質(zhì)筆料毛的形成中起著重要作用，并且在優(yōu)質(zhì)筆料毛山羊個體頸脊部皮膚組織中表達(dá)水平更高[28]。因此，本研究深入研究了與MAP3K1相關(guān)的miRNA分子作用機(jī)制，首先通過生物信息學(xué)預(yù)測和有關(guān)皮膚及毛囊文獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可能通過靶向MAP3K1參與優(yōu)質(zhì)筆料毛的形成。雙熒光素酶報告基因試驗(yàn)，qPCR和Western Blot結(jié)果顯示，與miRNA 靶向mRNA調(diào)節(jié)機(jī)制相比[29]，過表達(dá)miR-31-5p后MAP3K1熒光素酶活性和MAP3K1表達(dá)量都顯著增加。綜合上述結(jié)果初步考慮MAP3K1并不是miR-31-5p的直接靶基因。miRNA在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)在時間和空間上會有差別，其原因可能是種屬不一，或是環(huán)境影響。為了精確識別miR-31-5p的靶基因及其與MAP3K1之間的關(guān)系，使用在線數(shù)據(jù)庫（TargetScan, KEGG, RNA hybrid），發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可以直接靶向RASA1 mRNA的3′UTR區(qū)，該基因參與MAPK信號傳導(dǎo)通路，且位于MAP3K1的上游[30]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，推測miR-31-5p可能會靶向RASA1，然后在優(yōu)質(zhì)筆料毛形成過程中上調(diào)MAP3K1的表達(dá)。qPCR和Western blot結(jié)果表明，過表達(dá)miR-31-5p后RASA1的 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，而MAP3K1表達(dá)水平顯著升高。此外，過表達(dá)miR-31-5p時，RASA1的熒光素酶活性明顯下降，而MAP3K1的熒光素酶活性則顯著高于對照組。這些結(jié)果表明，miR-31-5p可能通過靶向抑制RASA1然后上調(diào)MAP3K1表達(dá)來調(diào)節(jié)優(yōu)質(zhì)筆料毛性狀的形成。

有文獻(xiàn)指出 miR-31參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移等多種生理過程，具體如促進(jìn)胚胎著床；在成年脊椎動物中維持骨穩(wěn)態(tài)，并調(diào)節(jié)無脊椎動物胚胎的骨骼發(fā)育；在結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌、肺癌等一些癌癥中促進(jìn)癌癥進(jìn)程；還促進(jìn)經(jīng)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[31]。研究還發(fā)現(xiàn) miR-31在表皮干細(xì)胞存在的基底層有一定水平的表達(dá)[18]，在細(xì)胞損傷狀態(tài)下miR-31的表達(dá)量明顯提高，通過靶向抑制RASA1表達(dá)，激活RAS/MAPK信號通路，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌[32]、肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞[33]的癌變，炎癥反應(yīng)的發(fā)生[34]及皮膚組織的修復(fù)[18]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在長江三角洲白山羊毛囊干細(xì)胞中過表達(dá)miR-31-5p后，CCK-8與EdU結(jié)果顯示在過表達(dá)miR-31-5p組提升了細(xì)胞活力，促進(jìn)了細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31-5p后，減少了G1期細(xì)胞數(shù)量，明顯減緩了細(xì)胞G1期阻滯，S期和G2/M期雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但仍有高于對照組的趨勢。通過細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31-5p后，活細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，總凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組。另外本試驗(yàn)還通過驗(yàn)證過表達(dá)miR-31-5p后增殖與凋亡基因相關(guān)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染 miR-31-5p后促進(jìn)了增殖相關(guān)基因、抗凋亡基因的mRNA和蛋白表達(dá)，抑制了凋亡基因的mRNA和蛋白表達(dá)。這與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，馬金亮等發(fā)現(xiàn)在毛囊干細(xì)胞中干擾MAP3K1后，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[35]。近期也有文獻(xiàn)證實(shí)了在毛囊干細(xì)胞中干擾miR-31-5p后，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[36]。另有相關(guān)文獻(xiàn)指出在卵泡生長的過程中，miR-31的過表達(dá)通過靶向卵泡刺激素受體促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[37]，說明相同的miRNA在不同細(xì)胞中可能發(fā)揮不一樣的調(diào)節(jié)作用。

在本研究中過表達(dá)miR-31-5p通過靶向RASA1影響MAP3K1表達(dá)，提高增殖相關(guān)基因（PCNA，CDK1，CCND2）和抗凋亡基因（Bcl-2），降低促凋亡基因（Bax）的表達(dá)來促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖。CCK-8，EdU、細(xì)胞周期和凋亡分析等結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了過表達(dá)miR-31-5p可提高毛囊干細(xì)胞增殖能力并抑制其凋亡。結(jié)合上述結(jié)果繪制miR-31-5p在毛囊干細(xì)胞中的分子作用機(jī)制圖（圖6）。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn) miR-31-5p直接靶向 RASA1，上調(diào)MAPK信號通路中MAP3K1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)長江三角洲白山羊毛囊干細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。研究闡明了miR-31-5p參與山羊毛囊干細(xì)胞的增殖和凋亡，為探索調(diào)控長江三角洲白山羊優(yōu)質(zhì)筆料毛性狀的分子形成機(jī)制提供新的見解。