連娜琦，朱子涵，殷凡章，李文文，周喆聿，王中揚，吳 祥，李 育，卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學 1. 醫(yī)學院·整合醫(yī)學學院，2. 藥學院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由脂質(zhì)代謝紊亂等多種因素引起的血管炎性病變。流行病學研究發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期女性由于卵巢功能衰竭，體內(nèi)雌激素水平降低，導致患AS的風險急劇增加[1]。雌激素通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)發(fā)揮其生物學效應，其主要分為ERα、ERβ兩個亞型；研究表明ERα表達下降會促進AS的發(fā)生[2]。在AS早期，外周血的單核細胞在趨化因子作用下跨內(nèi)皮細胞向內(nèi)皮下遷移并分化成巨噬細胞[3]，細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異?？纱偈蛊浔硇桶l(fā)生改變，進一步引發(fā)炎癥反應，并逐步轉(zhuǎn)化為泡沫細胞[4-5]。巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[6]，其可通過血管內(nèi)微環(huán)境改變轉(zhuǎn)化成不同的表型，主要分為經(jīng)典激活的M1型和非經(jīng)典激活的M2型。M1型巨噬細胞具有促炎、促氧化應激作用，而M2型巨噬細胞能發(fā)揮抗炎和促組織修復作用[7]。丹皮酚(Paeonol)是毛茛科植物牡丹根皮和蘿藦科植物徐長卿全草的主要活性成分，具有抗炎癥反應、抗氧化應激、抗血栓形成、抗腫瘤等作用。已有研究表明丹皮酚具有減輕動脈粥樣硬化炎性損傷的作用[8-9]，但是丹皮酚對AS中巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化這一方面的研究較少。本研究利用小鼠源Raw264.7巨噬細胞復制M1極化模型，觀察丹皮酚是否通過ERα影響巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 小鼠巨噬細胞株Raw264.7由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.1.2試劑 丹皮酚(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司，150914)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB13412)、白介素10(IL-10)測定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB12344)、白介素1β(IL-1β)測定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB132112)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物公司，20151210)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物公司，ARB12843)；Arg-1抗體(北京博奧森公司，bs-23837R)；CD163抗體(北京博奧森公司，bsm-54015R)、iNOS抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；CD86抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；β-actin抗體(Bioword公司，bs-10966R)；二抗(Proteintech公司，10285-1-AP)；β-雌二醇(Sigma公司，E2758)、ERα選擇性阻斷劑MPP(Sigma公司，WAY-200070)、ERβ選擇性阻斷劑PHTPP(Sigma公司，SML1355)。

1.2 方法

1.2.1巨噬細胞培養(yǎng)和經(jīng)典活化模型的建立 將巨噬細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。根據(jù)文獻選用100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ聯(lián)用刺激巨噬細胞，復制M1極化模型[10-11]。

1.2.2活化巨噬細胞實驗分組 細胞貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為6組：對照組(control)加入DMSO(0.02%,W/V)；模型組(model)加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ；其余4組藥物干預組分別在模型組的基礎(chǔ)上加入100 nmol·L-1雌激素(E2)、30 μmol·L-1丹皮酚(Paeonol)[12]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1PHTPP[13]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1MPP[13]。細胞加入相應濃度的藥物后，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組實驗重復3次。

1.2.3ELISA法檢測巨噬細胞上清液中細胞因子的含量 選取第3～5代對數(shù)生長期的巨噬細胞，調(diào)整細胞密度為1×108·L-1，以每孔2 mL接種入6孔板中培養(yǎng)，細胞同期化后分組處理，分組與藥物干預方法同“1.2.2”，作用24 h后終止。收集培養(yǎng)上清液，3 000 r·min-1離心15 min，小心吸去上清液，按照試劑盒說明書ELISA法測定上清液中IL-10、TNF-α、IL-1β、SOD與MDA的含量。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 細胞分組和藥物干預同“1.2.2”。作用24 h后，提取細胞總蛋白并進行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。TBST洗膜，加入一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，用顯影液進行顯色反應。以β-actin為內(nèi)參，實驗均重復3次。

1.2.5shRNA干擾巨噬細胞ERα的表達 將轉(zhuǎn)染Control shRNA和ERα shRNA的細胞各分為3組，分別為：對照組加入DMSO(0.02%,W/V)、模型組加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ、丹皮酚組在預先進行極化造模(同模型組)的細胞上加入30 μmol·L-1丹皮酚。再另設一組非轉(zhuǎn)染的空白組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測巨噬細胞活化相關(guān)指標，以及提取蛋白進行Western blot實驗。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對巨噬細胞經(jīng)典活化相關(guān)細胞因子表達的影響實驗結(jié)果顯示，當巨噬細胞受到100 μg·L-1LPS及20 μg·L-1INF-γ作用后，與對照組相比抗炎細胞因子IL-10含量和SOD含量明顯降低，促炎細胞因子TNF-α和IL-1β含量增加以及MDA的含量明顯升高。在細胞造?；A(chǔ)上給予E2和丹皮酚后，與模型組相比，IL-10和SOD含量明顯升高，且TNF-α、IL-1β及MDA含量明顯降低。與此同時，丹皮酚+MPP組與模型組相比所有細胞因子均無差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比所有細胞因子表達依然有差異，說明丹皮酚對巨噬細胞因子的效應可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對丹皮酚的效應影響不明顯(Fig 1)。以上結(jié)果提示，當巨噬細胞受到LPS和IFN-γ刺激后，巨噬細胞分泌促炎因子增多并加劇氧化應激過程中的活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生，丹皮酚對其抑制作用與ERα有關(guān)。

2.2 丹皮酚對巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的影響實驗結(jié)果顯示，當巨噬細胞受到LPS及INF-γ作用后，巨噬細胞M1表型標志物iNOS、CD86的表達升高，M2表型標志物Arg-1、CD163的表達降低，與空白對照組比較差異均具有顯著性。給予E2和丹皮酚后，iNOS、CD86的表達降低，Arg-1、CD163的表達升高，與模型組比較差異均具有顯著性。同樣，丹皮酚+MPP組與模型組相比對目的蛋白的影響無差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比目的蛋白的表達存在差異，說明丹皮酚對巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白的影響可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對丹皮酚的效應影響不明顯(Fig 2)。以上結(jié)果提示，LPS和IFN-γ可誘導巨噬細胞表型向M1型轉(zhuǎn)化，丹皮酚能夠促進巨噬細胞表型從M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，此過程與ERα相關(guān)。

2.3 ERα對丹皮酚抗巨噬細胞經(jīng)典活化相關(guān)細胞因子表達的影響利用慢病毒干擾ERα的表達，進一步驗證ERα在丹皮酚對巨噬細胞經(jīng)典活化中的作用。實驗結(jié)果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對IL-10、TNF-α和IL-1β的作用。而使用慢病毒干擾ERα后，丹皮酚對巨噬細胞經(jīng)LPS+INF-γ誘導極化模型的干預作用消失，表現(xiàn)為與極化模型組相比，丹皮酚對極化模型下的IL-10、SOD、TNF-α、IL-1β和MDA的干預無明顯差異(Fig 3)。上述結(jié)果表明，丹皮酚對M1型巨噬細胞活化的抑制作用主要是通過ERα來調(diào)控的。

2.4 ERα對丹皮酚抗巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的影響首先驗證空載慢病毒對丹皮酚的作用沒有影響，然后在此基礎(chǔ)上使用慢病毒干擾ERα觀察丹皮酚對巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的調(diào)控作用是否發(fā)生改變。實驗結(jié)果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化蛋白表達的調(diào)控，具體表現(xiàn)為在control shRNA組中，丹皮酚可以明顯降低由LPS+INF-γ引起的iNOS、CD86高表達，同時明顯上調(diào)由LPS+INF-γ引起的Arg-1和CD163蛋白低表達。而在ERα shRNA組中，丹皮酚的這種調(diào)控作用明顯減弱，丹皮酚給藥組和模型組之間無差異(Fig 4)。以上結(jié)果提示，丹皮酚促進LPS和IFN-γ刺激的巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，且通過ERα介導。

Fig 1 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

Fig 2 Effects of paeonol on LPS and IFN-γ-induced expression of macrophage phenotype-related proteins in

Fig 3 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

A: level of IL-10; B: level of TNF-α; C: level of IL-1β; D: level of MDA; E:level of SOD. **P<0.01 vs Control; ##P<0.01 vs Control shRNA Model；△△P<0.01 vs ERα shRNA Model

Fig 4 Effects of paeonol on the expression of LPS and IFN-γ-induced macrophage phenotype-related protein expression after ERα shRNA

3 討論

AS所致多種心腦血管疾病是全球最大的公共衛(wèi)生問題之一，2020年死亡人數(shù)已增加至2 500萬，占全球死亡總數(shù)的1/3，嚴重威脅人類健康。研究表明，絕經(jīng)前婦女心腦血管疾病的發(fā)病率明顯低于同齡男性，而絕經(jīng)后婦女心腦血管疾病發(fā)病率明顯高于育齡婦女，更年期雌激素水平降低，雌激素受體表達異常，是更年期AS發(fā)生的病理基礎(chǔ)[14]。AS是一種慢性炎癥性病變，巨噬細胞參與了AS病理進程的多個環(huán)節(jié)，具有維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，是一種可塑性較強的多功能免疫細胞，其表型和功能隨機體組織微環(huán)境的變化而變化，繼而激活不同亞型相關(guān)聯(lián)的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮促炎或抗炎作用。越來越多證據(jù)表明，闡明巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化機制有助于為治療心血管慢性炎癥性疾病提供新策略。

丹皮酚在臨床上已用于防治AS，具有保護血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集、抗氧化、調(diào)血脂等作用。本實驗研究表明，LPS及IFN-γ誘導巨噬細胞發(fā)生氧化應激反應并分泌炎性因子，產(chǎn)生大量iNOS、TNF-α、IL-1β等，丹皮酚能抑制M1型巨噬細胞表型標志物的表達，上調(diào)M2型巨噬細胞表型標志物的表達，抑制氧化應激反應，誘導巨噬細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，此過程與ERα相關(guān)。當ERα被特異性阻斷劑或慢病毒干擾沉默后，丹皮酚的抗炎作用降低，而特異性阻斷ERβ對丹皮酚的抗炎作用沒有明顯影響。因此，丹皮酚的抗炎作用主要是通過ERα介導的。

綜上所述，丹皮酚抑制巨噬細胞經(jīng)典活化發(fā)揮抗炎抗氧化應激的作用是通過ERα介導的，有助于延緩AS的發(fā)生發(fā)展。