陳鴻鴕，宋曉飛，李曉麗，閆立英

(河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

黃瓜種子質(zhì)量的優(yōu)劣程度直接影響其品質(zhì)和產(chǎn)量。隨著市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，黃瓜新品種選育應(yīng)用取得較快進(jìn)展，因此，快速、有效的鑒定黃瓜種子的純度和真實(shí)性十分必要。DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)中，SSR標(biāo)記技術(shù)是較成熟的構(gòu)建DNA指紋圖譜的技術(shù)[1]。SSR分子標(biāo)記具有信息含量高、穩(wěn)定性好、呈共顯性遺傳和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。在糧食作物中，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)種子純度的鑒定的研究相對(duì)較多[2～5]。對(duì)果蔬的種子純度鑒定相對(duì)滯后，但近幾年，辣椒、大白菜、西瓜、甜瓜、黃瓜[9]等品種指紋圖譜的構(gòu)建也日漸增多[6～9]。任國(guó)良等[10]采用分離群體分組分析法(BSA)對(duì)黃瓜無(wú)側(cè)枝基因nlb進(jìn)行定位，利用SSR分子標(biāo)記將nlb基因定位于第1條染色體，緊密連鎖的分子標(biāo)記為SSR19673。Zhang等[11]利用SSR標(biāo)記對(duì)黃瓜自交系9110Gt和9930雜交RIL群體進(jìn)行定位，將黃瓜葉片和果實(shí)苦味基因Bi-3和Bi-1別定位在第5和第6條染色體上。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是指紋圖譜構(gòu)建和種子純度鑒定的重要手段。本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，用100對(duì)SSR引物對(duì)‘SH23’及其親本和對(duì)照品種進(jìn)行特異標(biāo)記篩選，構(gòu)建指紋圖譜，并進(jìn)行品種純度鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

以河北科技師范學(xué)院黃瓜課題組選育出的旱黃瓜優(yōu)良組合‘SH23’及其父本、母本，對(duì)照品種‘綠島7號(hào)’和山海關(guān)當(dāng)?shù)仄贩N為試材，進(jìn)行‘SH23’指紋圖譜構(gòu)建及種子純度鑒定。于2020年10月30日田間隨機(jī)選取‘SH23’100個(gè)單株，父本、母本各10份，對(duì)照品種各1份，取近生長(zhǎng)點(diǎn)處幼嫩葉片，提取基因組DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取 采用CTAB法提取黃瓜‘SH23’的父本和母本、‘SH23’100個(gè)單株、‘綠島7號(hào)’和山海關(guān)當(dāng)?shù)仄贩N新鮮健康幼嫩葉片中的基因組DNA，用10 g/L的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，使用酶標(biāo)儀(Gene Company Limied 基因有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為Sybergy HT)測(cè)定DNA濃度及OD值，并將DNA稀釋到50 mg/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增 SSR反應(yīng)體系為20 μL，包括1 μL模板DNA(50 mg/L)，10 μL 2×Taq PCR Mix(包含Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+)，7 μL ddH2O，正反向引物各1 μL。SSR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3電泳檢測(cè)及指紋圖譜構(gòu)建 采用60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 W電泳45 min后檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染顯色處理，拍照記錄結(jié)果。尋找擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性引物，根據(jù)電泳結(jié)果用0，1記錄條帶的相對(duì)位置，條帶清晰的記為1，缺失的則記為0，得出相應(yīng)的分子指紋圖譜。

1.2.4種子純度鑒定 利用篩選出的具有多態(tài)性的SSR引物對(duì)100株‘SH23’進(jìn)行種子純度鑒定，觀察帶型表現(xiàn)，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜構(gòu)建

用100對(duì)黃瓜全基因組覆蓋的SSR引物對(duì)‘SH23’及其親本和對(duì)照品種DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及電泳分離。擴(kuò)增后電泳檢測(cè)顯示100對(duì)引物中有5對(duì)引物(SSR13033，SSR02166，SSR03527，SSR14084，SSR19672)在親本間有多態(tài)性(表1)，多態(tài)性比例為5%。這 5對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶可以明確的區(qū)分出F1和親本(圖1)。

圖1 多態(tài)性引物SSR13033，SSR14084，SSR19672，SSR03527，SSR02166電泳條帶注：1為SH23，2為母本，3為父本，4為綠島7號(hào)，5為山海關(guān)當(dāng)?shù)仄贩N

表1 多態(tài)性SSR引物及其序列

這5對(duì)引物組成了‘SH23’及其親本的DNA指紋圖譜(表2)。指紋圖譜的構(gòu)建為種子純度鑒定及新品種保護(hù)提供依據(jù)。

表2 ‘SH23’及親本SSR指紋圖譜

2.2 種子純度鑒定

用引物SSR19672對(duì)隨機(jī)選取的100株F1進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果顯示，該引物在全部F1植株中均擴(kuò)增出雙親條帶的雜合帶型(圖2)。因此，SSR分子標(biāo)記鑒定表明種子純度鑒定結(jié)果為100%。

圖2 引物SSR19672對(duì)‘SH23’擴(kuò)增條帶

3 結(jié)論

目前隨著黃瓜新品種選育進(jìn)展加快，商業(yè)化品種日益增多，隨之市場(chǎng)上出現(xiàn)了很多同名異物現(xiàn)象，不僅擾亂了市場(chǎng)，也常常給育種者和種子經(jīng)營(yíng)者帶來(lái)了不利影響。分子指紋圖譜的構(gòu)建既能為品種的真?zhèn)巫龀鲨b別同時(shí)也能為黃瓜品種的登記審定提供技術(shù)支持。另外，常規(guī)種子純度鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易受環(huán)境、時(shí)間條件影響，DNA分子標(biāo)記鑒定的方法省時(shí)省力、多態(tài)性水平高。

本次研究利用穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、簡(jiǎn)單操作的SSR分子標(biāo)記技術(shù)，用100對(duì)全基因組覆蓋的SSR引物，對(duì)新選育的黃瓜優(yōu)良組合‘SH23’及其親本、對(duì)照品種進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，結(jié)果篩選出5對(duì)(SSR13033，SSR02166，SSR03527，SSR14084，SSR19672)引物在‘SH23’和親本、對(duì)照品種間具有多態(tài)性，條帶清晰、易識(shí)別且穩(wěn)定，這5對(duì)引物組成了‘SH23’及其親本的DNA標(biāo)記指紋圖譜，能夠有效鑒別出‘SH23’和其他品種?？蔀樵撈贩N的真?zhèn)舞b別提供依據(jù)和技術(shù)支持。

利用篩選出的多態(tài)性引物SSR19672對(duì)隨機(jī)選取的100株‘SH23’植株進(jìn)行純度鑒定表明，‘SH23’的種子純度為100%。